清脂化瘀顆粒調控Keap-1/Nrf2/ARE介導的氧化損傷抗動脈粥樣硬化的作用及機制研究

蔡 婉，周 華，葛 文，王 婧，池 浩

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是動脈的一種慢性炎癥性病變[1]。動脈粥樣硬化主要是巨噬細胞衍生的泡沫細胞在血管壁積累，炎癥反應[2]及氧化應激[3-4]反應出現(xiàn)在AS形成的各個階段。因此抗炎及抗氧化應激是治療AS的重要靶點。中醫(yī)認為，氣虛、痰濁和血液是AS的重要病理因素[5-6]。氣虛則血流不暢，脈道受阻，化瘀生痰，因此AS病機為本虛標實[7-8]。研究顯示，多種中藥單體具有改善血脂，抑制炎癥、抗氧化，抑制血液聚集等多種途徑改善AS[9-10]。清脂化瘀顆粒針對AS病因病機，以清熱解毒化瘀為法，前期研究顯示，清脂化瘀顆?？梢杂行p輕頸動脈粥樣硬化程度，穩(wěn)定斑塊，減輕炎癥及氧化應激反應。頸動脈斑塊超聲影像表現(xiàn)與既往研究相似[11],但其抗動脈粥樣硬化的具體分子機制尚不清楚。

維持機體氧化還原反應平衡需要很多調節(jié)因子共同作用，其中核因子E2相關因子-2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是主要調節(jié)因子[12-13]。正常情況下，Nrf2因子與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(ECH-associated protein-1，Keap-1)蛋白結合位于細胞質中，當氧化應激因子過多時，Nrf2與Keap-1解離，轉位與細胞核，與細胞核中抗氧化結合原件(Antioxidant responsive element，ARE)結合，從而通過此途徑激活機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，最終起到減輕氧化損傷作用。因此，Keap-1/Nrf2/ARE是機體重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[14-15]。本研究使用高脂飲食喂養(yǎng)的載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠作為主動脈粥樣硬化的動脈模型，觀察清脂化瘀顆粒是都通過調控Keap-1/Nrf2/ARE信號通路從而減輕氧化應激所導致的動脈粥樣硬化損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠30只，體重(20±2) g，C57BL/6野生雄性小鼠10只，體重(20±2) g。所有實驗動物均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(滬)2017-0011]。所有實驗動物飼養(yǎng)于室溫(25±1)℃，濕度(50±5)%的實驗動物中心，期間可自由飲食飲水。

1.2 動物模型制備與分組 所有動物適應性喂養(yǎng)1周后，將30只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組(ApoE-/-)，阿托伐他汀組(ApoE-/-+阿托伐他汀)，清脂化瘀顆粒組(ApoE-/-+清脂化瘀顆粒)。每日給予高脂飼料(購自于HFK生物科學公司)；8周后阿托伐他汀組與清脂化瘀顆粒組每日灌胃阿托伐他汀25 mg/(kg·d)及清脂化瘀顆粒130 mg/(kg·d)，連續(xù)4周；C57BL/6野生雄性小鼠10只作為對照組，每日灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.3 實驗藥物與試劑 清脂化瘀顆粒由虎杖6 g，炒黃芩9 g，黃精、冬葵子、刺山柑果實各10 g，生蒲黃12 g，六味中藥組成。由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院制劑室提供配方顆粒

1.4 血脂檢測 小鼠處死前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，靜置后，3500 r/min離心25 min，-80 ℃保存。采用全自動生化檢測儀檢測小鼠血清中總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)含量。

1.5 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和亞鐵離子(Fe2+)水平檢測 采用上述保存于-80 ℃環(huán)境的血清，嚴格按照所購試劑盒上的說明書檢測各組小鼠血清中SOD、MDA、GSH及Fe2+水平，記錄結果。

1.6 HE染色法主動脈組織學形態(tài)檢測 將實驗小鼠主動脈組織于4%多聚甲醛固定24 h后，根據(jù)HE染色常規(guī)方法進行，光學顯微鏡下觀察各小鼠主動脈組織形態(tài)。

1.7 Western blot蛋白印跡定量分析 全自動蛋白印跡定量分析系統(tǒng)檢測主動脈組織中Nrf2、Keap-1蛋白表達水平。取主動脈組織，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用PAGE電泳，將分離得到的蛋白通過濕法轉移到疏水性的聚偏二氟乙烯膜；用轉移到膜上的蛋白當作抗原，使之與第一抗體相結合后再與熒光標記的第二抗體雜交結合，最后通過底物顯色以檢測目的蛋白的表達水平。將導出的圖片用Image J軟件進行掃描，得到蛋白條帶灰度值，然后計算出每個蛋白條帶對應的蛋白表達量，將所得數(shù)值用Graph Pad Prism軟件繪制出不同蛋白表達量的統(tǒng)計圖。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析所得實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表述，兩組間比較采用方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清血脂水平比較 結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL含量均顯著升高，其中HDL含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，清脂化瘀顆粒組與阿托伐他汀組血清中TC、TG、LDL含量均顯著降低(P<0.01)。與阿托伐他汀組相比，清脂化瘀顆粒組血清中TG、TC、LDL含量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較(mmol/L)

2.2 各組小鼠主動脈組織形態(tài)學變化 與對照組相比，模型組、阿托伐他汀組、清脂化瘀顆粒組主動脈內(nèi)有較大斑塊形成；與模型組相比，阿托伐他汀組與清脂化瘀顆粒組主動脈內(nèi)膜斑塊明顯縮??；阿托伐他汀組與清脂化瘀顆粒組主動脈內(nèi)膜斑塊差異不明顯(圖1)。

A：對照組；B：模型組；C：阿托伐他汀組；D：清脂化瘀顆粒組

2.3 各組小鼠血清中SOD、MDA、GSH、Fe2+水平變化 結果顯示，與對照組相比，模型組血清中SOD、GSH水平顯著降低(均P<0.01)，MDA、Fe2+水平顯著升高(均P<0.01)；此外，與模型組相比，阿托伐他汀組、清脂化瘀顆粒組血清中SOD、GSH水平顯著升高(均P<0.01)，MDA、Fe2+水平顯著降低(均P<0.01)。與阿托伐他汀組相比，清脂化瘀顆粒組血清SOD、GSH、MDA水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，F(xiàn)e2+水平顯著下降(P<0.01)。見表2、3。

表2 各組小鼠炎癥因子水平比較

表3 各組小鼠血清中Fe2+濃度比較(mmol/L)

2.4 各組小鼠主動脈Nrf2、Keap-1蛋白表達水平比較 與對照組相比，模型組小鼠主動脈及斑塊內(nèi)，Keap-1水平升高；與模型組相比，阿托伐他汀組與清脂化瘀顆粒組小鼠主動脈及斑塊中Nrf2蛋白表達顯著增加，Keap-1水平顯著下降。阿托伐他汀組與清脂化瘀顆粒組兩組小鼠主動脈及斑塊中Nrf2及Keap-1蛋白表達無統(tǒng)計學差異。見圖2(表4)。

圖2 各組小鼠主動脈Keap-1、Nrf2蛋白的表達

表4 清脂化瘀顆粒對Keap-1、Nrf2蛋白表達的影響

3 討 論

本研究使用高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE基因敲除小鼠作為動脈粥樣硬化的動物模型，結果表明，清脂化瘀顆粒能通過上調Keap-1/Nrf2/ARE介導的抗氧化信號通路從而減輕氧化應激所致的動脈粥樣硬化。

動脈粥樣硬化是一種由機體脂質異常代謝驅動的動脈內(nèi)膜炎癥性疾病，是當代多發(fā)的腦梗死、心絞痛、心肌梗死等多種心腦血管疾病的病理基礎。脂質過氧化、斑塊內(nèi)出血和鐵沉積是晚期AS斑塊的特征[16]。多項近期的基礎研究表明，氧化應激過程導致的氧化型LDL生成所致血管舒張功能異常，是AS血管損傷的內(nèi)在基礎[17-18]。因此，提出維持細胞內(nèi)氧化還原過程平衡的治療策略對于抗動脈粥樣硬化保護心腦血管系統(tǒng)來說是至關重要的。而Keap-1/Nrf2/ARE信號通路是調控細胞氧化應激的重要信號通路，是維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調節(jié)者。Nrf2/ARE信號通路是細胞內(nèi)廣泛的細胞抗氧化途徑[19]。有研究顯示，Nrf2敲除的動物較正常動物更易受到氧化應激的毒害[20]。正常情況下，Keap-1/Nrf2/ARE抗氧化信號通路由Nrf2、ARE、Keap-1三個核心分子構成。Nrf2作為核轉錄因子，可對外界化學物質和自由基刺激發(fā)生防御性響應。Nrf2蛋白在體內(nèi)半衰期較短，正常時Nrf2與Keap-1蛋白結合錨定在細胞質中，并因Keap-1經(jīng)Cul3途徑不斷被泛素化降解，因此自由少數(shù)Nrf2能進入細胞核發(fā)揮促基因表達的功能。當Keap-1的氨基酸殘基受到ROS等親電性較強的物質攻擊后，Nrf2可以從Keap-1上解離。Nrf2向細胞內(nèi)擴散，與ARE結合，啟動下游抗氧化蛋白、解毒酶等基因表達，從而發(fā)揮抵抗作用[21]。

Vinchi等[22]研究表明細胞鐵死亡機制可以減輕小鼠主動脈內(nèi)皮細胞脂質過氧化和AS。鐵死亡相關蛋白受Nrf2水平調控，通過與Keap-1-Nrf2解體，活化的Nrf2激活調控下游鐵死亡相關蛋白表達，從而保護細胞免受過度的氧化應激損傷[23]。因此，Keap-1/Nrf2/ARE在動脈粥樣硬化抗氧化機制中發(fā)揮重要作用。鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞程序性死亡方式，其特征表現(xiàn)為細胞抗氧化能力降低，導致過氧化脂質水平過度增高，致死性積累。

本研究的結果表明，與模型組相比，阿托伐他汀組及清脂化瘀顆粒組小鼠主動脈組織中Nrf2蛋白表達增加，Keap-1含量減少，血清中氧化應激因子減少，表明清脂化瘀顆粒抗動脈粥樣硬化作用可能是通過激活Keap-1/Nrf2/ARE信號通路，上調Ntf2水平，過量的Nrf2從細胞質轉移入細胞核內(nèi)，與ARE結合，啟動下游基因表達，從而上調SOD、GSH水平，下調MDA，從而實現(xiàn)其抗氧化應激的作用，減輕動脈粥樣硬化的損傷。此外，此次研究測定了Fe2+含量，我們研究發(fā)現(xiàn)，與模型組、阿托伐他汀組相比，清脂化瘀顆粒組Fe2+含量顯著下降，因此，清脂化瘀顆粒可能是通過減少鐵蓄積及脂質過氧化從而達到抗動脈粥樣硬化作用。因此，抑制血管內(nèi)皮內(nèi)細胞鐵死亡可能是清脂化瘀顆?？箘用}粥樣硬化的潛在機制。