沉默TRPM2-AS對耐奧沙利鉑的結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的影響及機制研究*

王 丹，吳丹心，杜金鳳

(湖北省十堰市太和醫(yī)院腫瘤科 442000)

結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率呈增長趨勢，在全部惡性腫瘤中分別位居第3位和第5位[1]。 化療是結(jié)直腸癌的常用治療方法，但目前結(jié)直腸癌細胞易對化療藥物如奧沙利鉑(L-OHP)產(chǎn)生耐藥性，常導(dǎo)致化療失敗[2]。因此，探究影響結(jié)直腸癌耐藥性的分子機制對逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細胞耐藥性進而提高治療療效、改善患者預(yù)后具有重大意義。瞬時受體電位通道M2反義RNA(TRPM2-AS)是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)，其在結(jié)直腸癌細胞中表達上調(diào)，可通過與TAF15直接相互作用增強結(jié)直腸癌細胞的增殖能力[3]，但其對耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞惡性表型的影響及機制尚未可知。Starbase靶基因在線預(yù)測軟件顯示，TRPM2-AS可能靶向結(jié)合miR-22-3p。上調(diào)miR-22-3p可明顯阻礙結(jié)直腸癌細胞增殖，且促進細胞凋亡[4]。本研究通過構(gòu)建耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞HCT-8/L-OHP，旨在觀察TRPM2-AS對HCT-8/L-OHP增殖和凋亡的影響及其能否靶向miR-22-3p發(fā)揮作用，以期為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對L-OHP的耐藥性提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

結(jié)直腸癌細胞系HCT-8購自中國科學(xué)院上海細胞庫；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；PCR引物、TRPM2-AS小干擾RNA(si-TRPM2-AS)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-22-3p 模擬物(mimics)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-22-3p抑制劑(anti-miR-22-3p)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(cleaved-caspases-3)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建HCT-8/L-OHP細胞

參照文獻[5]方法，復(fù)蘇HCT-8細胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)期HCT-8細胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，用含2 μmol/L L-OHP培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，傳代。再次用含2 μmol/L L-OHP培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，傳代。重復(fù)上述步驟，1個濃度反復(fù)3～4次，逐步將L-OHP濃度提高至20 μmol/L，最終獲得能耐受20 μmol/L L-OHP的細胞株，并將其維持培養(yǎng)在含10 μmol/L L-OHP的完全培養(yǎng)液中，得到能夠在含10 μmol/L L-OHP的完全培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的人結(jié)直腸癌耐藥細胞株HCT-8/L-OHP。

1.2.2RT-qPCR法檢測TRPM2-AS和miR-22-3p表達

將HCT-8和HCT-8/L-OHP細胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗細胞2次，RNA抽提試劑提取細胞中總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴增。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。引物序列：TRPM2-AS上游引物5′-CGTGACCAGGTTCAGACACA-3′，下游引物5′-TGGGCAGTTTGGTTCTGGTT-3′；GAPDH上游引物5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，下游引物5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′；miR-22-3p上游引物5′-AAGCTGCCAGTTGAA GAACTGTA-3′，下游引物5′-GCTGTCAACGATA CGCTACGTAAC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算細胞中TRPM2-AS、miR-22-3p相對表達量。

1.2.3HCT-8/L-OHP細胞轉(zhuǎn)染

將HCT-8/L-OHP細胞接種至6孔板中，1.0×105/孔。培養(yǎng)12 h后，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-TRPM2-AS(si-TRPM2-AS組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-22-3p mimics(miR-22-3p組)、anti-miR-22-3p(anti-miR-22-3p組)、共轉(zhuǎn)染si-TRPM2-AS與anti-miR-22-3p(si-TRPM2-AS+anti-miR-22-3p組)。轉(zhuǎn)染24 h后，換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h后，RT-qPCR法檢測細胞中TRPM2-AS或miR-22-3p表達驗證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.2.2，并收集細胞備用。同時設(shè)置對照組(con組)，細胞不進行任何轉(zhuǎn)染操作，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖

將各組細胞接種至96孔板中，2.5×104/孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，在各孔中加10 μL CCK-8。孵育2 h后，酶標儀(λ=450 nm)檢測光密度(OD)值。

1.2.5克隆形成實驗

將各組細胞接種至6孔板中，1.0×104/孔，每2天更換1次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d后棄培養(yǎng)液。4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。PBS清洗，顯微鏡觀察，統(tǒng)計超過50個細胞的克隆。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將各組細胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，培養(yǎng)48 h后，收集細胞。將各組細胞PBS清洗2次，1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。加500 μL Binding Buffer重懸細胞，加10 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μL PI，混合均勻，室溫避光孵育5 min后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.7Western blot檢測細胞中cleaved-caspase3蛋白表達

將各組細胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，用RIPA裂解液提取細胞中總蛋白。經(jīng)BCA法檢測蛋白含量后，對其定量。然后行10% SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用cleaved-caspase3(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液在4 ℃冰箱中孵育過夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗在37 ℃搖床中孵育1 h。再次洗膜后，加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析cleaved-caspase3相對于GAPDH的表達量。

1.2.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

利用Starbase網(wǎng)站對TRPM2-AS和miR-22-3p的結(jié)合位點進行預(yù)測，同時利用基因定點突變技術(shù)將其結(jié)合位點突變，分別構(gòu)建含有結(jié)合位點、突變位點的野生型熒光素酶報告基因載體 (Wt-TRPM2-AS)與突變型載體(Mut-TRPM2-AS)，該過程由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。將HCT-8/L-OHP細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics與Wt-TRPM2-AS、miR-NC與Wt-TRPM2-AS，轉(zhuǎn)染12 h后，換為含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，收集細胞并裂解。經(jīng)3 500 r/min離心5 min后，取上清液，檢測熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HCT-8/L-OHP細胞中TRPM2-AS和miR-22-3p表達

HCT-8/L-OHP細胞中TRPM2-AS表達明顯高于HCT-8細胞(P<0.05)，而miR-22-3p表達明顯低于HCT-8細胞(P<0.05)。

2.2 沉默TRPM2-AS對HCT-8/L-OHP細胞增殖和凋亡的影響

si-TRPM2-AS組細胞中TRPM2-AS表達明顯低于si-NC組及con組(P<0.05)，沉默TRPM2-AS的HCT-8/L-OHP細胞構(gòu)建成功。con組、si-NC組和si-TRPM2-AS組細胞中miR-22-3p表達、OD48 h/72 h值、克隆形成數(shù)、細胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與con組和si-NC組比較，si-TRPM2-AS組細胞中OD48 h/72 h值、克隆形成數(shù)降低(P<0.05)，而miR-22-3p表達、細胞凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，見圖1。

A：si-TRPM2-AS轉(zhuǎn)染效果驗證；B：各組細胞miR-22-3p表達；C：各組細胞cleaved-caspase3蛋白表達；D：各組細胞凋亡情況；E：各組細胞增殖活性；F：各組細胞克隆形成情況；*:P<0.05,與con組比較;#：P<0.05，與si-NC組比較。圖1 沉默TRPM2-AS后HCT-8/L-OHP細胞增殖和凋亡情況

2.3 過表達miR-22-3p對HCT-8/L-OHP細胞增殖和凋亡的影響

miR-22-3p組細胞中miR-22-3p表達明顯高于miR-NC組及con組(P<0.05)，過表達miR-22-3p的HCT-8/L-OHP細胞構(gòu)建成功。con組、miR-NC組和miR-22-3p組細胞OD48 h/72 h值、克隆形成數(shù)、細胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與con組和miR-NC組比較，miR-22-3p組細胞OD48 h/72 h值和克隆形成數(shù)降低(P<0.05)，而細胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，見圖2。

A：miR-22-3p mimics轉(zhuǎn)染效果驗證；B：各組細胞增殖活性；C：各組cleaved-caspase3蛋白表達；D：各組細胞凋亡情況；E：各組細胞克隆形成情況；*：P<0.05，與con組比較;#：P<0.05，與miR-NC組比較。圖2 過表達miR-22-3p對HCT-8/L-OHP細胞增殖和凋亡的影響

2.4 TRPM2-AS和miR-22-3p靶向關(guān)系驗證

Starbase靶基因在線預(yù)測軟件顯示，TRPM2-AS和miR-22-3p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點，見圖3A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-22-3p與Wt-TRPM2-AS共轉(zhuǎn)染后HCT-8/L-OHP細胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與Mut-TRPM2-AS共轉(zhuǎn)染后HCT-8/L-OHP細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，TRPM2-AS可與miR-22-3p靶向結(jié)合，見圖3B。

A：TRPM2-AS和miR-22-3p的互補序列；B：熒光素酶活性檢測結(jié)果。圖3 TRPM2-AS靶向結(jié)合miR-22-3p

2.5 抑制miR-22-3p逆轉(zhuǎn)沉默TRPM2-AS對HCT-8/L-OHP細胞增殖和凋亡的影響

anti-miR-22-3p組細胞中miR-22-3p表達明顯低于con組(P<0.05)，抑制miR-22-3p表達的HCT-8/L-OHP細胞構(gòu)建成功。與con組比較，anti-miR-22-3p組細胞OD48 h/72 h值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05)，而細胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)。與si-TRPM2-AS組比較，si-TRPM2-AS+anti-miR-22-3p組細胞OD48 h/72 h值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05)，而細胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，見圖4。

A：anti-miR-22-3p轉(zhuǎn)染效果驗證；B：各組細胞增殖活性；C：各組cleaved-caspase3蛋白表達；D：各組細胞凋亡情況；E：各組細胞克隆形成情況；*：P<0.05，與con組比較;#：P<0.05，與si-TRPM2-AS組比較。圖4 抑制miR-22-3p逆轉(zhuǎn)沉默TRPM2-AS對HCT-8/L-OHP細胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

化療是結(jié)直腸癌臨床治療的常用方法，但由于腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生降低了化療療效，最終導(dǎo)致化療失敗。L-OHP是結(jié)直腸癌化療的一線藥物，降低結(jié)直腸癌細胞對L-OHP的化療抗性對改善患者預(yù)后具有重要意義。lncRNA在真核生物中廣泛存在，參與調(diào)控腫瘤細胞化療抗性。研究表明，lncRNA MIR600HG、lncRNA PVT1-214等多種lncRNA參與調(diào)控結(jié)直腸癌細胞L-OHP耐藥性，為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細胞L-OHP耐藥性提供了分子靶點[6-7]。

瞬時受體電位通道M2(TRPM2)是瞬時受體電位通道M型的一個亞型，在神經(jīng)細胞、心肌細胞、免疫細胞等細胞中廣泛表達。研究顯示，TRPM2是細胞內(nèi)氧化應(yīng)激感受器，參與調(diào)控活性氧生成、炎癥因子的產(chǎn)生及巨噬細胞功能[8]。TRPM2-AS是TRPM2的反義RNA，屬于lncRNA家族成員，其對腫瘤的發(fā)展進程具有重要調(diào)控作用。研究顯示，TRPM2-AS可促進胃癌[9]、肝癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]、非小細胞肺癌[13]等腫瘤細胞的惡性表型，進而促進腫瘤的發(fā)展進程。此外，TRPM2-AS在肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP中表達升高，敲低其表達可增強A549/DDP細胞對順鉑敏感性，并誘導(dǎo)細胞凋亡，為肺癌提供了新的治療靶點[14]。然而，還未見TRPM2-AS影響結(jié)直腸癌細胞對L-OHP耐藥性的相關(guān)報道。

本研究主要探究了TRPM2-AS對耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，TRPM2-AS在耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞中呈高表達，沉默其表達阻礙了耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞的增殖能力，同時加劇其細胞凋亡，提示TRPM2-AS可作為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對L-OHP耐藥性的分子靶點。caspase級聯(lián)反應(yīng)在細胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其中caspase3是caspase級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其在受到上游凋亡信號刺激后被活化，生成cleaved-caspase3，進而執(zhí)行細胞凋亡[15-16]。本研究結(jié)果顯示，沉默TRPM2-AS促進了耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞中cleaved-caspase3蛋白表達，提示TRPM2-AS可能通過直接或間接調(diào)控caspase級聯(lián)反應(yīng)來影響耐L-OHP結(jié)直腸癌細胞凋亡。

為進一步探究TRPM2-AS影響耐L-OHP結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的分子機制，本研究證實了TRPM2-AS可靶向結(jié)合miR-22-3p，且沉默TRPM2-AS促進細胞中miR-22-3p表達，說明TRPM2-AS靶向負調(diào)控miR-22-3p。研究顯示，miR-22-3p可分別通過抑制YWHAZ、NFIB和YAP1的表達來減弱結(jié)直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌細胞的惡性表型，對腫瘤發(fā)展起抑制作用[17-19]；miR-22-3p在耐L-OHP的胃癌組織和細胞系中均呈低表達，上調(diào)miR-22-3p可降低胃癌細胞L-OHP的耐藥性，miR-22-3p可作為逆轉(zhuǎn)胃癌對L-OHP耐藥性的分子靶點[20]。本研究結(jié)果顯示，耐L-OHP結(jié)直腸癌細胞中miR-22-3p表達降低，過表達miR-22-3p降低了細胞的增殖能力，并加劇了其凋亡，而抑制miR-22-3p具有相反作用，這提示miR-22-3p也參與調(diào)控結(jié)直腸癌細胞對L-OHP的耐藥性，其也可能成為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對L-OHP耐藥性的分子靶點。本研究還顯示，抑制miR-22-3p逆轉(zhuǎn)了沉默TRPM2-AS對L-OHP結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的影響，進一步提示TRPM2-AS可能通過靶向負調(diào)控miR-22-3p來調(diào)控耐L-OHP結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡。

綜上所述，TRPM2-AS在耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞中表達升高，而miR-22-3p表達降低；沉默TRPM2-AS可阻礙耐L-OHP的結(jié)直腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，其作用機制可能與靶向結(jié)合并負調(diào)控miR-22-3p有關(guān)，TRPM2-AS/miR-22-3p軸可能為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對L-OHP的耐藥性提供了分子靶點。但本研究尚存在不足之處，尚需對miR-22-3p下游靶基因及信號通路進行探究，且需要進一步在體內(nèi)驗證TRPM2-AS/miR-22-3p軸對結(jié)直腸癌L-OHP耐藥性的影響。