仙鶴草不同提取部位抗肝纖維化作用的研究

李麟 饒春燕 雷青松 黃祎 劉華寶 張長江

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）03-0313-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.03.10

摘 要 目的 研究仙鶴草不同提取部位的抗肝纖維化作用。方法 以大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6為研究對象，檢測不同質(zhì)量濃度（0.5、5、50、500、5 000 μg/mL，均以生藥量計）的仙鶴草不同提取部位（總提取物、乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位）對該細(xì)胞增殖的影響（作用24、48、72 h后），并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用血小板衍生生長因子（PDGF-BB）刺激HSC-T6細(xì)胞以復(fù)制肝纖維化細(xì)胞模型，采用流式細(xì)胞儀檢測仙鶴草不同提取部位對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）表達(dá)水平，采用Western blot法檢測細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Col-Ⅰ、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）的表達(dá)水平。結(jié)果 仙鶴草總提取物、乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位均可顯著升高HSC-T6細(xì)胞凋亡率（P<0.01）;作用24 h時，上述各部位的IC50分別為50.17、20.75、5.82、4.09 μg/mL。經(jīng)PDGF-BB干預(yù)后，HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Col-Ⅰ和細(xì)胞中Col-Ⅰ、α-SMA、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;經(jīng)仙鶴草不同提取部位干預(yù)后，HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液或細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)水平大部分均較PDGF-BB組顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01），其中仙鶴草正丁醇部位干預(yù)作用最為顯著。結(jié)論 仙鶴草不同提取部位均可抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡;正丁醇部位可能是仙鶴草發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位。

關(guān)鍵詞 仙鶴草;肝纖維化;細(xì)胞凋亡;有效部位

Study on the different extraction fractions of Agrimonia pilosa against hepatic fibrosis

LI Lin1，RAO Chunyan1，LEI Qingsong2，HUANG Yi1，LIU Huabao1，ZHANG Changjiang1（1. Dept. of Hepatic Diseases， Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital， Chongqing 400021， China; 2. Oncology Radiotherapy Center， Chongqing University Cancer Hospital， Chongqing 400030， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study different extraction fractions of Agrimonia pilosa against hepatic fibrosis. METHODS Using hepatic stellate cells HSC-T6 of rats as objects， the effects of different extraction fractions （total extract， ethyl acetate fraction， petroleum ether fraction and n-butanol fraction） with different concentrations （0.5， 5， 50， 500， 5 000 μg/mL， calculated by raw drug） of A. pilosa on the proliferation of HSC-T6 cells were detected （after treated for 24， 48， 72 h）; median inhibition concentration （IC50） was also caculated. Platelet-derived growth factor （PDGF-BB） was used to induce the activation of HSC-T6 cells to establish hepatic fibrosis cell model. Flow cytometry was used to detect the effects of different extraction fractions of A. pilosa on apoptosis of HSC-T6 cells. The expression of collagen Ⅰ （Col-Ⅰ） in the supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay. The expressions of α-smooth muscle actin （α-SMA）， Col-Ⅰ， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax） and caspase-3 were detected by Western blot assay. RESULTS Total extract， ethyl acetate fraction， petroleum ether fraction and n-butanol fraction of A. pilosa could significantly increase the apoptotic rate of HSC-T6 cells （P<0.01）. After treated for 24 h， IC50 of above fractions were 50.17， 20.75， 5.82， 4.09 μg/mL， respectively. After intervened with PDGF-BB， the expression of Col-Ⅰ in supernatant of HSC-T6 cells as well as protein expression of Col-Ⅰ， α-SMA， Bcl-2， Bax and caspase-3 in HSC-T6 cells were increased significantly （P<0.01）. After intervened with different extraction fractions of A. pilosa， most of the expressions of above proteins in HSC-T6 cell culture supernatant or cells were significantly reversed compared with PDGF-BB group （P<0.05 or P<0.01）， and the intervention effect of n-butanol fraction of A. pilosa was the most significant. CONCLUSIONS Different extraction fractions of A. pilosa can inhibite the proliferation of HSC-T6 cells and induce their apoptosis; n-butanol fraction from A. pilosa may be an effective fraction to exert the effect of anti-hepatic fibrosis.

KEYWORDS? ?Agrimonia pilosa; hepatic fibrosis; cell apoptosis; effective fraction

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，表現(xiàn)為肝功能減退、門靜脈高壓等，可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等嚴(yán)重后果[1]。目前，肝纖維化的治療策略主要是抗病毒，但存在一定局限性，不能完全抑制肝纖維化的形成和進(jìn)展，臨床上仍缺乏針對纖維組織增生和降解的治療措施[2]。因此，開發(fā)能夠阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物對治療慢性肝病、防治肝硬化具有重要意義。

仙鶴草為薔薇科多年生草本植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的全草，又名脫力草、龍牙草、馬鞭草、石打穿等，最早見于《淮南草本》。仙鶴草味苦、澀、平，歸肺、肝、脾經(jīng)，主要用于治療各種出血證、痢疾、虛癆等病[3]。仙鶴草的主要成分有酚類、黃酮類、多糖類、三萜類、鞣質(zhì)以及微量元素等[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，仙鶴草具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗氧化的活性[5-7]。本課題組前期通過臨床觀察及實驗研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草具有減輕肝纖維化的作用，但具體藥效成分以及作用機(jī)制尚不明確。基于此，本研究擬探討仙鶴草不同極性部位對大鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSCs）增殖及凋亡的影響，以期為仙鶴草抗肝纖維化的藥效成分開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Vortex-5型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），CCT-3320A型超純水機(jī)（重慶力德高端水處理設(shè)備研發(fā)有限公司），YP202N型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），HH-601型恒溫水浴箱（江蘇金壇市華歐實驗儀器廠），MCO-15AC-SC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），Mini-PROTEAN Tetra 1658001型垂直電泳裝置、CFX96型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），TS-2000A型脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠），ELX800型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），TG16-WS型高速臺式離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），DW-86L388J型? ?-80 ℃超低溫冰箱（海爾生物醫(yī)療股份有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

仙鶴草（批號210300451）購自康美藥業(yè)股份有限公司，由重慶市中醫(yī)院藥劑科王琴主任中藥師鑒定為龍牙草A. pilosa Ledeb.的干燥地上部分。DMEM培養(yǎng)基（批號SH30809.01）購自美國HyClone公司;優(yōu)級胎牛血清（批號st30-3302p）購自德國PAN Biotech公司;蛋白提取試劑盒（批號p0013B）、二甲基亞砜（DMSO，批號ST038）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體、兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）單克隆抗體、兔抗鼠胱天蛋白酶3（caspase-3）單克隆抗體、兔抗鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為19245T、3498、2772T、14220T、3700S）均購自美國Cell Signaling公司;兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白（collagen Ⅰ，Col-Ⅰ）多克隆抗體（批號bs-7158R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號70-GRT007）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;ECL發(fā)光試劑盒（批號SB-WB012）購自上海圣爾生物科技有限公司;Col-Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號xl-Eh0746）購自北京麗科創(chuàng)欣生物科技有限公司;CCK8試劑盒（批號CK04）購自日本Dojindo公司;Annexin Ⅴ-PE/7-AAD流式試劑盒（批號WE0328）購自北京百奧萊博科技有限公司;血小板衍生生長因子BB（platelet derived growth factor BB，PDGF-BB，批號315-18）購自美國PeproTech公司;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病毒性肝炎研究所彭明利教授惠贈。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 仙鶴草不同提取部位的制備

稱取2.5 kg粉碎后的仙鶴草放入滲漉筒中，加入5倍量（L/kg）95%乙醇浸泡，使用脫脂棉進(jìn)行過濾，重復(fù)操作3次;合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇，得到總粗提物126 g。取部分總粗提物以溫水溶解使之充分混懸分散，然后依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3～5次，合并各萃取液并分別減壓濃縮、回收溶劑，得到石油醚部位2.031 g、乙酸乙酯部位1.895 g、正丁醇部位2.244 g。各萃取物以DMSO溶解備用。

2.3 HSC-T6細(xì)胞增殖活性的檢測

采用CCK8法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞（密度為2×104 mL-1）接種于96孔板中，然后分為對照組、仙鶴草總提取物不同濃度組、仙鶴草乙酸乙酯部位不同濃度組、仙鶴草石油醚部位不同濃度組、仙鶴草正丁醇部位不同濃度組。對照組加入培養(yǎng)基，各給藥組加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基（藥物質(zhì)量濃度均分別為0.5、5、50、500、5 000 μg/mL，均以生藥量計，根據(jù)本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置），另設(shè)不加藥物和細(xì)胞的空白組，培養(yǎng)24、48、72 h后，每組取9孔細(xì)胞加入5 g/L CCK8溶液10 μL;繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，加入DMSO 100 μL，振蕩10 min;采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下檢測每孔光密度（optical density，OD）值，并計算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。其中，細(xì)胞增殖抑制率=1-（給藥組平均OD值-空白組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%。

2.4 HSC-T6細(xì)胞凋亡的檢測

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞（密度為5×104 mL-1）接種于6孔板中，然后分為對照組、PDGF-BB組、仙鶴草總提取物組（25.00? ? ? μg/mL，質(zhì)量濃度根據(jù)“2.3”項下結(jié)果設(shè)置，其他部位給藥組同法設(shè)置）、仙鶴草乙酸乙酯部位組（10.00 μg/mL）、仙鶴草石油醚部位組（3.00 μg/mL）、仙鶴草正丁醇部位組（2.00 μg/mL），每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，各組加入PDGF-BB（10 ng/mL）刺激細(xì)胞以復(fù)制肝纖維化細(xì)胞模型[8]，培養(yǎng)1 h后，再加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按照Annexin Ⅴ-PE/7-AAD流式試劑盒說明書方法操作，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

2.5 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Col-Ⅰ表達(dá)水平的檢測

采用ELISA法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞（密度為5×104 mL-1）接種于6孔板中，按“2.4”項下方法分組與給藥。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，然后按照ELISA試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)上清液中Col-Ⅰ的表達(dá)水平。

2.6 HSC-T6細(xì)胞中肝纖維化及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞（密度為2×105 mL-1）接種于培養(yǎng)瓶中，按“2.4”項下方法分組與給藥。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞的總蛋白;然后將總蛋白與上樣緩沖液混勻、水浴加熱5 min后，冷卻備用。取變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，以1%脫脂牛奶封閉;加入α-SMA、Col-Ⅰ、Bcl-2、Bax、caspase-3一抗（稀釋度均為1 ∶ 500）以及β-actin一抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜3次、每次5 min，然后加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），于室溫孵育60 min;經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，置于凝膠自動成像儀中顯影，記錄各條帶灰度值。采用軟件Image Lab 3.0進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 仙鶴草不同提取部位對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

仙鶴草不同提取部位對HSC-T6細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，隨著提取部位質(zhì)量濃度和作用時間的增加，HSC-T6細(xì)胞增殖活性的受抑制作用越明顯，詳見圖1。

給藥作用24 h時，仙鶴草總提取物的IC50為50.17? ?μg/mL，乙酸乙酯部位的IC50為20.75 μg/mL，石油醚部位的IC50為5.82 μg/mL，正丁醇部位的IC50為4.09 μg/mL，詳見表1。由此可知，仙鶴草正丁醇部位對HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯?；诖?，選擇各組藥物約1/2倍 IC50作為后續(xù)實驗濃度，即仙鶴草總提取物25.00 μg/mL、乙酸乙酯部位10.00 μg/mL、石油醚部位3.00 μg/mL、正丁醇部位2.00 μg/mL。

3.2 仙鶴草不同提取部位對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，PDGF-BB組HSC-T6細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義;經(jīng)仙鶴草不同提取部位干預(yù)后，HSC-T6細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.01），各提取部位對細(xì)胞凋亡率影響大小順序為石油醚部位>正丁醇部位>總提取物>乙酸乙酯部位。結(jié)果見圖2、圖3。由此可知，仙鶴草石油醚部位和正丁醇部位可能是其發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位。

3.3 仙鶴草不同提取部位對HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

ELISA和Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，PDGF-BB組HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和細(xì)胞中Col-Ⅰ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與PDGF-BB組比較，仙鶴草不同提取部位組HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和細(xì)胞中Col-Ⅰ蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見圖4、圖5。

3.4 仙鶴草不同提取部位對HSC-T6細(xì)胞中肝纖維化和凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對照組比較，PDGF-BB組HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與PDGF-BB組比較，仙鶴草不同提取部位組HSC-T6細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)水平大部分顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.01）。其中，仙鶴草正丁醇部位的干預(yù)作用最為顯著。結(jié)果見圖6。

4 討論

肝纖維化是多種慢性肝病過程中的主要病理變化，具有可逆性，但若刺激因素持續(xù)存在，則可進(jìn)展至不可逆的肝硬化階段，最終引起肝癌、肝衰竭等嚴(yán)重后果。肝纖維化的病理機(jī)制較復(fù)雜，單一靶點的藥物無法干預(yù)或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程，目前尚無有效藥物[9]。而近年研究顯示，中醫(yī)藥在改善肝纖維化癥狀、恢復(fù)肝功能、改善肝內(nèi)血液循環(huán)，甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫等方面具有明顯的優(yōu)勢[10-11]。

HSCs活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，肝臟細(xì)胞受不同病因刺激發(fā)生炎癥，肝內(nèi)多種細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞因子活化HSCs，活化的HSCs又分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化形成[12]。因此，開發(fā)能夠抑制HSCs活化及增殖、促進(jìn)HSCs凋亡的藥物，是研究抗肝纖維化藥物的重要思路。本研究表明，仙鶴草總提取物、乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位對HSC-T6細(xì)胞增殖均具有不同程度的抑制作用。這提示，仙鶴草中存在具有抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)。

活化的HSCs能夠分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，如HSCs活化的標(biāo)志性蛋白α-SMA、反映肝纖維化程度的蛋白Col-Ⅰ等，這些細(xì)胞外基質(zhì)是纖維間隔形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與炎癥和肝纖維化過程，并且是導(dǎo)致血流動力學(xué)變化和門靜脈壓力升高的病理基礎(chǔ)[13-14]。本研究表明，仙鶴草總提取物、乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位均可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞中Col-Ⅰ的表達(dá)水平，以及細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)水平。這提示，仙鶴草不同提取部位可通過抑制HSC-T6細(xì)胞中肝纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，來減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草水提液可顯著抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性和時間依賴性[15]。仙鶴草揮發(fā)性成分及主要單體成分棕櫚酸、反式角鯊烯和α-亞麻酸等不僅可顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，還可顯著升高細(xì)胞的早期和晚期凋亡率[16]。仙鶴草中的異香豆素類成分仙鶴草內(nèi)酯可通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展、調(diào)控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例、活化促凋亡蛋白caspase-3等方式誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，從仙鶴草干燥部位中提取的均質(zhì)多糖能抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，并可通過caspase-3依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，且這種抑制作用呈劑量依賴性[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草水提物可抑制HepG2細(xì)胞增殖，且呈時間依賴性和劑量依賴性，這種抑制作用可能是通過上調(diào)線粒體凋亡通路中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的[19-20]。本研究表明，仙鶴草總提取物、乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位均可顯著誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡，仙鶴草總提取物和正丁醇部位可顯著抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，仙鶴草總提取物和正丁醇部位可顯著促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，仙鶴草乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位可顯著促進(jìn)caspase-3蛋白的表達(dá)。這提示，仙鶴草正丁醇部位對HSC-T6細(xì)胞具有較強(qiáng)的促凋亡作用，可能是仙鶴草發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位。

綜上所述，仙鶴草總提取物、乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位均可抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡;正丁醇部位可能是仙鶴草發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位。后續(xù)筆者將進(jìn)一步明確仙鶴草抗肝纖維化的具體活性成分，以期為其抗肝纖維化的藥效成分開發(fā)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會肝病專業(yè)委員會.肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南：2019年版[J].中華肝臟病雜志，2019，27（7）：494-504.

[ 2 ] WEISKIRCHEN R，TACKE F. Liver fibrosis：from pathogenesis to novel therapies[J]. Dig Dis，2016，34（4）：410- 422.

[ 3 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：106.

[ 4 ] 黃興，王哲，王保和.仙鶴草藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（2）：172-176.

[ 5 ] JANG H H，BAE J H，KIM M J，et al. Agrimonia pilosa ledeb. ameliorates hyperglycemia and hepatic steatosis in ovariectomized rats fed a high-fat diet[J]. Nutrients，2020，12（6）：1631.

[ 6 ] KIM D S，PARK K E，KWAK Y J，et al. Agrimonia pilosa ledeb root extract：anti-inflammatory activities of the medicinal herb in LPS-induced inflammation[J]. Am J Chin Med，2020，48（8）：1875-1893.

[ 7 ] HUANG W，JIN S Y，YANG W B，et al. Agrimonia pilosa polysaccharide and its sulfate derives facilitate cell proli- feration and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by targeting miR-107[J]. Int J Biol Macromol，2020，157：616-625.

[ 8 ] 童朝剛，朱月琴，王亞男，等. Psalmotoxin-1抑制活化的肝星狀細(xì)胞過程中microRNA差異表達(dá)譜的變化分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2019，39（4）：513-519.

[ 9 ] 劉如玉，路遙，申戈，等. HBeAg陰性初治慢乙肝患者恩替卡韋4年抗病毒治療FIB-4評分動態(tài)變化研究[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2020，34（1）：51-56.

[10] 王偉，陳翰翰，王凱.中醫(yī)藥治療肝纖維化研究進(jìn)展[J].河南中醫(yī)，2021，41（1）：137-140.

[11] 吳曉明，何強(qiáng)，尤圣杰，等.中藥復(fù)方抗肝纖維化作用機(jī)制研究概述[J].北京中醫(yī)藥，2021，40（6）：675-680.

[12] 陶山，李倩，陳陽，等.肝巨噬細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞交互作用對肝纖維化發(fā)生與逆轉(zhuǎn)的影響[J].生命科學(xué)，2021，33（3）：363-373.

[13] IWAKIRI Y，TREBICKA J. Portal hypertension in cirrhosis：pathophysiological mechanisms and therapy[J]. JHEP Rep，2021，3（4）：100316.

[14] HELLERBRAND C. Hepatic stellate cells：the pericytes in the liver[J]. Pflugers Arch，2013，465（6）：775-778.

[15] 蔡田恬，趙敏，王建平.仙鶴草水提液對胰腺癌細(xì)胞BXPC-3和PANC-1增殖的抑制作用研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2018，35（8）：1208-1211.

[16] 田露露，包永睿，王帥，等.基于人肝癌細(xì)胞HepG2的仙鶴草揮發(fā)性成分體外抗肝腫瘤活性評價研究[J].中南藥學(xué)，2019，17（1）：15-19.

[17] TENG H，HUANG Q，CHEN L. Inhibition of cell prolife- ration and triggering of apoptosis by agrimonolide through MAP kinase （ERK and p38） pathways in human gastric cancer AGS cells[J]. Food Funct，2016，7（11）：4605- 4613.

[18] HUANG W，DENG H，JIN S Y，et al. The isolation，structural characterization and anti-osteosarcoma activity of a water soluble polysaccharide from Agrimonia pilosa[J]. Carbohydr Polym，2018，187：19-25.

[19] 張婷婷，劉文洪，周琢艷，等.基于線粒體凋亡通路探討仙鶴草促HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].中藥材，2018，41（9）：2185-2189.

[20] 張婷婷，周琢艷，嵇麗娜，等.仙鶴草水提物對HepG2細(xì)胞凋亡的影響[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（23）：2746-2749.

（收稿日期：2021-09-07 修回日期：2021-12-20）

（編輯：唐曉蓮）

基金項目：重慶市自然科學(xué)基金面上項目（No.cstc2019jcyj- msxmX0049）;重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項重點項目（No.cstc2019jscx-dxwtBX0023）;重慶市科研機(jī)構(gòu)績效激勵引導(dǎo)專項（No.jxyn2020-4）

主治醫(yī)師，博士。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝病。E-mail：? ?lilin515626@126.com

通信作者：副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝病。電話：023-67667190。E-mail：changjiang78@163.com