超微量DNA模板擴(kuò)增鑒定綿羊早期胚胎性別體系優(yōu)化

陶維昆，黃 飛，劉 波，趙建清，方 翟，高慶華,3*

（1.新疆塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

哺乳動(dòng)物早期胚胎性別鑒定是實(shí)現(xiàn)性別控制的重要部分，運(yùn)用這一手段可有選擇性地確定動(dòng)物后代性別，借助胚胎移植等技術(shù)，加快家畜繁殖和新品種選育進(jìn)程，推動(dòng)胚胎商品化和畜牧業(yè)的發(fā)展。（Sex Determining Region of the Y Chromosome）基因作為Y染色體上促進(jìn)睪丸分化的主效基因，在人、豬、牛、馬、羊等哺乳動(dòng)物中意義特殊。Obuchi等、宋淑珍等在綿羊上血液淋巴細(xì)胞和肝臟組織上成功擴(kuò)增基因進(jìn)行了初步研究。呂文發(fā)等、張秀華等、馬夢婷等、孫俊麗等相繼在牛、山羊、綿羊和豬胚胎上運(yùn)用基因進(jìn)行性別鑒定并取得成效。白文林等利用基因鑒定8細(xì)胞牛胚胎性別并建立中國荷斯坦牛胚胎性別鑒定體系。SRY作為雄性單拷貝基因，具有高度保守的特性，聯(lián)合內(nèi)參基因（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase）可以更簡單直接有效地鑒定，可靠性更高，但超微量模板擴(kuò)增基因鑒定胚胎性別仍存在擴(kuò)增不穩(wěn)定，易受干擾等問題。本實(shí)驗(yàn)通過完善優(yōu)化超微量胚胎DNA鑒定綿羊胚胎性別方法體系，并借助測序技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對(duì)，保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與鑒定效率，建立穩(wěn)定體系。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DL-700 DNA marker、瓊脂糖均為TaKaRa公司產(chǎn)品；2×Ultra Taq PCR Mix DNA聚合酶、血液基因組DNA提取試劑盒為Transgen公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)（SHC-CT-22，Boxun）；體視顯微鏡（S9D，LEICA）；低溫高速冷凍離心機(jī)（3K30，Sigma）；PCR儀（C1000 BIO，RAD）；核酸測定儀（ND-One，Thermo）；恒溫水浴鍋（HHS-21-4，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；恒溫金屬浴（MINI100-C，北京佳源科儀科技有限公司）；穩(wěn)壓電泳儀（DYY-11，北京六一生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 采集公羊和母羊各3只靜脈血液，保存于抗凝管中帶回實(shí)驗(yàn)室，提取血液基因組DNA。

綿羊胚胎來自于本實(shí)驗(yàn)室體外受精培養(yǎng)獲得。卵巢采集自阿克蘇屠宰場，37℃生理鹽水中保存，3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。顯微鏡下收集高質(zhì)量卵母細(xì)胞，培養(yǎng)成熟，進(jìn)行體外受精，早期胚胎培養(yǎng)（3個(gè)批次共160枚），挑選40枚桑椹期胚胎用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)綿羊Y染色體性別決定區(qū)的基因723 bp序列和基因1284 bp序列（，GenBank accession No：Z30265.1；，GenBank accession No：NM_001190390.1），借助BLAST和PREMIER 5程序設(shè)計(jì)巢式引物（表1）。引物均由新貝（上海）生物科技有限公司合成。根據(jù)每管OD值加ddHO調(diào)節(jié)濃度，漩渦混勻，4℃冰箱放置2 h以上，使引物充分溶解。

表1 巢式引物序列

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 綿羊血液DNA與胚胎基因組樣品制備 核酸測定儀檢測血液DNA濃度（公97.6 ng/μL，母103.5 ng/μL），按10、100、1 000、10 000倍梯度稀釋，檢測濃度（9.76、10.35 ng/μL），（0.976、1.03 ng/μL），（97.6、103 pg/μL），（9.76、10.3 pg/μL）用于試驗(yàn)。

體視顯微鏡下吸取單個(gè)桑椹胚，置于預(yù)先備好的雙蒸無菌水中清洗2～3次。移入含20 μL 100℃雙蒸無菌水（切割四分之一胚胎移入含8 μL 100℃雙蒸無菌水，該管完成直接用于后續(xù)步驟試驗(yàn)）的0.2 mL EP管中待用，盡可能少帶液體，控制在0.5 μL，進(jìn)行后續(xù)步驟。液氮中冷凍20～30 min，金屬浴煮沸10～15 min，置于冰上冷卻，5 000 r/min離心3 min完成細(xì)胞DNA徹底釋放，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血液PCR反應(yīng)體系、條件 以綿羊基因組DNA樣品梯度稀釋為模板，驗(yàn)證巢式內(nèi)、外引物特異性，并優(yōu)化擴(kuò)增條件，反應(yīng)體系如下。

PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板X μL（一輪1 μL，二輪3 μL），上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Ultra Taq PCR Mix 10 μL，dd HO補(bǔ) 充 至20 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，（一輪58℃，二輪62℃）20 s退火，72℃ 20 s延伸，（一輪25個(gè)，二輪35個(gè)）循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠在110 V條件下電泳20 min檢測，染色后用凝膠成像儀拍照，記錄結(jié)果。

1.4.3 單個(gè)胚胎超微量DNA梯度PCR反應(yīng)體系條件綿羊單個(gè)胚胎基因組DNA樣品為模板，驗(yàn)證內(nèi)、外引物的特異性，優(yōu)化擴(kuò)增條件，反應(yīng)體系如下。

PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板X μL（一輪2、1、0.8 μL，二輪3 μL），上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Ultra Taq PCR Mix 10 μL，dd HO補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，（一輪58℃，二輪62℃）20 s退火，72℃ 20 s延伸，（一輪30個(gè)，二輪35個(gè)）循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠在110 V條件下電泳20 min檢測,染色后用凝膠成像儀拍照,記錄結(jié)果。

1.4.4 桑椹胚超微量DNA巢式PCR反應(yīng)體系條件 切取桑椹單個(gè)胚胎四分之一樣品為模板，對(duì)巢式內(nèi)、外引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，并優(yōu)化擴(kuò)增條件，反應(yīng)體系如下。

PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板X μL（一輪模板量與dd HO共8 μL，該部分在胚胎切割制備樣本時(shí)一步到位，二輪3 μL），上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Ultra Taq PCR Mix 10 μL，dd HO補(bǔ) 充 至20 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃ 3 min預(yù)變性，94℃30 s變性，（一輪58℃，二輪62℃）20 s退火，72℃20 s延伸，（一輪35個(gè)，二輪35個(gè)）循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠在110 V條件下電泳20 min檢測，染色后用凝膠成像儀拍照，記錄結(jié)果。

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳分析 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Loading Buffer混合，于2%的瓊脂糖凝膠，電壓110 V，電泳時(shí)間20 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測觀察擴(kuò)增結(jié)果。從上到下Marker（條帶為700、600、500、400、300、200、100 bp）。出現(xiàn)363 bp基因產(chǎn)物和209 bp基因產(chǎn)物擴(kuò)增條帶為雄性胚胎，雌性胚胎無209 bp只有363 bp條帶。

1.4.6 胚胎DNA PCR產(chǎn)物測序 胚胎巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，送往上海生工股份有限公司進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液基因組擴(kuò)增結(jié)果 通過綿羊血液組織基因組DNA驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基因的巢式內(nèi)、外引物，經(jīng)過摸索確定兩對(duì)引物的最優(yōu)退火溫度，獲得特異性較好的擴(kuò)增結(jié)果，其中，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小一致，內(nèi)參引物擴(kuò)增大小為363 bp，引物擴(kuò)增大小為209 bp（圖1）。

圖1 綿羊血液DNA梯度稀釋GAPDH、SRY基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 綿羊桑椹胚超微量DNA梯度擴(kuò)增結(jié)果 綿羊桑椹胚超微量DNA梯度擴(kuò)增結(jié)果見圖2，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小一致，內(nèi)參引物擴(kuò)增大小為363 bp，引物擴(kuò)增大小為209 bp。

圖2 綿羊胚胎超微量DNA梯度GAPDH、SRY基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 綿羊桑椹胚超微量DNA擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)40枚胚胎樣品通過胚胎切割進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，雄性和雌性胚胎均擴(kuò)增得到大小為363 bp內(nèi)參引物片段，只有雄性胚胎擴(kuò)增得到大小為209 bp引物片段（圖3）。

圖3 綿羊胚胎GAPDH、SRY基因擴(kuò)增部分結(jié)果

2.4 雄性胚胎PCR產(chǎn)物測序比對(duì)結(jié)果 挑選3枚雄性胚胎SRY產(chǎn)物進(jìn)行測序，產(chǎn)物片段大小209 bp，一致性29.18%，于基因原序列位置一致，吻合率100%（圖4）。

圖4 胚胎PCR產(chǎn)物測序結(jié)果比對(duì)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以綿羊DNA為模板，進(jìn)行基因引物PCR擴(kuò)增，通過血液組DNA梯度稀釋至3～4個(gè)細(xì)胞DNA當(dāng)量（10 pg/μL），調(diào)整PCR體系條件，對(duì)PCR產(chǎn)物電泳檢測，雄性胚胎擴(kuò)增得到209 bp的基因特異性條帶，雌性胚胎未出現(xiàn)該片段大小條帶，雄性和雌性胚胎均擴(kuò)增得到363 bp的內(nèi)參基因條帶，與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步摸索在胚胎超微量DNA擴(kuò)增所需反應(yīng)體系、退火溫度及反應(yīng)循環(huán)數(shù)等條件要求，發(fā)現(xiàn)在20 μL體系，退火溫度在62℃和64℃，30和35個(gè)循環(huán)下的鑒定結(jié)果理想可靠。對(duì)40枚綿羊胚胎進(jìn)行超微量性別鑒定，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠，雄性胚胎擴(kuò)增得到（363 bp和209 bp）2條條帶，雌性胚胎只有（363 bp）1條條帶。與前人在囊胚期胚胎擴(kuò)增基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)在上述條件下的結(jié)果穩(wěn)定，效果良好，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間130 min內(nèi)可完成，達(dá)到了優(yōu)化的目的。

由于胚胎DNA模板量本身較少擴(kuò)增易達(dá)到平臺(tái)期，故使用樣品中存在整套DNA，利用巢式PCR特異性、靈敏度，準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，對(duì)基因經(jīng)2輪PCR特異性擴(kuò)增，該方法一方面增加模板量保證擴(kuò)增效率，另一方面極大地降低非特異性片段錯(cuò)誤擴(kuò)增結(jié)果。此外，聯(lián)合擴(kuò)增基因可避免單個(gè)胚胎加樣過程中胚胎丟失和雌性胚胎中不擴(kuò)增或擴(kuò)增失敗而導(dǎo)致陰性結(jié)果的錯(cuò)誤解釋，保證試驗(yàn)過程和結(jié)果的準(zhǔn)確。產(chǎn)物結(jié)果測序可進(jìn)一步排除加樣和點(diǎn)樣過程中雌雄胚胎之間的擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠交叉污染造成的假陽性結(jié)果，再一次驗(yàn)證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性，同時(shí)也檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和高度靈敏度。但對(duì)于2對(duì)引物PCR，2組引物間存在一定競爭性，在不影響引物特異性和靈敏度的同時(shí)降低引物間的相互影響，盡可能保證2組引物反應(yīng)條件接近一致，這無疑增加了引物設(shè)計(jì)的要求和試驗(yàn)難度。

目前PCR是牛羊等家畜胚胎性別鑒定較為便捷快速的方法，但需要結(jié)合胚胎切割技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)理想化狀態(tài)，而胚胎切割會(huì)對(duì)胚胎造成一定程度損傷，從而影響受胎率，因此切割胚胎細(xì)胞數(shù)量越少對(duì)胚胎傷害越小，對(duì)移植的效果影響就越小?；谶@點(diǎn)，Saberivand等、趙冰茹等通過妊娠母羊外周血細(xì)胞，擴(kuò)增基因進(jìn)行試驗(yàn)，檢測得到僅在懷公羔的母羊上存在基因擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法雖能減少對(duì)胎兒的傷害，但不適合雙胞胎妊娠檢測，檢測時(shí)間只能在胎兒與母體建立聯(lián)系后，因此存在一定局限性，同時(shí)也提高了性別鑒定的要求。目前胚胎性別鑒定效果的檢驗(yàn)主要還是進(jìn)行胚胎移植，通過產(chǎn)仔驗(yàn)證鑒定效率和準(zhǔn)確程度，這樣所需時(shí)間周期較長，不利于胚胎的產(chǎn)品化生產(chǎn)，有待改善。因此盡可能提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性，縮短鑒定時(shí)間，提高檢測準(zhǔn)確率及胚胎移植著床效率對(duì)檢驗(yàn)鑒定效率等尤為重要。本實(shí)驗(yàn)借助胚胎切割技術(shù)對(duì)桑椹胚切割，獲得超微量DNA模板進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)效果良好。目前家畜胚胎性別鑒定技術(shù)飛速發(fā)展，牛羊等反芻動(dòng)物PCR性別鑒定體系不斷優(yōu)化，但由于技術(shù)和理論的限制，目前的性別鑒定方法相對(duì)比較單一。早期胚胎性別鑒定技術(shù)作為家畜胚胎移植技術(shù)的一項(xiàng)重要內(nèi)容，與胚胎分割、胚胎冷凍等動(dòng)物繁殖新技術(shù)結(jié)合可以顯著提高優(yōu)質(zhì)家畜的繁育率和母犢率，加速繁育優(yōu)良品種，提高經(jīng)濟(jì)效益，因此還有待進(jìn)一步發(fā)展和改善。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用胚胎切割技術(shù)超微量DNA擴(kuò)增基因，鑒定綿羊胚胎性別方法體系靈敏度可達(dá)到約10 pg（3～4個(gè)細(xì)胞），且該體系方法可穩(wěn)定鑒定胚胎性別，效果良好。