利普斯他汀高產(chǎn)菌株毒三素鏈霉菌AP617-N12CA的全基因組測序與分析

李輝 方志鍇 郭霞凌,*

(1 大邦(湖南)生物制藥有限公司，長沙 410221；2 福建省微生物研究所，福州 350007)

利普斯他汀(lipstatin)是由毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)產(chǎn)生的一種具有良好抑制脂肪酶活性的天然產(chǎn)物，其氫化還原產(chǎn)物奧利司他(orlistat)化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定，是目前全球唯一的OTC減肥藥和非中樞神經(jīng)減肥藥[1-2]。以lipstatin為關(guān)鍵前體的發(fā)酵半合成技術(shù)是目前制備orlistat的主要方法，有關(guān)lipstatin的生物合成途徑解析與菌種選育一直是該領(lǐng)域的研究熱點[3-4]。由于lipstatin生物合成途徑復(fù)雜且產(chǎn)生多種副產(chǎn)物和結(jié)構(gòu)類似物，導(dǎo)致發(fā)酵單位產(chǎn)量較低且下游提取精制十分繁瑣[5-6]。因此，構(gòu)建高產(chǎn)低雜的生產(chǎn)菌株，提高工業(yè)化生產(chǎn)水平，是目前亟待解決的關(guān)鍵問題。然而lipstatin完整的生物合成途徑與調(diào)控機制至今未全面闡明，從而無法找到合適的靶基因?qū)ζ洚a(chǎn)生菌進行代謝工程定向改造[7-8]。通過對S.toxytricini進行全基因組測序，有助于從分子水平上了解其遺傳變異規(guī)律、重要代謝途徑和調(diào)控機制，可為高效基因工程菌株的構(gòu)建提供豐富、可靠的遺傳信息。

隨著基因測序技術(shù)的不斷迭代更新，越來越多的微生物基因組序列被破譯[9]。然而，由于二代測序技術(shù)讀長較短、高重復(fù)序列無法跨越、高GC區(qū)域無法準確測定等原因，很多已完成測序的微生物基因組中往往含有數(shù)目不等的空缺區(qū)域(gap)[10]?；蚪M空缺區(qū)域中可能存在重要的遺傳信息，如果不能補齊所有的gap，不僅無法獲得完整的基因組圖譜，還會給后續(xù)關(guān)鍵信息解讀(基因調(diào)控、SNP分析、比較基因組分析等)造成很大困難[11]。三代測序技術(shù)由于其超長的測序讀長和無GC偏好性，不僅可以克服以上部分難題，還可以得到零gap基因組完成圖，但目前三代測序在堿基讀取準確度上較二代測序差。三代聯(lián)合二代測序技術(shù)可克服兩者的缺點，從而獲得更準確、更深入的基因組數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果。

本研究采用三代單分子測序長讀長與二代測序糾錯相結(jié)合的方式，對liptatin工業(yè)生產(chǎn)菌株毒三素鏈霉菌AP617-N12CA(S.toxytriciniAP617-N12CA )進行全基因組序列測定，不僅獲得了AP617-N12CA的染色體全基因序列信息，還首次發(fā)現(xiàn)了一個長約0.61Mbp線型質(zhì)粒。通過對染色體基因組和線型質(zhì)粒進行基因功能注釋和次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測，從線型質(zhì)粒上定位了lipstatin生物合成基因簇，為AP617-N12CA的功能基因組學(xué)研究和代謝調(diào)控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

本研究所采用的菌株S.toxytriciniAP617-N12CA為lipstatin工業(yè)化生產(chǎn)菌株，由大邦(湖南)生物制藥有限公司保藏。搖瓶種子培養(yǎng)基：甘油2.0%，酵母提取物0.6%，黃豆餅粉2.0%，蒸餾水配置，pH6.5。YEME培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，酵母提取物0.3%，麥芽提取物0.3%，葡萄糖1.0%，蒸餾水配置，pH7.5。

1.2 基因組DNA提取

取少量AP617-N12CA孢子懸液接種于搖瓶種子培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)36 h，然后以1%的接種量接種于YEME培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。離心收集菌絲體，提取AP617-N12CA基因組DNA[12]，使用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度計對提取的基因組DNA進行濃度測定，然后進行0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3 基因組測序與拼接

對質(zhì)量和濃度測定合格樣品進行基因組測序，由北京百邁克生物技術(shù)有限公司同時進行Illumina二代測序和ONT三代測序。三代原始數(shù)據(jù)經(jīng)去除測序數(shù)據(jù)中的接頭序列和低質(zhì)量序列后，得到總的數(shù)據(jù)集。使用Canu v1.5 (http://github.com/marbl/canu) 軟件[13]對過濾后的subreads進行從頭組裝，通過Racon v3.4.3軟件利用三代subreads對組裝結(jié)果進行矯正。通過Circlator v1.5.5軟件進行環(huán)化和調(diào)整起始位點，采用Pilon v1.22軟件利用二代數(shù)據(jù)進一步進行糾錯，最終獲得準確度更高且不存在gap的完成圖序列進行后續(xù)分析。

1.4 基因預(yù)測與注釋

通過軟件Prodigal v2.6.3 (https://github.com/hyattpd/Prodigal/) 進行基因預(yù)測[14]。根據(jù)預(yù)測得到的 CDS 位置信息提取氨基酸序列，與COG/KOG數(shù)據(jù)庫[15]、KEGG數(shù)據(jù)庫[16]、Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫、NCBI-Nr數(shù)據(jù)庫和CAZy碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫等進行蛋白質(zhì)同源序列比對，完成基因注釋。

1.5 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

利用次級代謝產(chǎn)物編碼基因成簇存在的特點，采用在線軟件AntiSMASH[17]和NRPSpredictor[18]預(yù)測AP617-N12CA中的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，并分析可能合成的代謝產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 S.toxytricini AP617-N12CA基因組提取

對提取得到總量為200 μL的基因組進行凝膠電泳檢測(圖1)，樣品主條帶清晰，存在輕度降解，DNA 樣品濃度測定經(jīng)NanoDrop定量檢測，樣品濃度為48.9 ng/ μL，符合測序要求。

2.2 S.toxytricini AP617-N12CA基因組特征

采用ONT測序與Illumina測序相結(jié)合的方式對AP617-N12CA進行全基因組測序，最終組裝得到完整的零gap基因組序列，包含兩個大小不等的線型復(fù)制子。其中一條可以確定為染色體，而另一條可能為游離質(zhì)粒，暫將其命名為復(fù)制子2。AP617-N12CA基因組總長6985682 bp，GC含量為73.76%，預(yù)測含6134個基因，預(yù)測基因序列總長度6119307 bp，預(yù)測基因平均長度997 bp，長度最長的基因長度為18252 bp。其中染色體大小為6375543 bp，占基因組全長的91.3%，預(yù)測含5680個蛋白編碼基因。與其他已測序的鏈霉菌染色體大小(8.5～9.0 Mb)相比，S.toxytricini的染色體相對較小，僅約6.38 Mb。復(fù)制子2長610139 bp，占基因組全長的8.7%，預(yù)測出454個蛋白編碼基因。

根據(jù)Bentley等[19-20]提出的關(guān)于區(qū)分染色體和巨型質(zhì)粒的理論依據(jù)并非根據(jù)它們攜帶的復(fù)制相關(guān)基因，而是判斷它們是否是宿主生長所必需的以及是否攜帶rRNA操縱子。本研究通過對這條6.1 Mb的線型復(fù)制子中的編碼基因進行預(yù)測來判斷它是否為AP617-N12CA的生長所必需的元件。結(jié)果表明，主代謝過程必需的rRNA及tRNA編碼基因無一例外地全部存在于染色體中(RNA預(yù)測結(jié)果顯示該菌染色體上含有72個tRNA基因和21個rRNA基因)。此外，通過對復(fù)制子2上的基因組序列進行預(yù)測分析，預(yù)測結(jié)果顯示的編碼基因都不是AP617-N12CA初級代謝必需的遺傳因子，說明復(fù)制子2并不是AP617-N12CA細胞正常生命活動所必需的?；谏鲜鼋Y(jié)果，本研究推斷AP617-N12CA中的兩個線型復(fù)制子，較大的為染色體，較小的為線型質(zhì)粒，將其命名為pDBSW178，AP617-N12CA基因組完成圖如圖2所示。

2.3 S.toxytricini AP617-N12CA基因組功能注釋

采用本地Blastp的方法對AP617-N12CA進行COG，KEGG，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫比對注釋。COG數(shù)據(jù)庫共注釋到6134開放閱讀框編碼可能具有一定功能的蛋白質(zhì)，分為A～Z類，各基因數(shù)量和比例見圖3。在這些進行COG分類的CDS中，除一般功能(general function prediction only)基因516個和未知功能(function unknown)基因1119個外，主要集中在能量代謝與轉(zhuǎn)換(energy production and conversion)基因264個、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝(amino acid transport and metabolism)基因337個、碳水化合物運輸和代謝(carbohydrate transport and metabolism)基因263個、轉(zhuǎn)錄(transcription)基因395個。其中次級代謝產(chǎn)物的生物合成、運輸和分解代謝(secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)基因132個，這些將是研究lipstatin生物合成與代謝調(diào)控的重點。KEGG富集分析顯示如圖4，對應(yīng)到KEGG pathway的2109個基因，富集在123條代謝通路中，其中涉及基因最多的通路主要有：氨基酸生物合成代謝途徑(biosynthsis of amino acids，158個基因)、碳源代謝途徑(carbon metabolism，144個基因)和ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(ABC transporters, 108個基因)。可能與lipstatin及其結(jié)構(gòu)類似物有關(guān)的通路有：支鏈氨基酸降解途徑(valine, leucine and isoleucine degradation, 38個基因)、脂肪酸合成途徑(fatty acid biosynthesis，30個基因)、脂肪酸降解途徑(fatty acid degradation，29個基因)等，這些基因也是研究lipstatin生物合成與代謝調(diào)控的重點。Swiss-Prot是含有詳細注釋內(nèi)容的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，經(jīng)注釋基因準確度高。AP617-N12CA中共2847條蛋白序列得到Swiss-Prot注釋，這些為后續(xù)該菌的功能基因組學(xué)研究提供了極大的便利。

2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇分析

通過次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的在線預(yù)測工具antiSMASH對AP617-N12CA基因組中可能編碼的次級代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的基因簇進行了預(yù)測。共識別出22個可能的基因簇，其中18個位于染色體中，4個位于線型質(zhì)粒中(表1)。在22個基因簇中，其中8個包含PKS、NPRS或雜合的PKS -NPRS，剩余的基因簇中，6個可能與萜類(terpene)分子生物合成有關(guān)，3個可能與鐵載體(siderophore)生物合成有關(guān)。AP617-N12CA染色體中識別出的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇總長度為534381 bp，只占染色體基因組的8.38%；而線型質(zhì)粒識別出的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇總長度為215998 bp，在線型質(zhì)粒基因組中占比高達35.4%，說明在線型質(zhì)粒上包含了高密度的次級代謝產(chǎn)物合成基因。

表1 S.toxytricini AP617-N12CA基因組中預(yù)測的生物合成基因簇Tab.1 Predicted biosynthesis clusters in S.toxytricini AP617-N12CA

另外，在antiSMASH預(yù)測結(jié)果分析時筆者意外發(fā)現(xiàn)，由lstA、lstB、lstC、lstD、lstE和lstF等呈簇分布的基因組成的lipstatin生物合成基因簇(cluster 22)并不位于染色體基因組中，而是分布在線型質(zhì)粒的右臂區(qū)域。對AP617-N12CA中l(wèi)ipstatin生物合成基因簇通過GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)現(xiàn)AP617-N12CA中l(wèi)ipstatin生物合成基因簇與S.globosusstarin LHZ-48中相應(yīng)序列在基因組成和排列順序上均具有高度同源性(基因簇同源性高達94.39%)，暗示lipstatin生物合成基因簇具備在不同菌株間穿梭或水平轉(zhuǎn)移的可能性。

3 討論

三代單分子實時測序測序讀長可達到20 kb，測序過程不需要PCR擴增，是目前高比例重復(fù)序列、高雜合度、極端GC含量基因組測序的理想平臺，三代和二代測序技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用解析微生物全基因序列將成為主流。本研究運用ONT三代測序和Illumina二代測序兩種測序技術(shù)相結(jié)合的方法對AP617-N12CA進行了全基因組的測序，首次獲得了S.toxytricini基因組完成圖。AP617-N12CA全基因組長度為6985682 bp，GC含量73.76%，包含6134個預(yù)測編碼蛋白。同時對組裝的基因組進行了基因預(yù)測、功能注釋和聚類分析，進一步預(yù)測了次級謝產(chǎn)物生物合成基因簇。最終獲得的這些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)有益于從分子水平上認識AP617-N12CA的生理功能、代謝特性和高產(chǎn)機理，同時對lipstatin的生物合成途徑與調(diào)控機制的研究具有一定的參考價值。

鏈霉菌作為一類重要的工業(yè)微生物，能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的活性天然產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤藥物和免疫抑制劑等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等[21]。多數(shù)鏈霉菌的菌株中帶有質(zhì)粒[22]，目前已報道的大多數(shù)鏈霉菌抗生素生物合成基因簇定位于染色體上，只有極少數(shù)抗生素的生物合成基因簇存在于游離狀態(tài)的質(zhì)粒上[23]，如天藍色鏈霉菌S.coelicolorA3(2)菌株中的次甲霉素A 生物合成基因簇位于長度350 kb的巨型線型質(zhì)粒SCP1質(zhì)粒上[24]，婁徹鏈霉菌S.rochei中的卡殺菌素類抗生素(lankacidins)生物成合成基因簇位于長度200 kb的線型質(zhì)粒pSLA2-L上[25]。本研究在對重要工業(yè)微生物S.toxytriciniAP617-N12CA進行全基因組測序時，首次發(fā)現(xiàn)和描述了一個長為610139 bp的線型質(zhì)粒pDBSW178，質(zhì)粒上匯聚了多個合成編碼次級代謝產(chǎn)物的基因簇，AP617-N12CA主要次級代謝產(chǎn)物lipstatin生物合成基因簇也定位于pDBSW178上。后續(xù)進一步對線型質(zhì)粒pDBSW178的檢測與分離、復(fù)制機理和端粒結(jié)構(gòu)等進行深入系統(tǒng)研究，不僅有助于開發(fā)出新型的鏈霉菌線型載體系統(tǒng)，還可為lipstatin優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株的構(gòu)建與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，并為lipstatin的高效異源生物合成提供研究思路。