銀萊湯中主要成分的UPLC多波長(zhǎng)寬動(dòng)態(tài)測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

郁映婷，劉 潔，白 辰，趙淑軍，楊 潔，吳 浩， 潘綺雪，劉鐵鋼*，肖紅斌*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥 大學(xué) 中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 100029； 5.新疆石河子大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

銀萊湯是在經(jīng)典名方銀翹散與保和丸的基礎(chǔ)上，結(jié)合北京中醫(yī)藥大學(xué)谷曉紅教授的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，形成的以肺胃同治為主要治則的臨床經(jīng)驗(yàn)方[1]。其由金銀花、萊菔子、連翹、黃芩、魚腥草、瓜蔞、前胡組成，功效為清肺瀉胃、宣肺止咳、辛涼清解、調(diào)和表里，臨床用于治療肺胃積熱型感冒患兒。銀萊湯能夠明顯改善患兒機(jī)體狀態(tài)，減少發(fā)病次數(shù)，總有效率可達(dá)95%[2]。藥理研究表明，銀萊湯有顯著的解熱抗炎作用[3]，能有效治療食積復(fù)合流感病毒感染小鼠肺部的炎癥損傷[4]，能通過(guò)促進(jìn)免疫球蛋白的分泌、調(diào)控細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)平衡來(lái)增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫功能[5-7]，進(jìn)而發(fā)揮其抗流感病毒的功效。銀萊湯目前處于中藥新藥研發(fā)階段，其藥理功效基本明確，然而尚未建立質(zhì)量控制方法。

中藥復(fù)方成分具有復(fù)雜性，是君臣佐使多味藥材中多種化學(xué)成分的集合。中藥復(fù)方發(fā)揮藥效是由其中的一類或幾類成分協(xié)同起效，活性成分含量變化直接影響其質(zhì)量和藥效[8-11]，因此建立綜合、全面的質(zhì)量控制方法十分必要。目前，常以單一指標(biāo)性成分控制中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量，不足以評(píng)價(jià)中藥復(fù)方的整體質(zhì)量[12]。近年來(lái)，有較多學(xué)者采用多成分含量測(cè)定來(lái)控制中藥復(fù)方的質(zhì)量，然而大部分研究?jī)H測(cè)定中藥復(fù)方中的君藥和臣藥中活性成分或某一類成分的含量，忽視了佐使藥材，造成復(fù)方中部分藥材活性成分的遺漏，特征性較差[13-14]?；诖耍狙芯窟x擇銀萊湯的君(金銀花、萊菔子)、臣(連翹、瓜蔞)、佐(魚腥草)、使(黃芩、前胡)藥材中藥典指標(biāo)性成分和響應(yīng)值較強(qiáng)的成分，以及復(fù)方中發(fā)揮清熱解毒、抗菌抗炎功效的成分進(jìn)行測(cè)定，以期綜合、全面地控制銀萊湯的質(zhì)量。

相較單成分測(cè)定，多成分測(cè)定由于復(fù)方中各成分的紫外吸收及含量差異大，在同一波長(zhǎng)下難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定，若選用多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，則需調(diào)用不同色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，圖譜結(jié)果分析較繁瑣[15]。因此，本研究采用超高效液相色譜(UPLC)波長(zhǎng)在線切換法建立同時(shí)測(cè)定銀萊湯中10種有效成分含量的方法，并測(cè)定3個(gè)批次中各成分含量用于質(zhì)量穩(wěn)定性、一致性評(píng)價(jià)，從而為該中藥復(fù)方的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

安捷倫1290超高效液相色譜儀，配G4212A型DAD紫外檢測(cè)器、G1316C型柱溫室、G4226A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G4220A型二元泵(美國(guó)Agilent公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AT201型1/10萬(wàn)電子天平(瑞士梅特勒公司)；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)；BZF-50真空干燥箱(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；MC268C恒溫恒濕電子防潮箱(萊茵邁瑞歐工業(yè)科技有限公司)；超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲酸、甲醇(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

對(duì)照品(純度大于98%)：新綠原酸(X-014-180410)、綠原酸(L-007-171216)、隱綠原酸(Y-067-181216)、芥子堿硫氰酸鹽(J-043-180413)、連翹酯苷A(L-012-181216)、槲皮苷(H-011-180506)、黃芩苷(H-016-180322)、漢黃芩苷(H-019-180823)、千層紙素A苷(Q-046-181013)均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;連翹酯苷I(FY3876B0516)購(gòu)自南通飛宇生物科技有限公司。

金銀花(產(chǎn)地：山東，批號(hào)：1901024)、炒萊菔子(產(chǎn)地：河北，批號(hào)：1812077)、連翹(產(chǎn)地：山西，批號(hào)：1903063)、黃芩(產(chǎn)地：河北，批號(hào)：1901040)、干魚腥草(產(chǎn)地：湖北，批號(hào)：1811006)、瓜蔞(產(chǎn)地：江蘇，批號(hào)：1812065)、前胡(產(chǎn)地：浙江，批號(hào)：1811059)均購(gòu)自北京太洋樹康藥業(yè)有限責(zé)任公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)王學(xué)勇教授鑒定，存儲(chǔ)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析與轉(zhuǎn)化中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銀萊湯干膏粉的制備按照處方稱取金銀花30 g、炒萊菔子10 g、連翹15 g、魚腥草20 g、黃芩10 g、前胡10 g、瓜蔞15 g，置于5 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水，加熱回流提取1.5 h，重復(fù)提取3次，放冷過(guò)濾。合并3次濾液，減壓濃縮干燥至小體積，再經(jīng)減壓干燥箱干燥后，制成粉末，保存于恒溫恒濕電子防潮箱。

1.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備分別稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A、槲皮苷、黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷適量，精密稱定，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為50.0、50.0、50.0、25.0、20.0、16.7、5.00、500、125、100 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備取“1.3.1”銀萊湯干膏粉0.2 g，精密稱定，加適量50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再加50%甲醇稀釋至刻度，使用前過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

1.3.4 色譜條件色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫：0～5 min，10%～15% B；5～10 min，15% B；10～16 min，15%～25% B；16～30 min，25%～32% B。柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL，流速為0.4 mL·min-1。采用波長(zhǎng)切換：0～10 min，在320 nm波長(zhǎng)下測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I；10～16 min，在350 nm波長(zhǎng)下測(cè)定連翹酯苷A、槲皮苷；16～30 min，在320 nm波長(zhǎng)下測(cè)定黃芩苷、千層紙素A苷和漢黃芩苷。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)成分的選擇

在檢測(cè)成分的選擇上，應(yīng)綜合考慮銀萊湯復(fù)方君臣佐使藥材中的指標(biāo)性成分和響應(yīng)值較強(qiáng)的成分，以及復(fù)方中發(fā)揮清熱解毒、抗菌抗炎功效的成分。復(fù)方君藥金銀花中的酚酸類成分是清熱解毒的主要藥效物質(zhì)，且新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸在金銀花中含量較高，其中綠原酸為指標(biāo)性成分[16-17]；君藥萊菔子的主要活性成分為芥子堿，以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在，常作為萊菔子的質(zhì)控指標(biāo)成分[18]；臣藥連翹含有木脂素類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油等多種成分，其中連翹酯苷類是主要的特征活性成分，具有顯著的抗菌、抗炎作用[19-21]，且連翹酯苷A為指標(biāo)性成分；佐藥魚腥草中的槲皮苷等黃酮類化合物具有較強(qiáng)的肺部炎癥治療活性[22-23]，其中槲皮苷被用于質(zhì)量控制[24]；使藥黃芩的活性成分為黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷等黃酮類化合物，是發(fā)揮抗炎、抗病毒的主要藥效物質(zhì)[25-26]，其中黃芩苷為指標(biāo)性成分。目前，2015版《中國(guó)藥典》暫未確定瓜蔞的指標(biāo)性成分[12]；前胡的主要成分為脂溶性的香豆素類化合物[27]，但在水煎液中溶出較少，且前胡在銀萊湯復(fù)方中用量較小，因此未選擇瓜蔞和前胡中成分進(jìn)行測(cè)定。綜上，本研究選擇新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A、槲皮苷、黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷為檢測(cè)成分。

2.2 樣品復(fù)溶溶劑的選擇

分別考察了水、50%甲醇、甲醇作為復(fù)溶溶劑的效果。結(jié)果表明，加水復(fù)溶后，溶液中雜質(zhì)較多導(dǎo)致過(guò)濾困難，放置一段時(shí)間后樣品瓶底部有沉淀析出，影響測(cè)定；以甲醇復(fù)溶時(shí)，進(jìn)樣檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形不對(duì)稱，出現(xiàn)峰分叉現(xiàn)象，可能由于樣品溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相而出現(xiàn)了溶劑效應(yīng)；50%甲醇對(duì)樣品有較好的溶解，并可減少雜質(zhì)干擾。因此，最終選擇以50%甲醇作為樣品的復(fù)溶溶劑。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)對(duì)10個(gè)成分的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外吸收全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A在326 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，槲皮苷在255、350 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩苷在275 nm波長(zhǎng)下有最大吸收。但黃芩苷類成分在275 nm波長(zhǎng)下吸收強(qiáng)，吸光度過(guò)高，在同一色譜圖中與其他待測(cè)成分的色譜峰峰高比例不協(xié)調(diào)，因此選擇有較強(qiáng)吸收的320 nm波長(zhǎng)作為待測(cè)成分的主要檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)化合物的保留時(shí)間，最終確定的檢測(cè)波長(zhǎng)切換程序如“1.3.4”所示。

由于復(fù)方中各成分的紫外吸收及含量差異大，若僅以某一單波長(zhǎng)作為多成分的檢測(cè)波長(zhǎng)，易遺漏復(fù)方中關(guān)鍵成分的信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I在275 nm波長(zhǎng)下信號(hào)較弱，無(wú)法準(zhǔn)確定量；而在本實(shí)驗(yàn)選定的3個(gè)波長(zhǎng)中，槲皮苷僅在350 nm波長(zhǎng)下有吸收。此外，對(duì)各成分的峰面積進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，綠原酸類和黃芩苷類成分在其最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度較高，與其他成分的峰高比例不協(xié)調(diào)，這對(duì)多成分同時(shí)定量的線性范圍確定帶來(lái)一定困難。基于此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)吸收強(qiáng)的成分選擇有相對(duì)較強(qiáng)吸收的波長(zhǎng)，對(duì)信號(hào)響應(yīng)弱的成分選擇最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行在線切換動(dòng)態(tài)檢測(cè)。綜上，相較單波長(zhǎng)檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采用的波長(zhǎng)在線切換動(dòng)態(tài)檢測(cè)不僅能夠?qū)Σ煌煞诌M(jìn)行同時(shí)測(cè)定，而且可兼顧所有成分吸光度值在合理的線性范圍內(nèi)，可為中藥復(fù)方多成分同時(shí)測(cè)定提供參考。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性精密吸取混合對(duì)照品、供試品溶液2 μL，按照“1.3.4”色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。供試品與對(duì)照品中10種成分均在相同保留時(shí)間處出峰，且達(dá)到基線分離。

2.4.2 線性關(guān)系分別精密吸取適量“1.3.2”的混合對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋，得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的質(zhì)量濃度為0.781、1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μg·mL-1；芥子堿硫氰酸鹽的質(zhì)量濃度為0.391、0.781、1.56、3.13、6.25、12.5、25.0 μg·mL-1；連翹酯苷I的質(zhì)量濃度為0.313、0.625、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0 μg·mL-1；連翹酯苷A的質(zhì)量濃度為0.261、0.521、1.04、2.08、4.17、8.34、16.7 μg·mL-1；槲皮苷的質(zhì)量濃度為0.078 1、0.156、0.313、0.625、1.25、2.50、5.00 μg·mL-1；黃芩苷的質(zhì)量濃度為7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500 μg·mL-1；千層紙素A苷的質(zhì)量濃度為1.96、3.91、7.81、15.6、31.3、62.5、125 μg·mL-1；漢黃芩苷的質(zhì)量濃度為1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0、100 μg·mL-1的系列對(duì)照品混合溶液。取上述溶液各2 μL，按“1.3.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明，各成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r不小于0.999 2(見表1)。

表1 各成分的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of various components

2.4.3 檢出限與定量下限取“1.3.2”配制的混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，按“1.3.4”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，測(cè)得10種有效成分的LOD為0.018 8～0.075 0 μg·mL-1，LOQ為0.062 5～0.250 μg·mL-1(見表1)。

2.4.4 精密度取同一對(duì)照品溶液，按“1.3.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示，10種有效成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.040%～0.65%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h精密吸取2 μL，按“1.3.4”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，10種有效成分峰面積的RSD為0.35%～1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性按照“1.3.3”方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取2 μL，按“1.3.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，10種有效成分含量的RSD為0.52%～1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加標(biāo)回收率取6份已知各成分含量的銀萊湯干膏粉樣品0.1 g，精密稱定，加入10種有效成分對(duì)照品適量，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，在“1.3.4”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分的平均回收率和RSD(見表2)。結(jié)果表明，10種成分的平均回收率為95.1%～104%，RSD為0.80%～3.7%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 樣品含量測(cè)定

取3批銀萊湯干膏粉樣品，按照“1.3.3”制備供試品溶液，以“1.3.4”色譜條件進(jìn)樣分析，得到10種成分的含量。由3批樣品中各化合物的平均含量明確化合物在銀萊湯中的含量分布(見圖2A)，同時(shí)計(jì)算3批樣品中化合物總含量的RSD及各化合物含量的RSD，明確化合物在不同批次中的穩(wěn)定性(見圖2B)。

結(jié)果表明，10種有效成分的總含量達(dá)70.013 mg·g-1，3個(gè)批次銀萊湯中10種有效成分總含量的RSD為0.75%，各化合物含量的RSD均小于9.0%，表明不同批次銀萊湯的質(zhì)量較為穩(wěn)定；君藥金銀花和萊菔子，臣藥連翹，佐藥魚腥草及使藥黃芩中所測(cè)成分的含量分別占10種成分總量的22%、5%、73%，表明復(fù)方中除君藥外，其他各藥材活性成分也起著重要作用，因此評(píng)價(jià)銀萊湯質(zhì)量時(shí)應(yīng)綜合考慮。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得10種成分的平均含量為0.204～38.129 mg·g-1，可見銀萊湯中有效成分的含量范圍跨度較大。其中以黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷的含量最高(均達(dá)6.172 mg·g-1以上)，其次為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸(均達(dá)3.875 mg·g-1以上)，芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A的含量較低(達(dá)1.493 mg·g-1以上)，以上成分較全面地涵蓋了復(fù)方中君臣佐使藥材的特征性成分，且批間含量差異相對(duì)較小(RSD依次為0.86%、0.98%、0.53%、1.3%、0.61%、1.2%、0.37%、0.75%、2.9%)，表明以上成分在不同批次銀萊湯中能夠穩(wěn)定存在。槲皮苷的含量最低(為0.204 mg·g-1)，且在不同批次銀萊湯中含量的穩(wěn)定性稍差(RSD為8.1%)，因此槲皮苷不宜作為銀萊湯的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

此外，黃芩苷、綠原酸可通過(guò)影響炎癥信號(hào)通路而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛、抗炎作用，且具有廣譜抗菌、抗病毒作用[28-29]；漢黃芩苷可通過(guò)MLCK/pMLC2通路改善腸上皮屏障功能以減輕結(jié)腸炎[30];新綠原酸可作為AMPK/Nrf2信號(hào)激活劑，防止與急性和慢性炎癥性疾病相關(guān)的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)度反應(yīng)[31];隱綠原酸可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)和Nrf2核易位來(lái)減輕炎癥損傷和抗氧化應(yīng)激[32];芥子堿硫氰酸鹽是萊菔子中抗菌、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)的主要藥效物質(zhì)[33]；連翹中的連翹酯苷類活性成分與其發(fā)揮清熱解毒作用密切相關(guān)[34]。綜上所述，黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A 9個(gè)成分不僅是與復(fù)方清熱解毒、抗菌抗炎密切相關(guān)的功效成分，且覆蓋了復(fù)方中多個(gè)關(guān)鍵藥材，同時(shí)在復(fù)方中能夠穩(wěn)定存在，可作為銀萊湯的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3 結(jié) 論

本研究建立了銀萊湯中主要成分的多波長(zhǎng)寬動(dòng)態(tài)UPLC測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便可靠、分析效率高，測(cè)定指標(biāo)相對(duì)全面、合理可行，能更好表征及控制銀萊湯的質(zhì)量。并篩選得到黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、芥子堿硫氰酸鹽、連翹酯苷I、連翹酯苷A 9個(gè)成分可作為銀萊湯復(fù)方的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而綜合全面地評(píng)價(jià)銀萊湯的質(zhì)量。