危害不同寄主云斑白條天牛不同世代線粒體CO I基因的序列比較*

梅增霞，李建慶，尚帥，楊潔，常志恒

(1.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091)

云斑白條天牛(Batoceralineolata)，屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)的林業(yè)蛀干害蟲，在黃河三角洲地區(qū)主要危害白蠟樹(Fraxinuschinensis)，在洞庭湖地區(qū)主要危害楊樹，以幼蟲危害樹干木質(zhì)部為主[1-3]。危害白蠟樹和楊樹的云斑白條天牛種群由于長期地理隔離和食性差異，伴隨著對不同環(huán)境和食物的適應(yīng)，這兩個種群的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)習(xí)性也不斷適應(yīng)進(jìn)化，其遺傳結(jié)構(gòu)也會隨時間的變化相應(yīng)地發(fā)生變化。

線粒體基因較為保守，不易突變，是研究昆蟲種群系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化的理想材料，COI基因廣泛應(yīng)用于蝽科(Pentatomidae)、栗癭蜂(Dryocosmuskuriphilus)、柑橘果實(shí)蠅(Bactroceraspp.)等多種昆蟲系統(tǒng)進(jìn)化研究[4-6]。有關(guān)云斑白條天牛線粒體COI相關(guān)研究較少，僅見Wang等[7]分析了云斑白條天牛成蟲的線粒體全基因組序列及其編碼的蛋白，禹海鑫等[8-9]利用COI基因分析比較了白條天牛屬10種天牛的系統(tǒng)發(fā)育情況，梅增霞等[10]比較了危害楊樹的云斑白條天牛雌雄成蟲線粒體基因的變化差異。以上研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因在云斑白條天牛同一種群內(nèi)部的雌雄個體之間存在一定差異，但有關(guān)云斑白條天牛種群不同發(fā)生年度世代間線粒體基因變化的研究一直未見報道；因此，本研究以2014年和2019年采集云斑白條天牛成蟲作為不同發(fā)生年度的世代個體，分析比較南方危害楊樹種群和北方危害白蠟樹種群的雌、雄成蟲不同年度世代個體間的線粒體COI基因序列差異及變化情況，為研究云斑白條天牛的種群進(jìn)化提供案例和參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2014年度世代云斑白條天牛成蟲中，危害白蠟樹種群于2014年6月采自山東濱州，危害楊樹種群于2014年5月采自湖南岳陽；2019年度世代云斑白條天牛成蟲中危害白蠟樹種群于2019年6月采自山東濱州，危害楊樹種群于2019年5月采自湖南岳陽。

1.2 線粒體CO I基因的擴(kuò)增

云斑白條天牛成蟲DNA提取和線粒體COI基因的PCR擴(kuò)增方法同梅增霞和李建慶[10]。

1.3 不同年度世代個體CO I基因序列比較

將獲得COI基因序列，利用DNAStar的Editseq程序，統(tǒng)計(jì)分析不同基因序列的堿基組成，查找開放閱讀框(ORF)以及翻譯的氨基酸序列，統(tǒng)計(jì)堿基含量。利用MegAlign程序，分析序列相似度差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO I基因堿基含量比較

將2014年和2019年危害白蠟樹和楊樹的云斑白條天牛雌、雄成蟲的COI基因擴(kuò)增并測序，結(jié)果見表1。

表1 不同年度世代云斑白條天牛成蟲CO I基因堿基長度比較Tab.1 Base length comparison of CO I genes of different year generation adults of B.lineolata

由表1可見，序列拼接后，獲得危害白蠟樹云斑白條天牛雌、雄成蟲2014年和2019年世代的COI序列，長度在699～709 bp之間，危害楊樹云斑白條天牛的序列長度在663～713 bp之間。為便于比較，將2014年和2019年云斑白條天牛雌雄成蟲的COI基因堿基序列長度統(tǒng)一為640 bp，經(jīng)與Genebank 中的云斑白條天牛線粒體COI基因Blast比對，確認(rèn)為云斑白條天牛COI基因。

2014年和2019年云斑白條天牛2個寄主種群的雌雄成蟲的COI基因的堿基含量如表2所示，A+T的含量均高于65%，C+G的含量均低于35%，A+T含量明顯偏高。危害白蠟樹云斑白條天牛其雌成蟲A+T含量表現(xiàn)為2019年比2014年略低，雄成蟲的則是2019年比2014年略低；危害楊樹的云斑白條天牛雌成蟲A+T含量2019年比2014年略高，雄成蟲2019年和2014年含量一樣沒有變化。由此可知，云斑白條天牛由2014年至2019年，經(jīng)5年的短期進(jìn)化，成蟲COI基因的堿基含量有變化，但變化較小，且規(guī)律不明顯。危害白蠟樹的云斑白條天牛其雌雄成蟲的A+T含量由2014年至2019年均略有下降，危害楊樹的云斑白條天牛雌成蟲A+T含量由2014年至2019年略有上升，雄成蟲的沒有變化。

表2 不同年度世代云斑白條天牛成蟲CO I基因的堿基含量比較Tab.2 Base content comparison of CO I genes of different year generation adults of B.lineolata

2.2 CO I基因序列比較

危害白蠟樹和楊樹的云斑白條天牛種群的雌、雄成蟲的COI基因序列在2014年和2019年世代個體間存在差異。由表3可見，同一寄主種群的雌雄個體間存在差異，危害白蠟樹云斑白條天牛種群雌成蟲COI基因在2019年和2014年世代個體間的序列相似度為99.50%，雄成蟲為99.20%，雄成蟲變化差異大于雌成蟲；危害楊樹云斑白條天牛種群雌成蟲COI基因在2019年和2014年世代個體間的序列相似度為99.50%，雄成蟲為98.9%，雄成蟲變化差異大于雌成蟲。可以推斷，雄成蟲的COI基因突變速度快于雌成蟲，危害楊樹云斑白條天牛雄成蟲變化最大，突變最快。

表3 2019年和2014年云斑白條天牛成蟲CO I基因堿基序列比對Tab.3 Base sequences alignment of CO I genes of 2019 and 2014 year adults of B.lineolata

不同寄主種群之間COI基因序列存在差異，危害楊樹種群2019年和2014年世代個體間COI基因變化差異大于危害白蠟樹種群，危害白蠟樹云斑白條天牛雌、雄成蟲COI基因在2019年和2014年世代個體間的平均相似度為99.35%，危害楊樹云斑白條天牛種群的平均相似度為99.20%。據(jù)此也可推斷，危害楊樹云斑白條天牛的COI基因突變快于危害白蠟樹云斑白條天牛種群。

2019年和2014年危害白蠟樹云斑白條天牛雌成蟲COI基因序列比對結(jié)果如圖1所示，有3處不一致堿基，均為堿基轉(zhuǎn)換，分別為47位點(diǎn)的A-G、362位點(diǎn)的T-C、605位點(diǎn)的C-T。

圖1 2019年和2014年危害白蠟樹云斑白條天牛雌成蟲CO I基因序列比較Fig.1 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year female adults of B.lineolata attacking ash trees

2019年和2014年危害白蠟樹云斑白條天牛雄成蟲COI基因序列比對結(jié)果如圖2所示，有5處不一致堿基，發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換4處，分別為位于第6位點(diǎn)的T-C、230位點(diǎn)的A-G、482位點(diǎn)的T-C和527位點(diǎn)的G-A；堿基顛換1處，為410位點(diǎn)的T-A。

圖2 2019年和2014年危害白蠟樹云斑白條天牛雄成蟲CO I基因序列比較Fig.2 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year male adults of B.lineolata attacking ash trees

2019年和2014年危害楊樹云斑白條天牛雌成蟲COI基因序列比對結(jié)果如圖3所示，有1處堿基缺失，缺失堿基位于2019年雌成蟲的第12位點(diǎn)；1處堿基不一致，位于50位點(diǎn)的C-T，為轉(zhuǎn)換堿基。

圖3 2019年和2014年危害楊樹云斑白條天牛雌成蟲CO I基因序列比較Fig.3 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year female adults of B.lineolata attacking poplars

2019年和2014年危害楊樹云斑白條天牛雄成蟲COI基因序列比對結(jié)果如圖4所示，有3處堿基缺失，缺失堿基位于2019年雄成蟲的第369、382、514位點(diǎn)；1處堿基不一致，位于2014年雄成蟲395位點(diǎn)(2019年雄成蟲396位點(diǎn))的G-C，為轉(zhuǎn)換堿基。

圖4 2019年和2014年危害楊樹云斑白條天牛雄成蟲CO I基因序列比較Fig.4 Sequence alignment of COⅠ of 2019 and 2014 year male adults of B.lineolata attacking poplars

2.3 CO I基因開放閱讀框(ORF)比較

2.3.1 危害白蠟樹云斑白條天牛種群COI基因的ORF

2014年和2019年危害白蠟樹云斑白條天牛雌、雄成蟲COI基因的ORF均為102 bp，可翻譯為33個氨基酸。

4個COI基因的ORF序列

ATGTTTATAACAGTTGTAATAAAGTTAGCTGCGCCTAGAATAGAGGAAATTCCAGCTAGGTGTAAACTAAAAATAGCTAAATCAACAGAAGAACCTCTGTGA

OFR堿基翻譯的氨基酸序列

MFITVVIKLAAPRIEEIPARCKLKIAKSTEEPL

由此可知，從2014年到2019年，危害白蠟樹云斑白條天牛雌、雄成蟲COI基因的ORF沒有變化，翻譯的氨基酸也沒有變化。

2.3.2 危楊樹云斑白條天牛種群COI基因的ORF

2014年和2019年危害楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲COI基因的ORF均為108 bp，可翻譯為35個氨基酸。

4個COI基因的ORF序列

ATGATGGGGGTAATAATCAAAATCTTATATTATTTATTCGTGGAAAGGCTATATCGGGGGCTCCTAGTATTAGGGGTACTAGTCAATTTCCAAATCCACCAATTATAA

ORF堿基翻譯的氨基酸序列

MMGVIIKILYYLFVERLYRGLLVLGVLVNFQIHQL

由此可知，從2014年到2019年，危害楊樹的云斑白條天牛雌雄成蟲的COI的ORF沒有變化，翻譯的氨基酸也沒有變化。

綜合以上比較，可知云斑白條天牛在2019年和2014年世代個體之間的COI基因變化差異：同一種群內(nèi)部，危害白蠟樹和楊樹種群的雌、雄成蟲的COI基因序列存在變化，但ORF沒有變化；不同種群之間，不僅COI基因序列存在變化，ORF也有差異。

3 討論與結(jié)論

通過對2014年和2019年不同寄主云斑白條天牛雌、雄成蟲線粒體COI基因的比對分析可知，云斑白條天牛從2014年到2019年，歷經(jīng)5 a后，線粒體COI基因發(fā)生了堿基突變，序列相似度存在一定差異。無論是危害白蠟樹的云斑白條天牛種群，還是危害楊樹的云斑白條天牛種群，均表現(xiàn)為雄成蟲變化差異大于雌成蟲：危害白蠟樹的云斑白條天牛雌成蟲2019年和2014年COI基因的序列相似度99.5%，雄成蟲為99.2%；危害楊樹云斑白條天牛種群雌成蟲2019年和2014年COI基因的序列相似度為99.5%，雄成蟲為98.9%。2個寄主種群比較時，危害楊樹種群的變化差異大于危害白蠟樹種群，危害白蠟樹云斑白條天牛雌雄成蟲2019年和2014年COI基因的平均相似度為99.35%，危害楊樹云斑白條天牛種群的平均相似度為99.20%。通過以上分析可得出，從2014年到2019年云斑白條天牛雌、雄成蟲線粒體基因COI基因發(fā)生了一些堿基突變，線粒體基因堿基序列的變化，理論上也是對遺傳適應(yīng)的結(jié)果。

昆蟲生命周期相對較短，在研究種群進(jìn)化和遺傳突變方面具有很多優(yōu)勢。5 a對多數(shù)昆蟲而言，可以發(fā)生多個世代的更替，在世代更替的過程中，隨著對環(huán)境的適應(yīng)其遺傳基因也將發(fā)生變化。云斑白條天牛通常2 a完成1個世代，生活時間跨越3個年度[11-13]，世代重疊嚴(yán)重，每年均可采集到成蟲。從2014年采集的云斑白條天牛成蟲和2019年采集到成蟲之間至少發(fā)生4個世代，4個世代在生活習(xí)性和遺傳結(jié)構(gòu)上均會發(fā)生適應(yīng)變化。

由于線粒體基因較為保守，不同年度世代個體間COI線粒體基因的少量堿基發(fā)生突變，但作為表達(dá)功能蛋白的關(guān)鍵堿基序列ORF并沒有發(fā)生變化，表明其功能還沒變化，這一點(diǎn)與線粒體基因的保守性相一致。可能伴隨著進(jìn)化時間的延長，ORF也會發(fā)生改變。

目前，有關(guān)昆蟲線粒體基因雌雄個體差異的系統(tǒng)研究很少，僅能從少量文獻(xiàn)中找到雌雄個體線粒體基因存在差異的數(shù)據(jù)資料[8-9,14]，未見其他學(xué)者對昆蟲雌雄個體和不同年度世代個體線粒體基因差異的詳細(xì)研究，以及線粒體基因分化原因的詳細(xì)報道。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了云斑白條天牛不同寄主種群間、同一寄主種群的雌雄個體間和不同世代個體間線粒體基因存在差異，差異分化的原因有待進(jìn)一步深入研究確定。根據(jù)目前的研究數(shù)據(jù)推測，雄成蟲COI基因變化大于雌成蟲的主要原因?yàn)镃OI基因具有顯著的母性遺傳特性，雌性親本(母親)的基因直接遺傳給雌性后代，而雄性個體后代則為雌雄交配，更容易發(fā)生突變，故而雌性個體變化小于雄性。楊樹寄主種群COI基因變化大于危害白蠟樹種群的主要原因?yàn)槔ハx的發(fā)育速度與溫度相關(guān)，危害楊樹云斑白條天牛種群生活于南方的洞庭湖地區(qū)，危害白蠟樹種群生活于黃河三角洲地區(qū)，洞庭湖地區(qū)的平均氣溫顯著高于黃河三角洲地區(qū)，危害楊樹種群云斑白條天牛的發(fā)育速度快于危害白蠟樹種群。因此，其進(jìn)化突變速度也快于危害白蠟樹種群，線粒體基因的變化差異也大。

雖然未查詢到其他昆蟲不同年度世代個體間COI基因差異變化的相關(guān)研究，但在對云斑白條天牛的系統(tǒng)研究中不但發(fā)現(xiàn)線粒體COI基因堿基差異變化，還發(fā)現(xiàn)了生物學(xué)習(xí)性，尤其是成蟲產(chǎn)卵習(xí)性的一些明顯變化。在實(shí)際調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，2019年危害白蠟樹云斑白條天牛成蟲較2014年的成蟲，其產(chǎn)卵刻槽明顯變淺，產(chǎn)卵量增加，空槽率下降，這可能是云斑白條天牛通過增加產(chǎn)量、降低咬產(chǎn)卵刻槽這一產(chǎn)卵行為的能量投入，而選擇保持后代成活率相對穩(wěn)定的繁殖策略，這也是生物進(jìn)化適應(yīng)的一個表現(xiàn)。