正交試驗(yàn)篩選牛大力最佳切制工藝

李 健 王 倩 周改蓮*

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

牛大力為豆科植物美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspeciosaChamp.的干燥塊根[1]，別名山蓮藕、血藤、牛古大力、九龍串珠、大力薯[2]，分布于廣東、廣西、海南等地,在廣西梧州、玉林、百色、南寧、欽州等地均有產(chǎn)[3]，也是廣西壯族和仫佬族民間常用的草藥[4]。炮制是處理中藥的一種傳統(tǒng)技術(shù)，也是中醫(yī)用藥的特點(diǎn)，目前對(duì)于牛大力炮制的研究和記載甚少。藥材進(jìn)行炮制時(shí)必須具合適炮制的形態(tài)，而牛大力根是根莖類藥材，進(jìn)行炮制處理時(shí)一般切片，切片薄，在炮制過(guò)程中易破碎，從而影響飲片外觀和價(jià)格。反之，切片厚，在炮制處理過(guò)程中又難達(dá)到所需的效果，導(dǎo)致藥材炮制不均勻，影響藥材療效?，F(xiàn)在市面上牛大力多以整根和斜段為主，少見(jiàn)適用于炮制處理的片，因此對(duì)牛大力切制工藝進(jìn)行探索具有重要意義，也能為今后牛大力飲片生產(chǎn)和炮制研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-1780型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津儀器有限公司)；CPA225D型和SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；DFY-500型中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 材料 硫酸(批號(hào)：20161202，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(批號(hào)：2017122101，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；亞硝酸鈉(批號(hào)：2016040191)和氫氧化鈉(批號(hào)：2017102003)天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁(批號(hào)20170514，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：wkq16101104)和葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：wkq16082202)購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；牛大力原藥材購(gòu)自玉林市玉州區(qū)喜運(yùn)中藥材購(gòu)銷部。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 牛大力多糖供試品溶液制備 取牛大力樣品0.5 g，精密稱定，置于500 mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇100 mL，冷凝回流1 h，過(guò)濾，取濾渣和濾紙置于圓底燒瓶中，加入100 mL水，沸水浴1 h，過(guò)濾，取濾液25 mL置于50 mL容量瓶中，定容至刻度，即得牛大力多糖供試品溶液。

2.1.2 牛大力總黃酮供試品溶液制備 取牛大力樣品1.0 g，精密稱定，置于25 mL具塞錐形瓶中，稱重，精密移入60%乙醇10 mL，密封，超聲 45 min，取出，放至室溫，60%乙醇補(bǔ)重，搖勻后抽濾，取濾液，即得牛大力總黃酮供試品。

2.1.3 牛大力煎出物供試品制備 取牛大力樣品2 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入純水50 mL，稱定重量，靜置1 h，接入冷凝回流裝置，加熱至沸騰，保持微沸狀態(tài)1 h，取出，放置室溫，用水補(bǔ)重，搖勻，過(guò)濾，精密移取濾液25 mL，置于干燥恒重的蒸發(fā)皿中，沸水浴揮干，即得牛大力煎出物。牛大力煎出物的測(cè)定參照藥典通則2201(浸出物測(cè)定法之水溶性浸出物測(cè)定法：熱浸法)[5]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取葡萄糖對(duì)照品33.30 mg，置于100 mL潔凈容量瓶中，加入適量水，超聲溶解，放置室溫后，加水定容至刻度，既得濃度為0.33 mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品25.15 mg，置于25 mL潔凈容量瓶中，先加入適量60%乙醇，超聲溶解后，放置室溫，加60%乙醇定容刻度，既得濃度為1.01 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。

2.3 顯色法及最大吸收波長(zhǎng)選擇

2.3.1 牛大力多糖供試品顯色法及吸收波長(zhǎng)的選擇 取葡萄糖對(duì)照品溶液和牛大力多糖供試品溶液，各1 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加水至2 mL，搖勻，加入0.2%蒽酮-硫酸溶液至 10 mL，搖勻，冷卻后沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min；以相對(duì)應(yīng)溶液為空白對(duì)照，在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，牛大力多糖供試品在波長(zhǎng)583 nm處有最大吸收，因此選擇 583 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 牛大力總黃酮供試品顯色法及吸收波長(zhǎng)的選擇 取蘆丁對(duì)照品溶液和牛大力總黃酮供試品溶液，各3 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入濃度為5%的NaNO2溶液1 mL，混勻，靜置 6 min，加入濃度為10% 的Al(NO3)3溶液1 mL，混勻，靜置6 min，加入濃度為4% 的NaOH溶液10 mL，再用30%乙醇溶液定容至刻度，混勻，靜置15 min；以相對(duì)應(yīng)溶液為空白對(duì)照，在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。牛大力總黃酮供試品溶液在409 nm處有吸收峰，因此選擇483 nm作為牛大力總黃酮測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 線性關(guān)系考察

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL，分別置于10 mL潔凈具塞試管中，加水至2 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下顯色法顯色，以相對(duì)應(yīng)溶液為空白對(duì)照，在波長(zhǎng) 583 nm 處測(cè)定其吸光度分別為0.1893、0.3711、0.5309、0.6977、0.8639、1.0298，以葡萄糖對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.5017X+0.029(R=0.9999)，即濃度在0.3330～1.9980 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確移取“2.2.2”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、4.0 mL、6.0 mL和8.0 mL，分別置于10 mL潔凈的容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得不同濃度的蘆丁對(duì)照品溶液。分別取3 mL不同濃度對(duì)照品溶液分別置于25 mL容量瓶中，按“2.3.2”項(xiàng)下顯色方法顯色，以相對(duì)應(yīng)溶液為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)483 nm處測(cè)定吸光度值分別為0.0654、0.1377、0.2123、0.5346、0.8334、1.0881，以蘆丁對(duì)照品濃度作為橫坐標(biāo)x，吸光度值作為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.3576x+0.0006(R=0.9998)，即濃度在0.0503～0.8048 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 藥材處理 鑒于中藥材切制過(guò)程中可能會(huì)影響到藥材有效成分含量的三個(gè)主要因素分別是蒸潤(rùn)時(shí)間、切片厚度和干燥溫度，結(jié)合前期單因素分析結(jié)果，采用正交試驗(yàn)對(duì)蒸潤(rùn)時(shí)間(A)、切片厚度(B)和干燥溫度(C)進(jìn)行考察，因素水平表如1，選擇了L9(34) 正交表，并按照正交表進(jìn)行樣品處理?xiàng)l件如表2。

表1 切制工藝考察因素水平表

表2 牛大力藥材處理?xiàng)l件表

2.6 多糖、總黃酮和煎出物測(cè)定

2.6.1 多糖含量測(cè)定 稱取不同處理牛大力粉末，每個(gè)樣品取3份，每份0.5 g，精密稱定，共27份，按“2.1.3”項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行牛大力多糖供試品制備，再按 “2.3.1”項(xiàng)下顯色方法顯色，在波長(zhǎng)582 nm處測(cè)定其吸光度，通過(guò)繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算器多糖含量，同一份樣品取平均值作為該樣品多糖含量，得出1～9號(hào)樣品中多糖含量依次為41.46%、46.95%、40.16%、35.50%、36.17%、39.14%、36.30%、35.17%和35.86%。

2.6.2 總黃酮含量測(cè)定 稱取不同處理牛大力粉末，每個(gè)樣品取3份，每份1.0 g，精密稱定，共27份，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行牛大力總黃酮供試品制備，再按“2.3.2”項(xiàng)下顯色方法顯色后，在波長(zhǎng)483 nm處測(cè)定其吸光度，通過(guò)繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量，同一份樣品取平均值作為該樣品總黃酮含量，得出1～9號(hào)樣品中總黃酮含量依次為0.45%、0.48%、0.44%、0.38%、0.33%、0.34%和0.32%。

2.6.3 煎出物含量測(cè)定 稱取不同處理牛大力粉末，每個(gè)樣品取3份，每份2.0 g，精密稱定，共27份，按“2.1.3”項(xiàng)下煎出物含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，同一份樣品取平均值作為該樣品煎出物含量，得出樣品1～9號(hào)樣品中煎出物含量依次為13.46%、11.00%、18.35%、11.54%、8.18%、11.09%、10.95%、10.40%和14.95%。

3 結(jié)果分析

3.1 測(cè)定指標(biāo)的綜合評(píng)分規(guī)則及綜合評(píng)分結(jié)果 通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)牛大力成分的研究主要集中在總黃酮和多糖類化合物的研究方面，且藥理研究方面也主要以總黃酮、多糖和水煎液的藥理活性研究為主，考慮到水煎液中含有總黃酮和多糖成分，因此設(shè)置權(quán)重系數(shù)為：多糖權(quán)重系數(shù)0.4、總黃酮權(quán)重系數(shù)0.4和煎出物權(quán)重系數(shù)0.2，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)按以下方法進(jìn)行計(jì)算：

M1為牛大力中多糖含量；

M1′為牛大力中多糖含量最大值；

M2為牛大力中總黃酮含量；

M2′為牛大力中總黃酮含量最大值;

M3為牛大力煎出物含量；

M3′為煎出物含量最大值。

根據(jù)上述計(jì)算公式，結(jié)合多糖、總黃酮和煎出物含量三個(gè)指標(biāo)，對(duì)正交條件下處理的9個(gè)樣品進(jìn)行綜合評(píng)分，得出1～9號(hào)樣品綜合得分依次為87.49、 92.25、 90.88、 74.49、 72.33、 77.10、 70.36、 69.63和73.51。

3.2 正交結(jié)果 基于對(duì)正交條件處理后9個(gè)牛大力樣品中多糖、總黃酮和煎出物含量的測(cè)定及綜合評(píng)分結(jié)果繪制牛大力切制正交試驗(yàn)結(jié)果表(表3)，通過(guò)IBM SPSS Statistics 21進(jìn)行方差分析結(jié)果如表4。

表3 牛大力切制正交試驗(yàn)結(jié)果表

表4 牛大力切制正交試驗(yàn)方差分析

由表3可知，3個(gè)因素對(duì)牛大力切制工藝影響程度依次為：A(蒸潤(rùn)時(shí)間)>B(切片厚度)>C(干燥溫度)，而各個(gè)因素不同水平的影響程度依次為：A1>A2>A3，B3>B2>B1，C2>C1>C3。由表4可知，因素A(蒸潤(rùn)時(shí)間)對(duì)牛大力切制工藝測(cè)定指標(biāo)的綜合性評(píng)分有顯著性影響(P<0.05)，而因素B(切片厚度)和C(蒸潤(rùn)時(shí)間)對(duì)牛大力切制工藝測(cè)定指標(biāo)的綜合性評(píng)分沒(méi)有顯著性影響(P>0.05)，結(jié)合上述正交試驗(yàn)結(jié)果分析，牛大力最佳切制工藝應(yīng)為A1B3C2，即蒸潤(rùn)10 min，切3 mm片，60 ℃烘干。