鱉甲煎丸對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的治療作用機(jī)制研究

周 翔，顧 達(dá)，童 聰，曾佳慧，吳泓飛，趙祥安

(1.如皋市中醫(yī)院，江蘇 南通 223001；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210000；4.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

肝纖維化是由慢性肝損傷修復(fù)過程中彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積引起的[1]。多種慢性肝病(Chronic liver disease，CLD)都可引起肝纖維化，以慢性乙型肝炎為例，全世界約有3.5億慢性乙型肝炎患者，約25%最終發(fā)展為肝纖維化[2]。如不及時(shí)治療，肝纖維化會(huì)進(jìn)展為失代償期肝硬化，并引起各種嚴(yán)重并發(fā)癥，如食管靜脈曲張和原發(fā)性肝癌等[2]。對家庭和社會(huì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在急慢性肝臟炎癥中，外周循環(huán)中的單核細(xì)胞被招募到受損的肝組織中，然后分泌促炎細(xì)胞因子-白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α，加重肝細(xì)胞損傷，并且釋放促纖維化細(xì)胞因子-轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β，TGF)-β1和血小板源性生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)促進(jìn)肝纖維化[3-4]。同時(shí)最新的研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時(shí)單核細(xì)胞浸潤主要依賴于單核細(xì)胞趨化因子-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)[5- 6]。通過抑制MCP-1分泌減少單核細(xì)胞浸潤是治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)。

鱉甲煎丸具有活血化瘀功效，是治療肝纖維化的經(jīng)典方劑。已有研究表明，鱉甲煎丸能有效降低慢性乙型肝炎合并肝硬化患者血清肝纖維化指數(shù)透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅳ型膠原和Ⅲ型前膠原[7-9]。但其抗肝纖維化的機(jī)制不完全明確。中醫(yī)理論認(rèn)為血瘀是肝纖維化的關(guān)鍵病機(jī)，而單核細(xì)胞黏附肝竇內(nèi)皮細(xì)胞并向肝臟浸潤是肝纖維化時(shí)血瘀的重要機(jī)制之一[10-12]。本課題擬觀察鱉甲煎丸對肝纖維化模型小鼠肝臟炎癥、纖維化的作用，并進(jìn)一步觀察肝組織內(nèi)單核細(xì)胞浸潤和單核細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌，最終觀察MCP-1的表達(dá)。本研究有助于揭示鱉甲煎丸活血化瘀抗肝纖維化的科學(xué)內(nèi)涵，為鱉甲煎丸抗肝纖維化臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 C57/B6雄性小鼠40只，6～8周齡，體重20～22 g，購自江蘇集萃藥康生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SYXK(蘇)2009-0017]，在南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在(23 ± 2) ℃，相對濕度為50%。給小鼠喂食高壓滅菌的食物和過濾水，并在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 鱉甲煎丸(Z42020772)，四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)(20161011)。橄欖油(2015060702)。WB一抗抗體MCP-1(ab246795)。WB二抗-辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG(CW010M)。免疫組化一抗CD11b(ab133357)、F4/80(ab16911)、α-SMA(ab5694)、Col-I(ab254349)。免疫組化二抗-辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG(PV-6001)。Trizol試劑盒(5596-019)，DEPC水(R0021)，q-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR420A)，DMEM培養(yǎng)基(C11995500BT)，胎牛血清(10091-148)，雙抗(15140-122)，q-PCR熒光試劑盒(RR036A)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Applied biosystems Quant StudioTM 6 Flex Real-time-PCR儀(美國Life Technologies)，Applied biosystems 2720 thermal cycler型RNA逆轉(zhuǎn)錄儀(美國Life Technologies)，Power Pac TM Universal型電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Tanon 5200 Multi型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，V2 S02型渦旋振蕩器(德國 IKA)，IKA mini G型微型離心機(jī)(德國 IKA)，Heraeus Fresco 21冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher)，Bx60型生物顯微鏡(日本 Olympus)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 肝纖維化模型建立和鱉甲煎丸干預(yù):通過腹腔注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型[13]，按3 μl/g的劑量腹腔注射橄欖油稀釋的CCl4(CCl4∶橄欖油=1∶4)，每周2次，共4周。空白對照組腹腔注射等體積的橄欖油。灌胃前鱉甲煎丸用0.5%羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-NA)溶液溶解和重懸，根據(jù)我們前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和已發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)定高劑量組為2.20 g/(kg·d)、中劑量組為1.10 g/(kg·d)、低劑量組按0.55 g/(kg·d)。最后1次給藥后48 h內(nèi)，麻醉處死小鼠。收集血清和肝組織進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4.2 肝酶測定:采用生化儀(Beckman-coulter)臨床檢測技術(shù)檢測各組肝酶水平，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)。

1.4.3 肝組織病理學(xué)觀察:肝組織HE和Masson染色方法如下。小鼠肝組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)一步脫水，石蠟包埋，最后切片為3 μm薄片。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案對切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色。

1.4.4 肝組織免疫組化:將制備的小鼠肝臟切片依次進(jìn)行脫蠟、透明化和抗原修復(fù)。然后，將切片與各種一抗α-SMA、Col-I、F4/80、CD11b在4 ℃孵育過夜。次日，免疫組化二抗孵育：37 ℃，30 min。最后，DAB染色，蘇木精顯核，中性樹脂膠固定。

1.4.5 肝組織定量實(shí)時(shí)PCR:利用Trizol(15596-026)從冷凍肝臟中提取總RNA，并用Prime Script RT-Master Mix試劑盒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在Step-One Plus(Applied Biosystems)上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。表1所列引物由Primer Bank網(wǎng)站獲得，北京擎科新產(chǎn)業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，β-actin用于基因表達(dá)的內(nèi)參。

表1 qRT-PCR指標(biāo)的引物序列

1.4.6 蛋白質(zhì)印跡(WB):按照總蛋白提取試劑盒提取小鼠肝臟總蛋白。蛋白質(zhì)經(jīng)雙氰胺酸法定量后，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。室溫下用3%牛血清白蛋白封閉膜2 h，然后用分別一抗孵育：MCP-1(稀釋1∶2000)或GAPDH(稀釋1∶2000)，在4 ℃下孵育過夜。次日，利用辣根過氧化物酶IgG室溫下共孵育2 h，最后用Western Bright TM ECL試劑盒顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)圖表制作采用Graph-Pad-prism6軟件。本研究采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鱉甲煎丸降低CCl4誘導(dǎo)的肝臟炎癥 見表2(圖1)。CCl4組小鼠腹腔內(nèi)反復(fù)注射CCl4后，肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死、白細(xì)胞浸潤和小葉結(jié)構(gòu)受損。CCl4組ALT、AST較對照組明顯升高。相比于CCl4組，鱉甲煎丸組特別是高劑量組小鼠肝組織ALT和AST明顯降低，肝細(xì)胞壞死、白細(xì)胞浸潤和小葉結(jié)構(gòu)受損減輕。以上結(jié)果提示，鱉甲煎丸能有效地逆轉(zhuǎn)CCl4所致的肝臟炎癥。

表2 各組小鼠血清ALT、AST表達(dá)(U/L)

圖1 各組小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×100)

2.2 鱉甲煎丸減輕CCl4誘導(dǎo)的HSCs活化和膠原沉積 通過Masson染色觀察鱉甲煎丸對CCl4誘導(dǎo)的膠原沉積的影響。CCl4組小鼠腹腔內(nèi)反復(fù)注射CCl4后，肝臟出現(xiàn)大量膠原沉積，而鱉甲煎丸組小鼠肝臟膠原沉積明顯減少。HSCs增殖活化后，可以表達(dá)大量α-SMA和分泌Col-I。通過α-SMA和Col-I免疫組化，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸，尤其是大劑量鱉甲煎丸能有效降低CCl4誘導(dǎo)的HSCs活化和Col-I沉積。通過計(jì)算Masson染色、α-SMA和Col-I免疫組化學(xué)染色的像素比，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸和CCl4組小鼠的Masson染色、α-SMA和Col-I免疫組化比例較模型小鼠的Masson染色、α-SMA和Col-I免疫組化比例明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 各組小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化(Masson染色、Col-I和α-SMA免疫組化，×100)

2.3 鱉甲煎丸減少單核細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá) 見表3。單核細(xì)胞通過分泌IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子和TGF-β1、PDGF等促纖維化細(xì)胞因子加重肝纖維化[3,14-15]。如圖3A所示，反復(fù)腹腔注射CCl4后，CCl4組小鼠肝臟中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、PDGF的肝內(nèi)mRNA表達(dá)顯著增加，鱉甲煎丸給藥后這些表達(dá)均降低。同時(shí)，與低劑量鱉甲煎丸比較，高劑量鱉甲煎丸對IL-1β、TNF-α、TGF-β1、PDGF表達(dá)的抑制作用更強(qiáng)。

表3 各組小鼠肝臟中促炎和促纖維化細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較

圖3 各組小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化(CD11b和F4/80免疫組化，×200)

2.4 鱉甲煎丸抑制單核細(xì)胞浸潤 為了驗(yàn)證鱉甲煎丸能減少單核細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，研究進(jìn)一步通過免疫組化觀察了小鼠肝臟中單核細(xì)胞數(shù)量的變化。 F4/80免疫組化結(jié)果提示，在CCl4腹腔注射4周后，小鼠肝組織F4/80+巨噬細(xì)胞較正常對照組明顯増多，而鱉甲煎丸組小鼠肝組織F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量較CCl4組明顯減少。CD11b為單核細(xì)胞標(biāo)記。免疫組化結(jié)果提示，CCl4組小鼠肝組織中CD11b+單核細(xì)胞較正常對照組明顯增多，而給予鱉甲煎丸干預(yù)后，單核細(xì)胞浸潤明顯減少(圖3)。

2.5 鱉甲煎丸通過抑制MCP-1分泌減少單核細(xì)胞黏附 見表4。MCP-1/CCR2軸在肝纖維化過程中單核細(xì)胞浸潤肝臟起關(guān)鍵作用[6]。反復(fù)注射CCl4后，小鼠肝臟MCP-1 mRNA表達(dá)增加。與CCl4組比較，鱉甲煎丸組小鼠肝臟表達(dá)MCP-1 mRNA明顯減少。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，研究進(jìn)一步通過WB檢測MCP-1的蛋白表達(dá)。鱉甲煎丸組小鼠，特別是高劑量組小鼠肝臟MCP-1表達(dá)較CCl4組小鼠明顯減低(圖4)。

表4 各組小鼠肝臟MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖4 各組小鼠肝臟中MCP-1蛋白表達(dá)

3 討 論

肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理生理過程[16-17]。主要表現(xiàn)為廣泛的肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積引起的正常肝組織破壞、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成，最終導(dǎo)致門脈高壓相關(guān)性疾病、低蛋白血癥等多種嚴(yán)重并發(fā)癥的產(chǎn)生。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝纖維化的發(fā)病機(jī)制研究頗深，但目前仍無針對性藥物[18]。

中醫(yī)學(xué)里并無“肝纖維化”名詞，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可分屬“臌脹”“癥瘕”“積聚”等病范疇。中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化病機(jī)主要為外感濕熱之邪或感染疫毒，或飲酒過度釀生濕熱，羈留不去，漸致肝、脾、腎功能失調(diào)，氣血、津液搏結(jié)，以致肝絡(luò)瘀阻，日久則成積聚。中醫(yī)藥治療肝纖維化積累了上千年的臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)造了多個(gè)針對肝纖維化的經(jīng)典方劑，如扶正化瘀方、柔肝方、鱉甲煎丸等。其中鱉甲煎丸是治療肝纖維化的經(jīng)方，全方以鱉甲為君藥，軟堅(jiān)散結(jié)，破瘕消積；以大黃、牡丹皮、桃仁、芍藥為臣藥，活血消脹、祛瘀生新；配以鼠婦、蜣螂、蟲消積破堅(jiān)；瞿麥、石葦利水祛濕；柴胡、桂枝、厚樸、黃芩等疏理氣機(jī)；半夏、射干、葶藶子祛痰散結(jié)；人參、阿膠、白芍補(bǔ)養(yǎng)氣血。縱觀鱉甲煎丸全方，藥物眾多，以軟堅(jiān)散結(jié)藥為君，配以大量活血之品，并佐行氣、除濕、消痰、攻結(jié)、扶正，多用于治療正虛邪久不出的“積聚”“癥瘕”等病癥，被《肝硬化診治指南(2019版)》推薦使用。多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)有效[19-20]，但其藥效機(jī)制仍知之甚少，這也阻礙了鱉甲煎丸在臨床使用。本研究通過腹腔注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型。分別給予不同劑量的鱉甲煎丸灌胃。結(jié)果表明，CCl4組小鼠肝臟炎癥和纖維化程度明顯高于對照組，說明肝纖維化模型建立成功。通過鱉甲煎丸治療后，CCl4組肝細(xì)胞凋亡明顯減少，肝臟炎癥減輕。同時(shí)發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸能減輕HSCs活化，減少膠原沉積。

既往研究認(rèn)為，肝臟急慢性炎癥過程中，HSCs被活化，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，引起ECM分泌和降解失衡，導(dǎo)致肝纖維化[21]。近年來越來越多證據(jù)表明，單核細(xì)胞可以通過多種途徑活化HSCs和加重肝纖維化，被認(rèn)為是肝纖維化的“調(diào)控者”[22-25]。單核細(xì)胞可以分泌TGF-β1和PDGF促進(jìn)HSCs的活化、增殖，分泌ECM加重肝纖維化。同時(shí)還能分泌TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子通過NF-κB通路促進(jìn)活化的HSCs存活[3-4]。此外，單核細(xì)胞還能通過分泌血管內(nèi)皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，促進(jìn)病理性的血管生成[26-27]。因此，如何抑制單核細(xì)胞浸潤成為治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸灌胃給藥后，肝纖維化模型小鼠肝臟中PDGF、TGF-β1、TNF-α、IL-1β 等促炎促纖維化細(xì)胞因子明顯減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸灌胃小鼠肝臟中單核細(xì)胞浸潤減少。目前研究表明MCP-1是促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵因子[28-31]。本研究顯示鱉甲煎丸灌胃后，纖維化模型小鼠肝臟中MCP-1分泌減少。這些結(jié)果也提示，鱉甲煎丸可能是通過抑制MCP-1分泌減少單核細(xì)胞浸潤。

綜上所述，本研究證實(shí)了鱉甲煎丸的抗炎、抗纖維化作用，其機(jī)制可能與抑制單核細(xì)胞浸潤，進(jìn)而減少單核細(xì)胞相關(guān)促炎促纖維化細(xì)胞因子分泌有關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了以單核細(xì)胞為靶點(diǎn)治療肝纖維化的可能，同時(shí)揭示了鱉甲煎丸抗肝纖維化的部分機(jī)制。本研究有助于揭示鱉甲煎丸活血化瘀抗肝纖維化的科學(xué)內(nèi)涵，為其抗肝纖維化臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。