椰毒假單胞菌酵米面亞種及毒素的污染調查與濕米粉生產風險控制

朱文娟，黃永德，黃秀麗，趙智鋒，陳文財，游澤文，張豐蕓，陳榕德，林鐵豪，陳嘉聰

(惠州市食品藥品檢驗所1，惠州 516000)(廣東省藥品檢驗所2，廣州 510663)

唐菖蒲伯克霍爾德菌廣泛存在于自然環(huán)境(土壤、水源等)，研究人員在水稻穗腐病[1-3]，在醫(yī)院環(huán)境[4-6]和食品(木耳、銀耳、米粉等)[7-9]中多次分離到該菌。椰毒假單胞菌酵米面亞種屬于唐菖蒲伯克霍爾德菌(以下簡稱酵米面亞種)，主要存在于發(fā)酵的玉米、糯玉米、黃米、高梁米、大米、變質銀耳中, 是一種導致食物中毒、致死率極高的病原微生物,該菌引起的食物中毒在國內外早有報道。酵米面亞種主要產生2種毒素：米酵菌酸(BA)和毒黃素(TF)[10]。

米酵菌酸為一種脂溶性酸性化合物, 分子式C28H38O7,分子質量486.61 ku, 化學名為3-羧甲基-17-甲氧基-6,8,21-三甲基二十二碳-2,4,8,12,14,18,20-七烯二酸，結構式見圖1。米酵菌酸毒性主要作用于線粒體內膜，與腺苷酸移位體形成復合物，阻止了ADP/ATP的轉運，它能作用于含巰基的酶使其部分失去活性[11-13]。毒黃素即椰毒假單胞菌酵米面亞種的水溶性黃色素，分子式為C7H7N5O2,摩爾質量為193.17 g/mol，結構式如圖2所示。毒黃素作用于生物氧化的起端，從還原性輔酶Ⅰ接受氫，在O2的作用下經過酶反應形成H2O2而表現(xiàn)毒性[14]。國內外學者對毒黃素的研究發(fā)現(xiàn)，該毒素對動物的血管平滑肌[15]、腎臟[16]、心臟[17]等,會造成病理性損害，可引起胃腹部不適、肝腎損傷乃至中毒性休克等癥狀，主要對人體呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)造成損害[18,19]。

圖1 米酵菌酸結構

圖2 毒黃素結構

酵米面亞種導致的食物中毒事件在我國時有發(fā)生，先后有16個省份陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了由當?shù)靥厣称?如吊漿粑、酵米面等)[20]引起的酵米面亞種食物中毒545起，中毒人數(shù)3 352人，死亡1 401人，平均病死率高達41.80%，且無特效救治藥物。

濕米粉、濕粉條等米面和淀粉制品，是廣東居民日常喜愛的主食之一，而廣東夏秋季節(jié)高溫潮濕，米面和淀粉制品較易受到唐菖蒲伯克霍爾德菌的污染，若保存不等，超限期食用，則可能引發(fā)嚴重的中毒繼而死亡事件。2018年底東莞、河源兩地接連發(fā)生因食用酵米面亞種引起的變質河粉中毒事件，造成了3人死亡。蘇嘉妮等[21]對廣東地區(qū)1570批次的米面制品進行抽樣檢驗，有5批次樣品檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌，其中1份檢出酵米面亞種，檢出率為0.06%。陳榮橋等[22]在曾發(fā)生過米酵菌酸中毒事件的南方省份采集了129份大米、碎米和淀粉樣品，在4份進口碎米和1份國產碎米中分離鑒定出6株唐菖蒲伯克霍爾德菌，4株菌株為酵米面亞種，產米酵菌酸毒素，來自進口碎米。由此可見，濕米粉的酵米面亞種污染涉及生產原料和終產品，而由其毒素引起的中毒事件應當給予高度的重視。

在唐菖蒲伯克霍爾德菌的鑒定上，常用的檢測方法有生理生化檢測法、MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法。趙夢馨等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法對該菌的鑒定結果一致且準確，而VITEK 2 COMPACT生化檢測法存在缺陷。相比傳統(tǒng)生理生化鑒定方法，MALDI-TOF-MS法在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌鑒定中更為快速、準確。

本研究從市場流通環(huán)節(jié)采集了易被唐菖蒲伯克霍爾德菌污染的食品樣品，如木耳、銀耳、玉米面、小麥淀粉、大米、碎米、米面制品等144份，以及濕米粉生產企業(yè)各環(huán)節(jié)的原料樣品25份、環(huán)境樣品96份和終產品11份，共276份樣品，開展酵米面亞種及其毒素米酵菌酸和毒黃素的污染摸查和風險分析研究。從而找到濕米粉在生產環(huán)節(jié)和流通環(huán)節(jié)的關鍵風險點，為提高產品安全質量，開展相關產品的風險監(jiān)測，預防該菌及其毒素的污染，做好食品安全應急及臨床診治方面提供技術支持和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料

從本地濕米面制品生產企業(yè)和作坊、超市、農貿市場以及小餐館中，采集米、食用淀粉、干木耳、新鮮木耳、各類米面制品等樣品共175 份，生產企業(yè)環(huán)境樣本共101份。采樣時，為了避免二次污染，對于小包裝規(guī)格的產品則整包購買，對于大包裝規(guī)格的產品則從新開封的產品中取出適量樣品裝入無菌取樣袋并密閉包裝，散裝產品則采用無菌鑷子將樣品裝入無菌取樣袋并密封保存，新鮮采樣量樣品不少于500 g，干樣不少于250 g。新鮮木耳、米面制品和環(huán)境樣本在運輸中均放置在冷藏保溫柜，并于12 h內進行實驗。

1.2 儀器和試劑

LIFE Q6全自動病原微生物檢測系統(tǒng)，VITEK 2 Compact 自動微生物快速檢測系統(tǒng)，生物安全柜，高壓滅菌鍋，BSP-400生化培養(yǎng)箱，LCMS-8040三重四級桿液相色譜質譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)，GT-2227QTS智能超聲波清洗儀；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀，Autof MS 1000 全自動微生物質譜檢測系統(tǒng)。

GVC 增菌液、胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基和改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂(MPDA)，唐菖蒲伯克霍爾德菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，VITEK 2 Compact GN 鑒定卡，玻璃紙，質譜樣本預處理試劑，米酵菌酸(純度≥95%)；毒黃素(純度≥98%)，甲酸、甲醇、乙腈為色譜純；增強型脂質去除凈化管(QuEChERS dSPE EMR-Lipid)；其余試劑為分析純；實驗用水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和增菌

鮮木耳或銀耳：用剪刀剪成約0.5 cm小塊或小段；干木耳、銀耳：先用生理鹽水泡漲后，吸干表面水分，再用剪刀剪成約0.5 cm小塊或小段；米面制品：直接取樣，均質儀拍打15 s；環(huán)境樣品：滅菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水后，于儀器設備或物件表面反復擦拭(擦拭面積約25 cm2)，用無菌剪刀將棉拭子帶棉花部分剪入15 mL TSB中25 ℃預培養(yǎng)2 h。參照GB 4789.29—2020[24]的方法進行檢驗。鮮木耳取1 g至20 mL GVC增液，其他樣品取25～225 mL GVC增菌液(36±1)℃培養(yǎng)20～24 h。

1.3.2 熒光PCR擴增

利用唐菖蒲伯克霍爾德菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)對GVC增菌液進行篩查。具體操作見其使用說明書。

核酸提?。喝? mL增菌液到1.5 mL無菌離心管中，6 000 r/min離心5 min，完全去除上清液；加入30 μL裂解液充分懸浮管底沉淀，99 ℃金屬浴加熱10 min；12 000 r/min離心15 min，上清液即為待測樣品DNA。

PCR反應體系：20 μL預混液加入5 μL模板，短暫離心后立即進行PCR擴增反應。

PCR擴增：95 ℃，30 s；{95 ℃，5 s；60 ℃，40 s} 45個循環(huán)。

1.3.3 分離、生化鑒定

對于PCR反應陽性或弱陽性的樣品，參照GB 4789.29—2020中的 5.3-5.6進行分離、純化和培養(yǎng)，采用VITEK 2 Compact 自動微生物快速檢測系統(tǒng)進行生化鑒定。

1.3.4 產毒實驗

將新鮮培養(yǎng)的菌落用生理鹽水制成1.0麥氏濁度的菌懸液，取0.5 ml菌液加至鋪有親水玻璃紙的PDA半固體平板上(使用直徑為14 cm的平皿，每皿加入100 ml培養(yǎng)基)，用L棒涂布均勻，置(26±1)℃培養(yǎng)5 d，取出玻璃紙，收集PDA半固體瓊脂至三角瓶，100 ℃滅菌30 min，置-20 ℃冰箱冷凍過夜，第2 d取出三角瓶，置室溫，待液體析出，收集上清液用于毒素測定。

分別選取產米酵菌酸、毒黃素含量較高的菌株，在培養(yǎng)溫度為20、26、30、36 ℃進行上述產毒實驗，同步收集各溫度下的毒素粗提液，上機測定。

1.3.5 毒素測定

分別取食品樣本、毒素粗提液、空白對照粗提液進行米酵菌酸和毒黃素的含量測定，參照本實驗室建立的米酵菌酸和毒黃素含量測定的液相色譜質譜法。

1.3.5.1 標準溶液配制

米酵菌酸標準儲備液(0.1 mg/mL)：準確稱取米酵菌酸標準品10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

毒黃素標準儲備液(0.1 mg/mL)：準確稱取毒黃素標準品10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.3.5.2 樣品前處理方法。

(1)樣品提取。稱取經初步粉碎后試樣5 g(精確至0.01 g)或毒素粗提液5 ml于50 mL塑料離心管中，離心管中加入1顆氧化鋯均質珠(φ25 mm)，將離心管置于1 500 r/min振動頻率的振動球磨儀中均質2 min，向均質好的試樣中加入80%甲醇水溶液10 mL，渦旋混勻1 min，超聲萃取10 min，6 000 r/min 離心5 min，吸取上清液5 mL待凈化。毒素粗提液和空白對照粗提液可省過此過程。

(2)樣品凈化。將5 mL提取液置于已預裝dSPE EMR-Lipid吸附劑的15 mL凈化中，渦旋2 min，6 000 r/min 離心5 min，取上清液2 mL于氮吹管于40 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，0.22 μm有機濾膜過濾后待測定。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C118(2.1×100 mm，1.7 μm)；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 毒黃素和米酵菌酸的測定梯度洗脫程序

1.3.5.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；掃描方式：正負離子模式；DL管溫度：250 ℃；加熱器溫度：400 ℃; 霧化氣流量：3 L/min；干燥氣流量：15 L/min；其他質譜參數(shù)見表 2。

表2 毒黃素和米酵菌酸的質譜參數(shù)

1.3.6 毒性實驗

選取SPF級昆明種雄性小白鼠(質量18～22 g)作為實驗動物，根據(jù)兩種毒素測定結果，選取米酵菌酸含量5 000 μg/kg以上，毒黃素含量1 000 μg/kg以上的粗提取液共11 份、空白對照粗提液2 份，進行動物實驗[10]。每份粗提液樣品取0.5 mL灌胃小白鼠3只，觀察受試動物反應和死亡情況。

1.3.7 MALDI-TOF MS檢測

挑取純化后的唐菖蒲伯克霍爾德菌單菌落至含300 μL去離子水的離心管中，充分震蕩混勻，加入900 μL無水乙醇，混勻，10 000 r/min離心4 min，棄上清；37～40 ℃干燥沉淀5 min，加入10 μL裂解液1，混勻；再加入10 μL裂解液2，混勻；10 000 r/min離心4 min后，取1 μL上清夜，滴加到樣品靶上，室溫下晾干；晾干后，取1 μL基質溶液覆蓋在上述樣品點上，室溫下晾干；將樣品靶放入質譜儀進行測定。參數(shù)設置：氮氣激光器，波長337 nm，正離子模式，加速電壓20.0 kV，延遲電壓18.1 kV，延遲時間230 ns，聚焦電壓7 kV，檢測器電壓2.56 kV，分子質量為2～20 ku，激光頻率60 Hz。每次上機前都要在設定的質量范圍內用標準品進行儀器校正，要保證至少有4個特征峰重疊，校正完畢后方進行樣品檢測的數(shù)據(jù)采集。

2 結果與討論

2.1 流通環(huán)節(jié)中樣品的細菌污染情況

木耳和本地大米中唐菖蒲伯克霍爾德菌的檢出率最高。本次實驗隨機采集 144 份樣品，樣品中未檢出米酵菌酸和毒黃素，說明正確泡發(fā)和食用木耳、在保質期內食用河粉米粉等米面制品，是安全的。本地大米中檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌9株，占比為28.13%(9/32)，其中2株為酵米面亞種，占比為6.3%(2/32)；木耳中檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌9株，占比為28.13%(9/32)，其中3株為酵米面亞種，占比為9.4%(3/32)；1批玉米粉中檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌，占比12.5%(1/8)；55批濕米面制品中，雖未檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌，但存在伯克霍爾德菌屬家族其他菌如類鼻疽伯克霍爾德菌和洋蔥伯克霍爾德菌的污染。除此以外，本次的樣品還檢出假單胞菌屬、泛菌屬、少動鞘氨醇單胞菌、腸桿菌和鮑曼不動桿菌等，詳見表3。

表3 流通環(huán)節(jié)樣品的細菌污染情況

2.2 生產環(huán)節(jié)中樣品的細菌污染情況

在原料和成品中檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌，推測污染來源于原料。實驗選取本市不同縣區(qū)共6家河粉生產企業(yè)進行生產環(huán)節(jié)的采樣，包括原料(米、淀粉)、原料包裝袋表面、米漿、蒸煮設備表面及冷卻風扇、切粉設備表面及包裝臺、各車間的排水渠、河粉成品等，共132份樣品。磨漿車間和蒸煮車間未發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德菌屬的污染，在原料間的大米和碎米、成品車間的河粉中分別檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌5株和1株，其中1株為酵米面亞種，來自緬甸碎米；此外，原料和包裝袋表面，還發(fā)現(xiàn)了洋蔥伯克霍爾德菌、假單胞菌和腸桿菌；成品中也發(fā)現(xiàn)了假單胞菌。具體數(shù)據(jù)見表4。為了避免企業(yè)使用存在風險的大米原料，將源頭污染風險傳遞至下游各個環(huán)節(jié)；濕米粉生產環(huán)節(jié)的關鍵控制點在于原料驗收控制、原料與各個生產環(huán)節(jié)功能間的有效分隔以及執(zhí)行嚴格的車間環(huán)境清潔消毒程序。

表4 生產環(huán)節(jié)中樣品的細菌污染情況

2.3 唐菖蒲伯克霍爾德菌產毒素情況

本次調查共分離出25株唐菖蒲伯克霍爾德菌，主要來自于大米、碎米和木耳。經過產毒實驗收集得到毒素粗提液，用液質法同時檢測毒黃素和米酵菌酸，含量結果見表5，經過動物實驗確認，6株為酵米面亞種，其中3株來自木耳，3株來自大米和碎米。產毒類型有4種，分別為不產毒(2株)、只產米酵菌酸(7株)、只產毒黃素(5株)和兩種毒素均產(11株)，6株酵米面亞種的菌種編號為別為F、K、M、V、X、Z，毒素測定的液質圖譜見圖3。

表5 分離菌株毒素測定結果

產毒株中毒黃素最高含量為2 611.24 μg/kg，來自本地大米，編號為X；米酵菌酸最高含量為34 678.99 μg/kg，來自某超市的干木耳，編號為F。11株分離株兩種毒素均產，占比44%，僅有2株分離株兩種毒素均不產，占比8%。產毒株中兩種毒素含量差異較大，米酵菌酸最高量是毒黃素的10倍以上。推測原因可能是產毒株產米酵菌酸的能力更強，因此米酵菌酸也是引起中毒的主要原因[25]；或者是產毒培養(yǎng)的培養(yǎng)基利于米酵菌酸的合成，卻不利于毒黃素的合成。后續(xù)研究將選取毒黃素含量高的菌株，進行不同培養(yǎng)基的產毒條件，摸索適合毒黃素檢測的產毒培養(yǎng)基。

2.4 兩種毒素含量與溫度的變化呈正相關

實驗挑取分別產米酵菌酸和毒黃素量較大的典型菌株F和G，在20、26、30、36 ℃下進行產毒實驗，培養(yǎng)5 d后，收集得到毒素粗提液，用液質法檢測，2種毒素隨溫度的變化趨勢見圖3。

圖3 菌株F中米酵菌酸、菌株G中毒黃素隨溫度變化的趨勢

F菌株的米酵菌酸含量，在20 ℃培養(yǎng)下為485.20 μg/kg，在30 ℃時達到最高含量34 678.99 μg/kg。G菌株的毒黃素含量，在20 ℃培養(yǎng)下為56.86μg/kg，在30 ℃時達到最高值1 956.43μg/kg。米酵菌酸和毒黃素的含量均隨著培養(yǎng)溫度的升高而顯著升高，并在30 ℃時達到最高值。20 ℃和30 ℃條件下，米酵菌酸含量相差近70倍，毒黃素含量相差近40倍。因此，在濕米粉的流通環(huán)節(jié)，將樣品的儲存溫度控制在20 ℃以下，能有效減少毒素的合成，減少中毒事件的發(fā)生。

2.5 唐菖蒲伯克霍爾德菌的進化樹分析

通過全自動微生物質譜檢測系統(tǒng)進行菌株鑒定和蛋白質聚類分析，采用軟件Auto Analyzer V2.0.14，使用k-means自底向上的聚類分析方法。標準菌株L和25株分離菌均為唐菖蒲伯克霍爾德菌，得分均在9.0以上，鑒定結果與VITEK 2生化鑒定一致。菌株的聚類分析圖見圖4，菌株X和V、P和Q均來自某鎮(zhèn)1的黏米，W和R來自某鎮(zhèn)2的黏米，U和T來自絲苗米，O和G、F和C、Z和Y均來自木耳/鮮木耳，N和M來自同一進口商的緬甸碎白米，I和D來自同一進口商的泰國碎白米。

注：圖中右側大寫英文字母為實驗室分離的唐菖蒲伯克霍爾德菌的菌株編號。

本實驗同時使用VITEK 2 COMPACT和MALDI-TOF-MS對25株分離株進行鑒定，結果均為唐菖蒲伯克霍爾德菌。相比生化鑒定，MALDI-TOF-MS更快速、更省事，并可通過聚類分析得到進化樹。本實驗通過K類聚類分析，發(fā)現(xiàn)相同品種、同一產地的樣品，分離的唐菖蒲伯克霍爾德菌具有高度同源性，為該類菌的污染溯源提供了科學可行的實驗手段。

3 結論

本研究主要針對流通環(huán)節(jié)易受酵米面亞種及其毒素污染的食品進行污染調查，利用本實驗室建立的液質方法同時對米酵菌酸和毒黃素2種毒素進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，木耳、大米(碎米)、玉米粉較易受到唐菖蒲伯克霍爾德菌的污染；對濕米粉生產企業(yè)進行各環(huán)節(jié)的樣品及環(huán)境采樣，在原料大米(碎米)和成品河粉中發(fā)現(xiàn)唐菖蒲伯克霍爾德菌；25株唐菖蒲伯克霍爾德菌分離株經過毒性實驗，證實6株為酵米面亞種，其中3株來源于木耳，2株來源于本地大米，1株來源于進口碎米(生產環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn))；所有樣品均未檢出米酵菌酸和毒黃素。通過對多家濕米粉生產企業(yè)生產環(huán)節(jié)采樣結果的分析，推測終產品中唐菖蒲伯克霍爾德菌的污染來源于原料大米或碎米，為了避免企業(yè)使用存在風險的大米原料，將源頭污染風險傳遞至下游各個環(huán)節(jié)，建議企業(yè)應嚴格把控原料的驗收和儲藏，同時將原料與各個生產環(huán)節(jié)功能間進行有效分隔，防止原料粉塵對其他環(huán)節(jié)的污染，以及執(zhí)行嚴格的車間環(huán)境清潔消毒程序；而在濕米粉流通環(huán)節(jié)，應控制樣品的儲藏溫度，最大限度的減少米酵菌酸和毒黃素的產生。通過生產環(huán)節(jié)的原料與環(huán)境控制、流通環(huán)節(jié)的溫度控制，共同有效預防由該菌引起的嚴重食物中毒事件的發(fā)生。