細菌ClpP蛋白酶功能及其抗菌藥物靶點的研究進展

顏驪穎 張亞培 董世雷,*

(1 浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，杭州 310053；2 浙江醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，杭州 310013)

能量依賴型蛋白酶或蛋白酶復合物是細胞中最常見的蛋白降解系統(tǒng)，在其對蛋白降解的過程中，通常依靠AAA+超家族(ATPases associated with various cellular activities)中的ATP酶(ATPase)水解ATP提供能量[1]。在AAA+超家族蛋白中至少存在10種不同類型的ATP酶(ClpA，ClpB，ClpC，ClpD，ClpE，ClpL，ClpM，ClpN，ClpX和ClpY)[2-3]，它們可被分為兩類：一類分子量較大，含有兩個典型ATP結合結構域，如ClpA，ClpB，ClpC，ClpD，ClpE和ClpL；另一類分子量較小，僅含一個ATP結合結構域，如ClpM，ClpN，ClpX和ClpY。到目前為止，發(fā)現ClpA，ClpC，ClpE和ClpX可以與ClpP蛋白酶結合形成蛋白酶復合物ClpAP，ClpCP，ClpEP，ClpXP或ClpAPX，而ClpY(又稱HslU)可與ClpQ(又稱HslV)蛋白酶結合形成蛋白酶復合物ClpYQ(HslUV)。在ATP酶水解ATP提供能量的前提下，蛋白較容易地被ClpP或ClpQ降解。ClpP和ClpQ均屬于Ntn水解酶超家族(N-terminal nucleophile hydrolase superfamily)，該超家族蛋白通常借助其N-末端的親核氨基酸自催化而活化，即N-末端氨基充當質子受體激活位于Ser或Thr殘基上的親核性羥基或Cys殘基上的親核性巰基，繼而對底物進行親核攻擊，使其水解。

細菌AAA+蛋白酶在不同細菌中的分布略有差異，如ClpAP，ClpXP和ClpYQ多分布于革蘭陰性菌中[4-6]，而ClpCP和ClpEP多分布于革蘭陽性菌中[7-10]，如枯草芽胞桿菌、變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。本文將主要討論細菌ClpP的結構及分子功能、在不同細菌中的作用以及基于細菌ClpP的抗菌藥物研發(fā)方面的研究進展。

1 細菌ClpP的結構及分子功能

細胞內蛋白質的水解與細胞功能密切相關。在細胞中，即使無基因突變和蛋白翻譯錯誤，也有超過三分之一的新合成的蛋白質不能正確折疊，其中被正確折疊且有正常功能的蛋白也極易因不利環(huán)境因素如熱休克、滲透壓、氧化應激和氧自由基等而受損[11]。當這些折疊不完全的、受損的蛋白積累到一定程度后，將會導致細胞死亡，故蛋白質的降解與蛋白質的合成同等重要，它們在細胞生命周期中發(fā)揮著至關重要的作用。在蛋白質降解過程中，AAA+超家族中的ATP酶可通過水解ATP提供水解蛋白過程中所需的能量。ClpP是一種絲氨酸蛋白酶，其活性位點位于其桶狀蛋白水解室內，當它與AAA+超家族ATP酶或Clp/Hsp100分子伴侶(Clp-ATPase)結合時，可以水解多種類型的蛋白質，維持細胞內新陳代謝動態(tài)平衡[12]。

細菌AAA+ ATPase-ClpP蛋白酶復合物的結構與真核生物26S蛋白酶體相似，由ATP酶(或分子伴侶)和ClpP蛋白酶組合而成，其中ATP酶(如ClpA、ClpC、ClpE和ClpX等)可組成同源多聚體，負責蛋白底物的識別和解折疊，決定ClpP蛋白酶的底物特異性，并將底物轉運至蛋白酶催化室中降解，在催化室中，ClpP可利用內部活性位點將底物降解成多肽小片段。在AAA+ATPase-ClpP蛋白酶復合物中，ATP酶可自行裝配成同源六聚體，ClpP可寡聚體化后形成內部含有14個催化活性位點的同源七聚體，共同組成桶狀蛋白酶復合物ClpAP、ClpCP、ClpEP、ClpXP或ClpAPX。底物蛋白經降解，將被水解為5～10個氨基酸殘基組成的短肽[12]。

ClpP可相互聚集形成由兩個縱向排列的同源七聚體組成的十四聚體型圓柱體，七聚體環(huán)的軸向孔隙是水解室的入口，形成蛋白質水解室[13]，如圖1所示，Clp分子伴侶可以結合在ClpP十四聚體型圓柱體的兩端，在分子伴侶捕獲到折疊不完全的、受損的目標蛋白后，在水解ATP提供能量的前提下將底物蛋白去折疊，然后通過七聚體環(huán)的軸向孔隙將去折疊的底物蛋白轉移至ClpP水解室內，然后將去折疊的底物蛋白水解為小肽段，接著ClpP蛋白分子構象改變，打開側邊赤道面孔道(equatorial side pores)釋放水解產物。

研究表明，缺失N-端前段的10～17個氨基酸后，大腸埃希菌ClpP能夠快速降解去折疊的大分子底物，該降解不依賴于分子伴侶的輔助[15]，提示ClpP軸向孔的開放與ClpP的N-端結構域有關。因此，沒有ATP酶時，ClpP的N-端區(qū)域必須維持關閉的狀態(tài)，防止蛋白底物進入ClpP的水解室。結合分子伴侶后，進入ClpP水解室的蛋白分子主要由分子伴侶決定，ClpX含有3個重要結構域，依次為：參與底物識別的家族特異性N-端功能結構域、AAA+功能結構域和C-端功能結構域[16]。分子伴侶能誘導ClpP N-端結構域的構象改變，有利于大分子去折疊蛋白底物的轉移。

據文獻報道，ClpP具有多個亞型，在結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)中，同一操縱子中同時編碼ClpP1和ClpP2兩個亞型的蛋白，這兩種蛋白異構體可形成一個由ClpP1和/或ClpP2七聚體環(huán)組成的十四聚體型蛋白酶復合物[17]。目前，在鉤端螺旋體、銅綠假單胞菌和單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)中也存在兩種ClpP亞型(ClpP1和ClpP2)，而在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中僅發(fā)現一種ClpP，故ClpP在不同細菌中可能發(fā)揮著不同的作用[17-18]。

2 ClpP在細菌中的重要作用

ClpP及其相應蛋白酶復合物主要功能是清除或降解細菌胞內合成不當、受損傷、變性聚集或無用的蛋白，從而維持細菌正常代謝和壓力刺激下胞內蛋白質的動態(tài)平衡[19]，ClpP蛋白底物種類較多，目前研究結果顯示，除參與蛋白質代謝外，ClpP還與細菌藥物敏感性和毒力調控有關。

2.1 ClpP在細菌蛋白質代謝中的作用

隨著外界環(huán)境的改變，如溫度變化、氧化損傷和營養(yǎng)限制等，細菌通常會為適應環(huán)境而做出一定的生理和生化改變，這種應激反應處置能力對其生存是至關重要的，細菌胞內蛋白質降解被廣泛用于調節(jié)生理過程及清除異?；蚴軗p蛋白，在這些調節(jié)過程中ClpP發(fā)揮著重要作用。當蛋白質合成過程被意外中斷時，蛋白C末端將會被標記上一個含有11個氨基酸的SsrA標簽(大腸埃希菌SsrA序列為AANDENYALAA)，隨后被ClpXP或ClpAP識別并降解，防止變性蛋白累積帶來的不利影響[8,20]。在正常生長條件下，大多數細菌中的ClpP蛋白處于低水平，當環(huán)境改變后，表達水平將會明顯上調。在應激條件下，DNA修復蛋白RecN處于高水平，受ClpXP調控后，可避免其對細菌的不良影響，直至細胞回到無壓力狀態(tài)[21-22]。此外，大腸埃希菌中一種重要的應激反應調控因子σS，也受到ClpXP所調控[23]。單核細胞增多性李斯特菌可編碼兩種不同亞型ClpP，分別為ClpP1和ClpP2[24]，當李斯特菌處于熱應激(heat stress)條件時，clpP1和clpP2基因表達水平明顯上調[25]，提示ClpP1、ClpP2在單核細胞增生性李斯特菌蛋白質降解中起著重要作用。Zhang等[26]構建了肺炎鏈球菌的clpP突變株，采用雙向電泳和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術對其蛋白質表達水平變化進行了研究，發(fā)現clpP基因缺失后，肺炎鏈球菌胞內與一般應激反應、核苷酸代謝、能量代謝和蛋白質代謝有關的蛋白質的表達水平發(fā)生了明顯變化。

2.2 ClpP在細菌耐藥性中的作用

研究表明，clpP基因突變能使細菌細胞壁增厚，增強對溶酶體降解的抵抗力，使細菌對抗生素的敏感性降低。Mellergaard等[27]從持續(xù)接受達托霉素治療的患者體內分離了5株MRSA(methicillin resistantStaphylococcus aureus)，對其進行序列分析后發(fā)現，在治療過程中金黃色葡萄球菌rpoB和clpP等基因發(fā)生了突變，從而導致菌株對達托霉素產生耐受。在變異鏈球菌(Streptococcus mutans)中，Tian等[28]發(fā)現ΔclpP突變株中MazE和RelB蛋白表達量明顯增多，該研究結果提示ClpP蛋白可通過水解調控MazE和RelB蛋白，增強變異鏈球菌在抗生素壓力下持留菌/生物被膜的形成能力。Zheng等[19]研究發(fā)現糞腸球菌在高濃度利奈唑類或米諾環(huán)素暴露96h后，clpP基因缺失突變株數量明顯減少，提示ClpP也參與了糞腸球菌的抗生素耐受。上述研究結果顯示ClpP蛋白可在細菌耐藥中發(fā)揮一定的作用。

2.3 ClpP在細菌毒力調控中的作用

ClpP在致病菌毒性基因調控和對宿主細胞致病性方面也發(fā)揮著重要作用。Frees等[29]發(fā)現，在小鼠皮膚膿腫模型中，與野生株相比，金黃色葡萄球菌ΔclpP突變體毒力明顯下降，該研究結果證實ClpP對金黃色葡萄球菌毒力的影響是通過調控毒力因子來實現的，而不是通過提高壓力耐受水平實現。Li等[30]研究表明ClpP蛋白酶在嗜肺軍團菌毒力調控方面也發(fā)揮重要作用。Dickeya dadantiiClpXP可以調節(jié)III型分泌系統(tǒng)，維持該菌毒力[31]。銅綠假單胞菌ClpXP可以正向調節(jié)藻朊酸鹽(alginate)的過表達以及黏液轉換(mucoid conversion)，表明ClpP與銅綠假單胞菌的感染有關[32]。Kwon等[33]研究發(fā)現肺炎鏈球菌ΔclpP突變株不能侵入肺部，在小鼠模型中喪失了在鼻咽中的定植能力，且在小鼠巨噬細胞中的存活率降低，該研究結果表明ClpP可以調節(jié)毒性基因表達、抵抗宿主攻擊。鼠傷寒沙門菌ClpP對σS的產生及細菌毒性也有重要影響[34]。單核細胞增多性李斯特菌ClpP在細胞黏附、入侵及胞內寄生和毒力中發(fā)揮重要作用，且參與感染過程中的細胞內快速適應性反應[35-36]。小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)Ail蛋白可賦予該菌體外黏附細胞、入侵細胞、抵抗血清攻擊的能力，而該菌ClpP能夠調節(jié)ail基因的表達，間接影響該菌毒力[37]。Mtb具有復雜的應急調控機制，能夠在各種高壓力環(huán)境中生存下來并保持對宿主的致病性。Mtb的ClpP1、ClpP2蛋白酶復合物是Mtb所必需的，在感染期間清除受損蛋白方面也發(fā)揮了重要而不可替代的作用，被認為是最有潛力的抗Mtb治療藥物靶點[38-39]?？傊珻lpP蛋白酶與多種細菌致病機理相關，是新藥物研發(fā)的理想靶標之一。

3 基于病原體ClpP的藥物研究

目前，多重耐藥菌對人類健康帶來的威脅越來越大，尋找新型抗菌藥物迫在眉睫。ADEP(acyldepsipeptide，?；s肽)是由夏威夷鏈霉菌(Streptomyces hawaiiensis)產生的一種天然化合物，是一類?；念惪股豙40]，ADEP可激活ClpP蛋白酶，致使其蛋白水解功能紊亂，從而導致細菌死亡，研究表明，ADEP對PRSP(penicillin resistantStreptococcus pneumoniae)、MRSA和VRE(vancomycin-resistantEnterococcus)等臨床多重耐藥菌均表現出較好的殺菌活性[41-42]。ADEP1(又稱factor A)具有多種同系物，其中常見的6種同系物結構如圖2所示。ADEP通過競爭并取代AAA+ ATPase ClpX與ClpP結合，導致ClpP蛋白降解功能失控，從而殺滅病原體，Conlon等[43]研究發(fā)現當ADEP4與利福平或利奈唑胺聯合使用時，可有效清除持留菌，而在小鼠中，ADEP4與利福平聯合使用可以根除金黃色葡萄球菌慢性生物被膜感染。早年研究結果顯示ADEP1和ADEP2往往僅對革蘭陽性菌具有一定抗菌活性，而對大多革蘭陰性菌不敏感，由于其溶解性差、系統(tǒng)清除快以及藥物結構不穩(wěn)定性，致使該藥物在小鼠模型中抑菌效果不佳[44]。因ADEP類化合物對革蘭陰性菌療效欠佳，有研究人員對其大環(huán)核心殘基和N-?；鶄孺溸M行了進一步優(yōu)化，發(fā)現了一種新的ADEP衍生物(ADEP-26)，該衍生物不僅對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等革蘭陽性菌顯示出較強的活性，而且對淋病奈瑟球菌和腦膜炎奈瑟球菌也有很強的抑制作用[45]。有研究人員試圖開發(fā)具有抗革蘭陰性菌活性的非ADEP類ClpP靶向化合物，并將其稱為ACPs(activators of self-compartmentalizing proteases)，這些ACPs以類似于ADEP的方式結合和激活ClpP，能有效地殺滅革蘭陰性菌[46]。

除ADEP外，以ClpP為靶點的藥物還有β-內酯(β-lactones)類小分子化合物，該類化合物可降低金黃色葡萄球菌毒性，體外實驗結果顯示，β-內酯還能在ClpP2絲氨酸活性位點處形成共價結合物致使Mtb的ClpP1P2肽酶復合物失活，從而影響Mtb毒力。在惡性瘧原蟲中，β-內酯也顯示出了良好的ClpP抑制作用，實驗表明，β-內酯處理顯著抑制了無性期寄生蟲的體外生長，經β-內酯處理的寄生蟲在裂殖體晚期表現出發(fā)育停滯現象[47]。盡管它在體外試驗中獲得了理想殺菌或寄生蟲效果，但是由于該類化合物的水溶解能力差，血漿穩(wěn)定性低，限制了它們的臨床應用。此外，Hackl等[48]研究發(fā)現，在ClpP蛋白酶抑制實驗中，苯基酯(phenyl esters)類化合物的效價大大超過了β-內酯，并在金黃色葡萄球菌中顯示出獨特的靶向選擇性；然而，β-內酯仍然是迄今為止發(fā)現的唯一的ClpP特異性抑制劑。

Griffith等[49]采用靶向合成手段獲得了一類新型ClpP激活劑脲縮酚肽(ureadepsipeptides)，該類化合物用苯基脲(phenyl urea)取代了縮酚肽(depsipeptide)，具有較高的代謝穩(wěn)定性。該研究證明脲縮酚肽是金黃色葡萄球菌ClpP的有效激活劑，對化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌甚至金黃色葡萄球菌生物膜等都具有良好的殺菌活性。

此外，硼替佐米作為一種已知的26S蛋白酶體抑制劑，也可抑制ClpP1P2蛋白酶復合物的活性[50]，但由于其成本高，藥代動力學差，半衰期短等，限制了該藥物在臨床中的應用。值得一提的是，人類線粒體ClpP在人類非傳染性疾病中發(fā)揮了重要作用[51-52]，因其氨基酸序列與細菌、寄生蟲等的ClpP具有一定同源性，其結構也十分相似[53]，這也限制了基于病原微生物ClpP的藥物的臨床應用。

4 小結與展望

綜上所述，ClpP與病原體胞內蛋白質降解和細菌毒力密切相關。目前，與革蘭陽性菌相比，ClpP在革蘭陰性菌中的研究相對較少，對人類ClpP的生理功能和作用機制的研究還處于早期階段。本文對幾種調節(jié)細菌ClpP活性的小分子化合物進行了綜述，然而這些化合物還未在人類線粒體ClpP中進行詳細的研究，考慮到ClpP蛋白酶的序列保守性，目前仍不能排除針對細菌ClpP的化合物也對人ClpP活性產生影響。因此，在研究細菌ClpP相關靶點藥物時，必須考慮這些化合物會不會對人體產生影響。目前，雖然國內外有多個針對ClpP的藥物開發(fā)計劃，但還沒有藥物進入臨床應用階段。Clp ATPase-ClpP蛋白酶復合物中復雜的蛋白質-蛋白質相互作用，構成了一個特別適合藥物開發(fā)的系統(tǒng)。ADEP和ACP類化合物通過阻止Clp ATP酶與ClpP蛋白酶之間的結合發(fā)揮抗菌作用，但同時也導致了ClpP蛋白酶激活而致使細胞死亡，在基于ClpP蛋白酶的藥理研究上，依然任重而道遠。