巖藻多糖的提取、化學(xué)改性、降血糖活性及機(jī)理研究進(jìn)展

陳舒桐，俞 珵，李 瑞*，鐘賽意

1廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院；2廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室；3廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心；4廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524008

巖藻多糖(fucoidans,FU)主要來源于海洋褐藻如墨角藻[1]、裙帶菜[2]、馬尾藻[3]和海洋無脊椎動(dòng)物如海參[4]、海膽[5]等，是一種復(fù)雜的硫酸化多糖，又稱巖藻聚糖硫酸酯。FU的單糖組成主要是巖藻糖，還含有少量半乳糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸以及大量的硫酸基團(tuán)，是一種多聚陰離子同型雜多糖[6]。FU的骨架有兩種類型：I型鏈或II型鏈(見圖1)，I型鏈包含重復(fù)的(1→3)-α-L-吡喃巖藻糖，而II型鏈包含交替的(1→3)和(1→4)連接的α-L-吡喃巖藻糖，單糖通過α-1,2、α-1,3或α-1,4糖苷鍵連接[5]。

圖1 I型和II型巖藻多糖鏈Fig.1 Type I and type II chains of brown seaweed fucoidans注：R是潛在附著的碳水化合物(α-L-吡喃巖藻糖和α-D-葡萄糖醛酸)和非碳水化合物(硫酸基和乙?；?取代基。Note：R is potential attachment of carbohydrate (α-L-fucopyranose, α-D-glucuronic acid) and non-carbohydrate (sulfate and acetyl groups) substituents.

FU具有廣泛的健康功效及治療作用，包括抗腫瘤[3]、抗氧化[7]、抗疲勞[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]、抗菌[10]、抗肝損傷[11]、降血脂[12]、抗血栓[13]、抗炎[14]、抗血管生成[15]、抗凝血[16]、降血糖[17]、抗過敏[5]、抗輻射[18]及促進(jìn)傷口愈合[19]等多種作用；此外，F(xiàn)U還具有抗新型冠狀病毒的潛在作用[20]，因而引起越來越多的關(guān)注。FU的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)因地理位置、物種、季節(jié)和提取技術(shù)的不同而有顯著差異，其分子量和硫酸基含量對(duì)功能活性具有很大影響，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改性可進(jìn)一步提高其功能活性[12]。因此，本文重點(diǎn)綜述FU的提取方法、化學(xué)改性和降血糖活性及機(jī)理，探討FU的提取及化學(xué)改性方面今后的研究方向，深入研究FU結(jié)構(gòu)與降血糖及其他生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系也是今后的研究重點(diǎn)。本文可為FU的制備提供新的思路，有助于天然和改性后FU的有效利用，并為FU降血糖功能食品及保健產(chǎn)品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 巖藻多糖的提取方法

FU的生物學(xué)特性和生物利用度取決于其組成和結(jié)構(gòu)，并受提取技術(shù)的影響[21]。多糖的提取涉及溶劑滲透、多糖溶解和擴(kuò)散等一系列過程，眾所周知的導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變的因素，如高溫、酸、堿、超聲波、微波和酶已被廣泛應(yīng)用于多糖的制備[22]。已有研究證明，提取方法可引起多糖分子鏈的水解斷裂和分子間氫鍵的斷裂，從而得到具有不同理化性質(zhì)和功能特性的改性多糖[23]。這意味著天然多糖制備過程中可能經(jīng)歷物理化學(xué)變化，從而顯著影響其功能。為了得到功能更完善的多糖，必須了解制備方法(條件)對(duì)FU結(jié)構(gòu)等方面的影響。下面將綜述FU的提取技術(shù)，并討論這些技術(shù)在提高FU得率和生物活性等方面的潛力。

1.1 冷法提取及熱水浸提法

冷水提取、冷凍解凍及冷壓萃取都屬于典型的冷法提取。冷法提取保留了多糖的初始結(jié)構(gòu)，包含更多的活性基團(tuán)和功能反應(yīng)特定區(qū)域[24]。FU主要存在于褐藻細(xì)胞壁中[25]。然而，在相對(duì)低的溫度下，由于冷法提取多糖的釋放、擴(kuò)散和溶解速度較慢，可能導(dǎo)致高分子量多糖很難提取出來，從而導(dǎo)致多糖提取物得率較低[26]，因此冷法提取可用于選擇性分離高水溶性、低分子量多糖[27]。

熱水浸提法是根據(jù)FU易溶于熱水、不溶于乙醇等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，利用熱力作用，使細(xì)胞的原生質(zhì)層發(fā)生改變，導(dǎo)致質(zhì)壁分離，水溶液進(jìn)入細(xì)胞溶解所需物質(zhì)，使其擴(kuò)散到溶劑中，從而達(dá)到提取FU的目的。Shan等[28]采用80 ℃，3 h，海藻∶水=1∶20(w/w)的條件提取FU；Fernando等[29]用蒸餾水在溫度90～95 ℃提取2次，連續(xù)振蕩提取3～4 h。然而，二者均未報(bào)道FU得率。水提法對(duì)儀器設(shè)備要求不高，成本較低，便于在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，也適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，但熱水浸提存在耗時(shí)長(zhǎng)、能耗高、效率低的缺點(diǎn)。

1.2 酸提和堿提法

酸提法是根據(jù)FU可溶于稀鹽酸溶液的特點(diǎn)，在酸溶液中細(xì)胞壁充分吸水脹膨而破裂,從而使FU游離出來，以此達(dá)到提取目的。然而，在酸性條件下硫酸基可能會(huì)部分裂解和解聚，因此需要充分控制操作過程，以免影響FU的組成、結(jié)構(gòu)和性能[21]。常見的方法是使用0.05～0.10 mol/L HCl的微酸性溶液進(jìn)行提取[30-32]，硫酸溶液(0.10 mol/L)[33]和檸檬酸溶液(0.10 mol/L)[34]也可用來提取FU。在提取過程中其他組分如蛋白質(zhì)和酚類化合物也會(huì)被同時(shí)提取出來，因此FU得率比實(shí)際值偏高，然而蛋白質(zhì)和酚類化合物有助于其抗氧化活性[34]。

酸性處理?xiàng)l件對(duì)FU得率和分子量均有顯著影響，由于pH、時(shí)間和溫度這三個(gè)主要因素之間存在相互關(guān)系，因此需要同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化。由于高溫和長(zhǎng)時(shí)間酸萃取會(huì)影響聚合物結(jié)構(gòu)完整性，因此反應(yīng)時(shí)間通常需控制在1～5 h[35]。在較高酸濃度(0.35 mol/L HCl)下FU的巖藻糖含量會(huì)有損失[36]。溫度會(huì)影響FU提取率，溫度控制在30～90 ℃可達(dá)到較高得率，F(xiàn)U的提取量在溫度達(dá)到最佳值后逐漸增加，然后逐漸減少[21]。Lorbeer等[37]在60 ℃用HCl溶液提取邊花昆布(Eckloniaradiata)巖藻多糖，在短時(shí)間內(nèi)其巖藻糖和硫酸基含量都是最大的，延長(zhǎng)提取時(shí)間得率下降，且FU分子量顯著降低。較短時(shí)間和適中的溫度(42 ℃，pH1.0，159 min)有助于在工業(yè)環(huán)境中連續(xù)提取FU，最高得率為3.75%[38]。此外，還可以優(yōu)化多級(jí)萃取的次數(shù)，并進(jìn)行1～6次萃取，確保FU被完全提取出來[39]。

與其他需要化學(xué)試劑的技術(shù)相比，溫和的酸水解是一種更環(huán)保、更便宜、操作簡(jiǎn)單的解聚技術(shù)[40]，由于第一個(gè)巖藻糖單元位置2的選擇性脫硫，以及未磺化的巖藻糖殘基和隨后的4-硫酸基之間的糖苷鍵斷裂，硫酸基可能被去除，因此酸性條件下多糖分子易水解，糖苷鍵易斷裂，這讓獲得分子大小合適的FU變得困難[41]。然而，有研究表明脫硫酸基和脫?；鶎?dǎo)致FU抗癌活性下降[42]，而硫酸基團(tuán)對(duì)FU羥基的取代可改變多糖的組成、分子量、電荷、溶解度和構(gòu)象，提高多糖生物活性[43]。因此，酸提法需嚴(yán)格控制酸濃度以防止對(duì)得率和產(chǎn)物性質(zhì)造成影響。酸提法較水提法來說得率有一定升高，但同樣存在耗時(shí)長(zhǎng)、得率低的缺點(diǎn)。

在堿提法中，氫氧根離子會(huì)干擾多糖之間的氫鍵，將它們釋放到溶液中，從而提高得率。與熱水提取相比，使用CaCl2水溶液可提取粗巖藻多糖，提取物糖醛酸和多酚含量較低[31]。Saravana等[44,45]以0.10% NaOH溶液為萃取劑，分別采用加壓液相萃取和亞臨界水萃取法，F(xiàn)U得率分別達(dá)8.23%和13.56%。在進(jìn)行酸性或堿性提取時(shí)，為了防止目標(biāo)多糖降解，均需要對(duì)最終提取物進(jìn)行中和[21]。

1.3 超聲波和微波輔助提取法

超聲波和微波輔助提取多糖的效果也與高溫有關(guān)。超聲空化同時(shí)產(chǎn)生的高溫和高壓會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，增強(qiáng)溶劑滲透[46]。微波能量通過偶極極化和離子傳導(dǎo)迅速轉(zhuǎn)化為熱能量，幾乎立即升溫，導(dǎo)致細(xì)胞壁破壞，從而促進(jìn)多糖向溶劑釋放[47]。超聲波輔助提取法提取出的多糖可能具有較高醛酸含量和較低分子量，從而增強(qiáng)其抗炎、抗氧化、益生功能和/或降血糖活性[27]。同樣，微波輔助提取的FU具有較低分子量和較強(qiáng)的抗氧化活性[48]。與熱水浸提法相比，超聲波和微波輔助提取都更容易獲得產(chǎn)率更高、功能更理想的多糖提取物。

Alboofetileh等[49]報(bào)道，與亞臨界水萃取相比，超聲波輔助萃取獲得的FU因硫酸基含量較高而具有更強(qiáng)的抑制大腸桿菌的能力。Guo等[50]研究了超聲波對(duì)美國(guó)肉參(Isostichopusbadionotus)FU分子量、結(jié)構(gòu)和抗氧化性能的影響。結(jié)果表明，超聲處理后FU的分子量明顯降低，超聲強(qiáng)度越大、溫度越低、FU濃度越低，其超聲化學(xué)效應(yīng)越明顯，超聲波處理后的抗氧化活性略有提高。結(jié)合FU結(jié)構(gòu)分析和抗氧化活性結(jié)果，目前學(xué)者推測(cè)超聲波作用于FU的機(jī)理可能是機(jī)械降解和自由基降解相結(jié)合(見圖2)。

圖2 超聲波作用于巖藻多糖的可能機(jī)理Fig.2 Possible mechanism of ultrasonic action on fucoidans注：(1)機(jī)械作用破壞了巖藻多糖分子間的氫鍵；(2)超聲處理產(chǎn)生的自由基作用于分子主干上的非磺化巖藻糖。Note:(1) Mechanical effect broke the hydrogen bonds among the fucoidan molecules;(2) Free radicals produced by ultrasonic treatment acted on the non-sulfated fucose in the backbone.

Yuan[48]以泡葉藻(Ascophyllumnodosum)為原料，采用微波輔助技術(shù)提取FU，發(fā)現(xiàn)微波輔助法提取FU的最佳時(shí)間為15 min；90 ℃提取的FU單糖以巖藻糖為主，而150 ℃提取的FU以葡萄糖醛酸為主，且隨著提取溫度的降低，F(xiàn)U的分子量和硫酸基含量均呈上升趨勢(shì)，90 ℃提取的FU抗氧化活性最高。本研究表明，微波輔助萃取技術(shù)是一種高效的FU提取工藝。Quitain等[51]采用微波加熱法從裙帶菜(Undariapinnatifida)中提取FU，發(fā)現(xiàn)微波加熱比傳統(tǒng)加熱具有優(yōu)勢(shì)，在接近140 ℃獲得目標(biāo)分子量(5～30 kDa)；此外在1 min的短照射時(shí)間內(nèi)，以恒定微波功率進(jìn)行連續(xù)微波照射，也獲得了良好的效果。

1.4 酶解法

提取功能性多糖常用的酶包括纖維素酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、α-淀粉酶、葡萄糖氧化酶和淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶等，可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用[52]。酶解法的作用機(jī)制可能與以下方面有關(guān)：一是破壞生物屏障即細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，促進(jìn)所需多糖的分離；二是將多糖部分降解為易于提取的片段[52]。酶輔助提取功能性多糖與熱水浸提法相比的優(yōu)勢(shì)是非常明顯的，但與其他方法相比，酶解法并沒有提高多糖得率，而是顯著改變了提取物的化學(xué)成分和多糖結(jié)構(gòu)[27]。α-淀粉酶降低了多糖分子量，提高了多糖生物活性如益生功能、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用[27]。此外，與熱水浸提法相比，堿性蛋白酶輔助提取的多糖分子量和硫酸基含量更高，且具有更強(qiáng)的抗氧化和免疫刺激活性[49]。酶可以選擇性地分離生物活性多糖，并可有針對(duì)性的生產(chǎn)具有特定凝膠性質(zhì)和理想物理性質(zhì)的多糖[52]。目前研究已證明酶提取技術(shù)在多糖的可持續(xù)提取方面具有明顯技術(shù)優(yōu)勢(shì)，并提高了提取物的藥理活性，復(fù)合酶對(duì)多糖得率和提取率也有積極的影響；酶輔助提取的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是從反應(yīng)混合物中沉淀多糖所需的乙醇量較少，這使得該過程更加環(huán)保[52]。

1.5 加壓液相提取

水是一種中性溶劑，在室溫下無毒，而超過其臨界溫度和壓力的H2O分子，被稱為超臨界水，可以作為有機(jī)溶劑和酸性介質(zhì)。亞臨界水在高壓下可控制溫度高達(dá)374 ℃，亞臨界溫度可以促進(jìn)水不溶性多糖向水溶性多糖轉(zhuǎn)變[53]，并增加水的電離常數(shù)使其更接近酸性溶液，提高多糖提取效率[54]。與傳統(tǒng)的酸、堿、酶水解技術(shù)相比，生物質(zhì)加壓液體萃取技術(shù)具有許多優(yōu)勢(shì)。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑在任何萃取過程中都是一個(gè)重要因素，但必須焚燒、回收或需要其他適當(dāng)?shù)奶幚?，產(chǎn)生大量對(duì)環(huán)境具有非腐蝕性的廢物，而加壓液相提取方法的主要優(yōu)點(diǎn)是不使用有機(jī)溶劑，因而該方法更加環(huán)保[44]。各種文獻(xiàn)表明，從海藻等多種自然資源中采用加壓液相提取法萃取活性成分是一種很有前景的方法。

Saravana等[44]采用加壓液體萃取法利用不同溶劑(水、0.10%氫氧化鈉、0.10%甲酸、70%乙醇、50%乙醇和25%乙醇)從日本海帶(Saccharinajaponica)中提取FU，發(fā)現(xiàn)在140 ℃、50 bar、0.10%氫氧化鈉條件下，粗巖藻多糖得率最高，為8.23%，所有粗巖藻多糖均具有抗氧化活性，并具有良好的乳化穩(wěn)定性，特別是對(duì)植物油。Saravana等[45]對(duì)亞臨界水提取FU進(jìn)行進(jìn)一步的工藝優(yōu)化，得出最佳工藝條件為：127.01 ℃，80 bar，料液比0.04 g/mL，攪拌速度300 rpm，反應(yīng)時(shí)間11.98 min，F(xiàn)U得率為13.56%，所提取的FU具有良好的抗氧化活性，對(duì)少數(shù)細(xì)胞系具有適度抗增殖活性。綜上所述，通過超臨界水提取的粗巖藻多糖產(chǎn)率高且功能活性好，是FU工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法[45]。

1.6 組合方法

不同提取方法可能產(chǎn)生協(xié)同作用，因此在許多情況下多種方法結(jié)合提取FU，不僅可提高FU得率，也可增強(qiáng)其功能性質(zhì)，從而提高FU提取率和改性效果。Lorbeer等[37]采用熱鹽酸水溶液與微波相結(jié)合提取FU，180 min后FU得率為4.80%。Alboofetileh等[49]采用不同提取方法(酶法、超聲波、微波、亞臨界水、?；D(zhuǎn)移酶-超聲波聯(lián)用、超聲波-微波聯(lián)用、熱水浸提法)，發(fā)現(xiàn)亞臨界水提法FU提取率最高，達(dá)13.15%，超聲提法FU提取率最低，為3.60%；且微波和亞臨界水提取的FU對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)具有抑制作用，酶-超聲波聯(lián)用法、超聲波-微波聯(lián)用法和亞臨界水提FU對(duì)銅綠假單胞菌均有抑制作用，所有方法提取的FU對(duì)單純皰疹病毒Ⅱ型均具有較強(qiáng)的抗病毒活性。

2 巖藻多糖的化學(xué)改性

生物活性多糖由于其低毒、低副作用的特點(diǎn)，在食品和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們的廣泛關(guān)注。多糖具有多種生物活性，然而，其生物活性并不總是令人滿意。因此，為了改善多糖的功能性質(zhì)，有必要尋找一種提高多糖生物活性的方法，物理、化學(xué)和生物方法已廣泛應(yīng)用于其結(jié)構(gòu)的修飾[55]。對(duì)于FU，目前所用的主要化學(xué)改性方法包括硫酸化和脫硫、乙?；兔撘阴?、酰胺化和胺化以及磷酸化。

2.1 硫酸化和脫硫作用

硫酸多糖因其抗病毒等活性而受到廣泛關(guān)注，因此多糖的硫酸化是近年來多糖結(jié)構(gòu)修飾的一個(gè)重要方向。硫酸化改性原理是將多糖溶解在溶劑中，在一定條件下與相應(yīng)的磺化試劑反應(yīng)，硫酸基附著在羥基上，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)物的摩爾比控制多糖硫酸基與羥基的結(jié)合程度。FU是一種具有廣泛生物功能特性的天然硫酸多糖，在C-2和/或C-4位點(diǎn)上含有硫酸基。FU的生物功能特性取決于其分子結(jié)構(gòu)，硫酸基的取代模式和程度對(duì)其功能活性起著重要作用，硫酸化修飾后的多糖不僅能獲得抗病毒活性，還能產(chǎn)生其他新的生物活性，例如，在超氧自由基檢測(cè)、羥基自由基檢測(cè)、還原力檢測(cè)和MTT檢測(cè)中，馬尾藻FU顯示出良好的抗氧化和抗腫瘤活性[56]。然而，也并不是硫酸基越多越好，有些海洋硫酸多糖因?yàn)榱蛩峄窟^多而有一定的毒性，當(dāng)經(jīng)過脫硫處理后，可降低其毒性。Li等[57]對(duì)FU的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行較為詳細(xì)的綜述，首先指出FU糖的抗凝血活性隨硫酸基的增加而增強(qiáng)；其次，1→3連接的巖藻吡喃糖C-4上的硫酸基具有抗皰疹活性；第三，低分子量、硫酸基取代率高的FU具有較好的抗氧化性能；最后，F(xiàn)U的總負(fù)電荷隨硫酸基替代度的增加而升高，有助于降低血液膽固醇水平。因此，多糖的硫酸化/脫硫研究為開發(fā)新型生物功能材料提供了新的思路。

目前常用的硫酸化法主要有氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法和濃硫酸法[58]。不同的硫酸化修飾方法也有著不同的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)，比如濃硫酸法反應(yīng)條件比較穩(wěn)定，但這種方法會(huì)導(dǎo)致在硫酸化過程中硫酸多糖的降解及碳化，從而導(dǎo)致產(chǎn)率較低；三氧化硫-吡啶法反應(yīng)條件溫和，可防止多糖降解，產(chǎn)率較高且操作簡(jiǎn)單，但是此方法用到的試劑價(jià)格昂貴(見表1)。Koyanagi等[59]通過與二甲基甲酰胺和三氧化硫-三甲胺復(fù)合物反應(yīng)對(duì)FU進(jìn)行過硫酸化(見圖3A)，使FU某些殘基的羥基接上硫酸基團(tuán)，發(fā)現(xiàn)硫酸化FU的抗血管新生和抗腫瘤作用比天然巖藻多糖強(qiáng)。

表1 硫酸化法比較

在FU結(jié)構(gòu)表征過程中需對(duì)其進(jìn)行脫硫，有助于獲得清晰的核磁共振譜。脫硫應(yīng)在不引起聚合物水解的情況下進(jìn)行，目前最適合的脫硫技術(shù)是“溶劑離解脫硫”，即在二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和吡啶溶液中加熱FU(見圖3B)[60]。一些研究推薦使用1,4-二惡烷代替DMSO，因?yàn)镈MSO會(huì)導(dǎo)致聚合物降解[61]。反應(yīng)混合物中硫酸基受體如氧化亞砷和三氧化銻的存在有助于脫硫，因?yàn)樗墚a(chǎn)生大量完全脫硫的多糖。

圖3 FU的硫酸化(A)和脫硫(B)反應(yīng)[62]Fig.3 Sulfation (A) and desulfation (B) reactions of fucoidan[62]

2.2 乙酰化和脫乙酰作用

乙?；侵复剂u基與?；瘎┲g的反應(yīng)，活性羥基上可發(fā)生親核取代反應(yīng)，修飾多糖支鏈結(jié)構(gòu)，是最常用的化學(xué)修飾方法之一[58]。酸酐-吡啶法是常用的多糖乙?；揎椃椒?，該方法第一步是將多糖溶解在有機(jī)溶劑中(甲酰胺、甲醇、氯化鋰/二甲基乙酰胺、DMSO等)，接著加入乙?；噭?乙酸和乙酸酐)完成?；?，催化劑如N-溴代丁二酰亞胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶等添加，可以加速反應(yīng)，提高乙?；娜〈?常發(fā)生在羥基氧和氨基氮上)[63]。而N-溴代丁二酰亞胺具有便宜、高效的優(yōu)點(diǎn)，因此推薦使用其作為催化劑[64]，Wang等[65]采用N-溴代丁二酰亞胺作為催化劑對(duì)巖藻多糖進(jìn)行乙?；?jù)報(bào)道，F(xiàn)U的天然結(jié)構(gòu)偶爾在一些隨機(jī)位置含有乙?；鵞66]，然而，外加的乙?；梢院苋菀椎卦?OH連接到其主干。

乙?；梢愿淖兌嗵欠肿咏Y(jié)構(gòu)如定向性和橫次序，從而改變其性質(zhì)及溶解度。許多研究表明，多糖的乙?；墒苟嗵巧锘钚栽鰪?qiáng)或產(chǎn)生新的生物活性[58]。到目前為止，對(duì)FU的過乙酰化衍生物的研究數(shù)量有限。有報(bào)道稱過乙?；疐U的抗氧化性能比天然產(chǎn)物提高了[67]；Lee等[63]制備了乙?；疐U納米粒子并用來包埋阿霉素，F(xiàn)U的疏水改性成功地包封了輕度疏水藥物阿霉素，其一級(jí)藥物釋放行為可持續(xù)5天。

FU的去乙酰化通常被通過核磁共振協(xié)助表征其結(jié)構(gòu)。FU的脫乙酰是將FU溶解并與濃氫氧化銨溶液進(jìn)行反應(yīng)。除了化學(xué)脫乙酰作用外，Nagao等[68]還從海洋細(xì)菌中鑒定出了一種FU脫乙酰酶，該酶可以選擇性地脫乙酰巖藻多糖，而不會(huì)導(dǎo)致脫硫酸鹽或聚合物降解，這一新的FU脫乙?；椒ㄓ锌赡芡卣箤?duì)FU結(jié)構(gòu)的研究。

2.3 酰胺化和胺化

酰胺化和胺化分別是將酰胺基和胺基(包括烷基胺)引入化合物的過程。研究表明多糖的n-烷基酰胺具有降低膽固醇和脂肪的作用[69]。據(jù)我們所知，目前文獻(xiàn)中未見FU酰胺化的報(bào)道。FU的胺化可提高其抗凝血活性，因而得到了廣泛研究。由于巖藻多糖的異質(zhì)性質(zhì)不能直接進(jìn)行胺化，因此，需要引入具有活性官能團(tuán)的間隔分子(如環(huán)氧氯丙烷)來激活衍生物的酰胺化[62]。Soeda等[70]通過與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)在FU上引入一個(gè)間隔分子，然后溶解在30%的氨溶液進(jìn)行胺化(見圖4)。然而，Soeda等[71]報(bào)道，通過上述方法獲得的胺化FU可提高細(xì)胞外尿激酶型纖溶酶原激活物水平，進(jìn)而促進(jìn)了3LL腫瘤細(xì)胞(肺癌細(xì)胞)的侵襲，而天然巖藻多糖則會(huì)降低癌癥轉(zhuǎn)移。

圖4 巖藻多糖通過間隔分子進(jìn)行胺化[62]Fig.4 Amination of fucoidan via a spacer molecule[62]

2.4 磷酸化法

生物相容性聚合物磷酸化后在促進(jìn)羥基磷灰石生成方面提供了較好的性能，促進(jìn)了其在骨組織工程中的應(yīng)用并得到廣泛研究。Wang等[72]采用POCl3法和聚磷酸法兩種方法合成了巖藻多糖磷酸化衍生物。POCl3方法是首先將POCl3溶解在吡啶中，然后加入到含有FU的甲酰胺溶液，將此混合物倒入Ba(OH)2飽和溶液中，對(duì)產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過濾、洗滌、透析和凍干，得到磷酸化FU。在聚磷酸法中，F(xiàn)U首先溶解于甲酰胺溶液中并與三丁胺混合，再將多聚磷酸加入混合液中，所得沉淀物的pH用氫氧化鈉調(diào)至10，然后透析和凍干。POCl3法優(yōu)于聚磷酸法，且單糖中巖藻糖含量沒有損失。這兩種衍生物都顯示出比其天然形式更強(qiáng)的抗氧化活性[62]。

3 巖藻多糖降血糖活性及機(jī)理研究進(jìn)展

如前所述，F(xiàn)U具有抗癌、提高免疫力、降血糖等多種功能活性，本文重點(diǎn)討論FU的降血糖活性及機(jī)理。目前，科學(xué)家對(duì)FU降血糖活性的研究主要集中在對(duì)酶的抑制作用和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面，本文將從以下幾個(gè)方面探討FU的降血糖活性和機(jī)理。

3.1 抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，延緩機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝入

α-淀粉酶和α-D-葡萄糖苷酶活性與餐后血糖水平的升高相關(guān)。因此，對(duì)這兩種酶的控制在II型糖尿病治療中非常重要[73]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制機(jī)制在報(bào)道的各種抑制劑中有所不同，研究表明，多酚化合物影響α-葡萄糖苷酶活性的主要因素是清除氫，多酚化合物的作用是攔截從α-葡萄糖苷酶催化位點(diǎn)釋放的氫離子；α-淀粉酶可能的抑制血糖升高的機(jī)制包括：(1)多酚化合物與α-淀粉酶形成復(fù)合物；(2)減緩葡萄糖從活性部位擴(kuò)散，例如通過粘性水溶性膳食纖維延緩碳水化合物的水解和葡萄糖的吸收。巖藻多糖抑制α-淀粉酶的活性是通過靜電作用來減少葡萄糖的吸收率，降低餐后血清的葡萄糖水平[74,75]。Turgeon等[76]發(fā)現(xiàn)高硫酸基含量(20.60%)和中分子量巖藻多糖(637 kDa)均可抑制α-淀粉酶活性，推測(cè)FU可能通過靜電作用與α-淀粉酶結(jié)合，改變其在溶液中的構(gòu)象，從而抑制其活性。

海藻種類、收獲季節(jié)和區(qū)域影響FU抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的作用。Shan等[28]研究了11種不同褐藻來源的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)均對(duì)α-淀粉酶無明顯抑制作用，但墨角藻來源的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高(IC50值67.90 μg/mL)，可降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白水平，但對(duì)其體重影響很小。Turgeon等[74]研究發(fā)現(xiàn)，來自泡葉藻(Ascophyllumnodosum)的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50為0.013 ～ 0.047 mg/mL，優(yōu)于來自墨角藻(Fucusvesiculosus)的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用(IC50為0.049 mg/mL)；然而，墨角藻FU在研究的濃度范圍內(nèi)對(duì)α-淀粉酶活性無明顯抑制作用，而泡葉藻FU對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用根據(jù)收獲季節(jié)不同在5 mg/mL濃度下可降低7%～100%(IC50為0.12～4.64 mg/mL)。FU的黏度也會(huì)影響對(duì)酶的抑制作用，例如，墨角藻FU比泡葉藻FU具有更高的黏度，這可能會(huì)影響其在溶劑中的擴(kuò)散率，進(jìn)而增加FU到達(dá)酶的時(shí)間。Chen等[28](2016)研究表明，(1→3)連接的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶無抑制作用，而 (1→3)/(1→4) 交替連接的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶具有顯著抑制作用。然而，各種(1→3)/(1→4)-連接的FU對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用與其結(jié)構(gòu)性質(zhì)之間的相關(guān)性還不確定。為了進(jìn)一步揭示FU抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的機(jī)理以及為什么只有泡葉藻來源的FU可抑制α-淀粉酶，還需要進(jìn)一步研究FU的結(jié)構(gòu)特征[74]。

FU的分子量及硫酸基含量對(duì)其抑制酶活性具有重要影響，而單糖組成、糖苷鍵和硫酸基團(tuán)的位置對(duì)酶抑制作用無影響[74]。Kumar等[73]從馬尾藻(Sargassum wightii)中提取FU，硫酸根含量分別為53%±0.52%和36%±0.60%，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著，且呈濃度依賴性，IC50值為132.90 μg，比阿卡波糖(IC50值1 mg)更有效。Lakshmanasenthil等[77]從喇叭藻(Turbinariaornate)中提取的FU巖藻糖和硫酸基含量分別為59%±0.69%和33%±0.42%，喇叭藻FU對(duì)α-淀粉酶具有抑制作用，IC50值為33.60 μg，低于阿卡波糖125 μg。Lee等[78]通過小鼠實(shí)驗(yàn)研究不同分子量巖藻多糖對(duì)db/db小鼠血糖水平的影響，結(jié)果表明45 mg/kg分子量為5 kDa、5～30 kDa的FU和粗巖藻多糖治療可顯著防止db/db小鼠高血糖，且降血糖效果5 kDa >粗巖藻多糖>5～30 kDa。

3.2 抑制二肽基肽酶-IV，降低對(duì)胰高血糖素樣肽-1的分解

二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase，DPP-IV)是一種細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶，它主要的作用是分解體內(nèi)蛋白質(zhì)，其中一種被分解的蛋白質(zhì)叫做胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide，GLP-1)，它是由腸道細(xì)胞分泌的一種荷爾蒙，GLP-1通過刺激胰島素分泌、抑制升糖素、抑制胃排空和讓胰島細(xì)胞重生的方式來降低血糖，促使DPP-IV失活從而不分解GLP-1的DPP4抑制劑已經(jīng)成為治療糖尿病的主攻方向之一。近年來，DPP-IV已成為糖尿病重要的新藥靶點(diǎn)，醫(yī)藥行業(yè)的研究促進(jìn)了具有良好安全性和有效性的DPP-IV抑制劑的開發(fā)[79]。

Pozharitskaya等[79]發(fā)現(xiàn)FU在0.02～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)DPP-IV具有濃度依賴性的抑制作用，IC50為11.10 μg/mL，最大抑制程度為60%～75%，而西他列汀參比制劑的IC50為3.80 μg/mL。目前褐藻提取物對(duì)DPP-IV活性的抑制作用研究較少[79]。喇叭藻(Turbinariaornate)甲醇和丙酮提取液抑制DPP-IV的IC50值為55.20 μg/mL[80]。葡枝馬尾藻(Sargassumpolycyum)和圍氏馬尾藻(Sargassumwightii)的甲醇提取物也有類似的活性，IC50值分別為38.30和36.90 μg/mL[81]。因此，抑制DPP-IV可能是FU降糖作用機(jī)制之一[79]。

3.3 預(yù)防氧化損傷，治療糖尿病

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病與大量氧化物的產(chǎn)生以及糖分子的干預(yù)抑制自由基清除劑的形成有關(guān)，糖尿病患者的DNA明顯受到氧化過程損害。目前可用的維持糖尿病患者血糖水平的藥物需要定期服用，具有很大副作用，因此，需要發(fā)現(xiàn)新的分子和發(fā)展治療糖尿病的方法[82]。Yang等[82]研究了FU在糖尿病治療中的作用，與糖尿病組相比，100 mg/kg FU能顯著降低鏈脲酶素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖水平，F(xiàn)U對(duì)糖尿病大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性有顯著的促進(jìn)作用，可降低并固定血糖水平，并能抑制丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平的升高。本研究證實(shí)FU對(duì)STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型具有治療作用。

3.4 改善胰島功能障礙，增加機(jī)體胰島素水平

研究表明，胰島功能障礙是II型糖尿病患者發(fā)生高血糖的主要原因，只有在胰島功能障礙存在的情況下，胰島素抵抗才會(huì)因?yàn)榇鷥斝运ソ叨蔀橹匾蛩?。機(jī)體長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生糖毒性作用，原因是葡萄糖代謝產(chǎn)生的N-乙酞葡萄糖胺會(huì)增多，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞肥大。肥大的胰島β細(xì)胞會(huì)增加相關(guān)凋亡基因表達(dá)，從而加速胰島β細(xì)胞的凋亡，使胰島素分泌缺陷。胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下常伴有胰島素分泌代償性增多，會(huì)出現(xiàn)空腹胰島素水平增高[75]。Hu等[83]從海地瓜(Acaudinamolpadioides)中提取FU，分子量為1 614.10 kDa，硫酸基含量為26.30%±2.70%，可降低高脂高糖飲食誘導(dǎo)的糖尿病C57BL/6J小鼠的血糖水平，改善胰島素抵抗?fàn)顩r；通過激活I(lǐng)nsR/InsR-1/PI3K/Akt/GLUT4胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)移位，并增加了總蛋白含量。此外，該FU還可以調(diào)節(jié)肝葡萄糖代謝相關(guān)酶活性。

4 結(jié)語(yǔ)

FU的傳統(tǒng)提取方法得率總體較低，得率也會(huì)受不同提取方法、不同條件影響，因此需進(jìn)一步研究得率更高的提取方法。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，得率最高的是亞臨界水萃取法，F(xiàn)U得率為13.56%。提取方法對(duì)FU結(jié)構(gòu)有很大影響，因此，在實(shí)際提取過程中，可以根據(jù)需求采用不同提取方法。例如，要保留完整的FU結(jié)構(gòu)，需要采用條件溫和的提取方法，防止FU分子鏈被切斷。

羧甲基化可以提高多糖的溶解度及其電負(fù)性，多糖的羧甲基化可以增強(qiáng)其生物活性，甚至產(chǎn)生新的生物活性。近年來對(duì)于多糖羧甲基化的研究越來越多，羧甲基化后的多糖主要在抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等方面的生物活性較突出。海藻酸鹽的甲基化/羧甲基化、接枝共聚和酯化已經(jīng)有許多研究，然而，關(guān)于FU的甲基化/羧甲基化和接枝共聚尚未見報(bào)道，其酯化反應(yīng)尚未被廣泛研究。因此羧甲基化修飾和酯化等方法是今后對(duì)FU改性新的研究方向。

硫酸多糖能夠在pH值高于其等電點(diǎn)時(shí)與蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)具有很好的親和力。帶負(fù)電荷的FU通過靜電作用與蛋白質(zhì)(如抗凝血酶)的部分正電荷結(jié)合，F(xiàn)U與α-淀粉酶上一些帶正電荷的氨基酸之間的靜電相互作用可以改變其構(gòu)象，因此，F(xiàn)U帶負(fù)電荷的硫酸基團(tuán)與α-淀粉酶之間的靜電相互作用可能參與了α-淀粉酶活性的調(diào)節(jié)，從而改變其催化能力，巖藻多糖中的硫酸基與其抑制α-淀粉酶活性具有必然聯(lián)系。然而，這種靜電相互作用的確切位點(diǎn)及FU中硫酸基團(tuán)抑制α-淀粉酶活性的機(jī)制尚不清楚。以現(xiàn)有的物理、化學(xué)手段還不能全面描述某一多糖結(jié)構(gòu)以及多糖結(jié)構(gòu)與降血糖活性之間的關(guān)系。FU的功能與其結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，而目前對(duì)FU的分子結(jié)構(gòu)的研究還較為欠缺，大多數(shù)FU的單糖在多糖主鏈的位置還不太清楚，目前對(duì)FU的研究大多數(shù)集中在對(duì)其結(jié)構(gòu)的相關(guān)官能團(tuán)含量的分析層面，對(duì)FU更高層面的結(jié)構(gòu)和其空間構(gòu)象等方面的研究還較少。在未來，這些方面還需進(jìn)一步關(guān)注和探索，因此今后的研究重點(diǎn)為FU生物活性成分的分級(jí)和分離，以確定其結(jié)構(gòu)與降血糖及其他各種生物活性之間的關(guān)系。