靈芝麥角硫因高通量檢測(cè)方法研究

徐晴元，游俊健，林俊芳,2，薛玲娜，余穎豪，郭麗瓊,2*

1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系；2廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣州 510640

麥角硫因(ergothioneine，EGT)又名為2-硫基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是存在于很多動(dòng)植物體內(nèi)含量豐富的天然氨基酸[1]，僅在部分微生物(放線菌、鏈霉菌)、蕈菌、某些藍(lán)細(xì)菌中合成，不能由動(dòng)物機(jī)體自身合成EGT[2]，人體只能從食物中攝入并通過(guò)高特異性的有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1型(organic cation transporter novel type-1，OCTN1)[3]在各種細(xì)胞和組織中積累高濃度EGT[4]。EGT被認(rèn)為是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，Servillo等[5]對(duì)其抗氧化機(jī)理進(jìn)行了探討，認(rèn)為其擁有獨(dú)特的氧化還原機(jī)制，并提出了一種EGT在細(xì)胞中的獨(dú)特抗氧化作用。EGT的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位是-0.06 V，其它硫醇的電勢(shì)一般在-0.32 V～-0.2V之間，因此EGT在生理pH環(huán)境下比其他抗氧化劑更穩(wěn)定，不易自發(fā)氧化[6]。研究表明，EGT具有多種重要的生理功能，如抗炎作用[7]；通過(guò)保護(hù)DNA實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞保護(hù)功能[8]；通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化作用促進(jìn)神經(jīng)新生達(dá)到的抗抑郁功能[9]；通過(guò)抵抗氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的眼睛保護(hù)功能[10]；通過(guò)中斷與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生相關(guān)的黏附分子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的心腦血管保護(hù)功能[11]；通過(guò)抑制毒性達(dá)到的對(duì)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療作用[12]等，且本身具有安全性[13,14]，因此，EGT在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

EGT生產(chǎn)方式有化學(xué)合成、食用菌提取及微生物發(fā)酵等，由于前兩者成本較高，工序復(fù)雜，因此食用菌菌絲的深層發(fā)酵是目前EGT工業(yè)化生產(chǎn)的主流模式[15]，但自然菌株EGT產(chǎn)量低，需要通過(guò)育種技術(shù)培育EGT高產(chǎn)工業(yè)化菌種，培育工業(yè)食用菌菌種的方法有誘變育種[16]、雜交育種[17]、基因工程育種[18]及原生質(zhì)體融合育種[19]等，但每種育種方法都需要進(jìn)行多次、大樣本量EGT含量檢測(cè)，需說(shuō)明的是，育種過(guò)程中EGT含量檢測(cè)的意義更多在于比較樣本間含量高低。目前EGT的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[20,21]、高效毛細(xì)管電泳法[22]和薄層電泳法[23]等。使用最為廣泛的是高效液相色譜法，該方法可以從物質(zhì)復(fù)雜的體系中準(zhǔn)確檢測(cè)出EGT的含量，但高效液相色譜法有其明顯缺陷，即需探索針對(duì)不同樣品不同的檢測(cè)條件，且由于EGT出峰時(shí)間晚，標(biāo)品昂貴，在育種需從大量樣本中篩選出高產(chǎn)樣本的情況下會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，成本過(guò)高，極大地阻礙了EGT的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究，因此，急需建立一種可準(zhǔn)確測(cè)定樣本間EGT濃度的高通量快速檢測(cè)方法。

由于EGT具有強(qiáng)抗氧化性，2價(jià)鐵離子還原性適中(既不會(huì)受空氣中氧氣接觸干擾，也不會(huì)因?yàn)檫€原性太弱導(dǎo)致指示性降低)，EGT能與2價(jià)鐵離子反應(yīng)生成無(wú)色螯合物，同時(shí)硫氰酸根離子與二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，根據(jù)以上特點(diǎn)，本研究選用硫氰酸鐵為還原劑，使用麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品與硫氰酸鐵反應(yīng)，旨在建立一種麥角硫因的高通量檢測(cè)體系。同時(shí)以不同靈芝菌株EGT產(chǎn)量不同對(duì)該高通量檢測(cè)體系進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果將為高產(chǎn)EGT微生物的篩選及高產(chǎn)EGT新菌株的選育提供了新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

靈芝菌株NH8(元寶靈芝，Ganodermalucidum)、NH11(盆景3號(hào)，Ganodermalucidum)、NH12(美國(guó)大靈芝，Ganodermaresinaceum)、NH13(黑芝，Ganodermasinense)購(gòu)于山東省壽光食用菌研究所； FQ16(硫因靈芝，Ganodermasessile)為野外采集并由本實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與健康實(shí)驗(yàn)室)分離純化菌株；靈芝融合子菌株RS10、RS11、RS12、RS13、RS14、RS15、RS16為本實(shí)驗(yàn)室培育。

1.1.2試劑

硫氰酸鐵Fe(SCN)3(CAS登錄號(hào)4119-52-2)購(gòu)自湖北廣奧生物科技有限公司。麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品純品購(gòu)自天津諾信公司，純度99%。

1.1.3儀器

本實(shí)驗(yàn)所用主要儀器如下:高效液相色譜儀LC-2030(日本，株式會(huì)社島津制作所)；酶標(biāo)分析儀SAF-680T(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；冷凍干燥機(jī)FD-10-50(博醫(yī)康)；氮吹儀NAI-DCY-12Y(上海那艾儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品配制

使用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品，使用一級(jí)水溶解并配置成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度溶液：0.022、0.011、0.005 5、0.002 7、0.002 2 mg/mL。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行。

硫氰酸鐵試劑按照固液比(g/mL)0.1∶10 加入無(wú)水乙醇溶解，過(guò)膜0.22 μm，制得硫氰酸鐵溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

先加入10 μL硫氰酸鐵溶液于96孔板中，再加入100 μL麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，吹打混合。使用酶標(biāo)儀記錄吸光度，酶標(biāo)儀所用波長(zhǎng)為450 nm。

1.2.2靈芝菌絲體EGT的提取

配置PSB培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L(煮汁)，蔗糖25 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，NH4Cl 2 g/L，自然pH)，250 mL容量三角瓶分裝100 mL，加入約20顆玻璃珠，115 ℃高壓濕熱滅菌30 min。從菌株平板上切取大小約為0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，接種至PSB培養(yǎng)基中，控制接種量為5 %，置于搖床，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)4天，獲得種子液。

從種子液中吸取菌液至新的已分裝好的無(wú)玻璃珠PSB培養(yǎng)基中，控制接種量為5%，置于搖床，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)10天，每個(gè)菌株設(shè)置3平行。

預(yù)處理大孔樹(shù)脂：稱(chēng)取大孔樹(shù)脂NKA-9適量，使用無(wú)水乙醇浸泡4 h以上。使用一級(jí)水沖洗大孔樹(shù)脂至無(wú)明顯醇味，同時(shí)靜置后水呈澄清透明，抽濾收集大孔樹(shù)脂，使用1 M HCl浸泡大孔樹(shù)脂4 h以上。使用一級(jí)水沖洗大孔樹(shù)脂至沖洗液pH呈中性，抽濾收集大孔樹(shù)脂，使用1 M NaOH浸泡大孔樹(shù)脂4 h以上。使用一級(jí)水沖洗大孔樹(shù)脂至沖洗液pH呈中性，抽濾收集大孔樹(shù)脂，加入一級(jí)水，于4 ℃保存。

10天后收取菌絲，過(guò)濾以將發(fā)酵液與菌絲分離，收集菌絲用50 mL蒸餾水沖洗，將菌絲移至培養(yǎng)皿中，-45 ℃急速冷凍干燥36 h。稱(chēng)取干燥后菌絲體0.1 g，研磨粉碎，加入一級(jí)水10 mL，300 W超聲提取10 min。提取后置于65 ℃水浴30 min，使用過(guò)濾法收集上清液4 mL，加入70 %乙醇8 mL和1 % SDS溶液2 mL，4 ℃靜置12 h。

將靜置后溶液常溫離心8 000 rpm，15 min，取上清。使用氮吹儀，85 ℃，氮吹至4 mL以下，使用一級(jí)水定容樣品至4 mL，添加1 g預(yù)處理大孔樹(shù)脂(抽濾收集)，置于搖床，30 ℃、150 rpm震蕩4 h，取1 mL樣品加入1 mL氯仿混勻，30 ℃水浴30 min，吸取上層液體至新的離心管中，加入等體積一級(jí)水進(jìn)行稀釋?zhuān)褂肏Cl調(diào)節(jié)pH至2，即為待測(cè)樣品液。

1.2.3EGT-硫氰酸鐵體系對(duì)不同靈芝菌株的測(cè)驗(yàn)

選擇麥角硫因產(chǎn)量不同的靈芝菌株(見(jiàn)表1)，按“1.2.2”中的培養(yǎng)和提取方法獲得的待測(cè)樣品100 μL，加入已預(yù)先加入10 μL硫氰酸鐵溶液的96孔板中，靜置等待30 min，觀察顏色變化。麥角硫因含量越高的樣品，顯色越淺。在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，麥角硫因含量越高的樣品，吸光度越小。每株靈芝菌株設(shè)置3個(gè)平行。

表1 應(yīng)用于EGT-硫氰酸鐵體系的靈芝菌株

1.2.4 高效液相色譜法驗(yàn)證

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)條件：儀器使用島津LC-2030高效液相色譜儀進(jìn)行麥角硫因高效液相色譜檢測(cè)，色譜柱為：Welch Ultimate HILIC Amphion II 色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm，流動(dòng)相為乙腈∶水(85∶15)，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫30 ℃。麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考Hu等[24]報(bào)道方法，采用上述HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)，以EGT質(zhì)量濃度(mg/g)為橫坐標(biāo)，HPLC檢測(cè)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL經(jīng)“1.2.2”方法取純化后的菌絲提取液，經(jīng)0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每株靈芝菌株設(shè)置3個(gè)平行。得到樣品中代表麥角硫因含量的峰面積，將峰面積代入上述麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到相應(yīng)樣品中麥角硫因含量，然后通過(guò)下式換算。

EGT(mg/g DW)=C×40

式中：C代表通過(guò)麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到的麥角硫因質(zhì)量濃度值(mg/mL)，EGT為每克干重菌絲中麥角硫因含量。

1.2.5 EGT-硫氰酸鐵體系應(yīng)用于高產(chǎn)EGT靈芝新菌株的篩選

為檢驗(yàn)EGT-硫氰酸鐵體系在育種實(shí)驗(yàn)中的實(shí)用性，將本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因組重組技術(shù)獲得的靈芝融合子新菌株RS10、RS11、RS12、RS13、RS14、RS15、RS16使用EGT-硫氰酸鐵體系進(jìn)行高產(chǎn)EGT菌株的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGT-硫氰酸鐵體系的建立

使用不同濃度的EGT標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到硫氰酸鐵的溶液中，結(jié)果表明硫氰酸鐵的顯色反應(yīng)與EGT的濃度呈線性依賴關(guān)系，EGT濃度越高顏色越淺，各處理濃度之間顯色差異顯著(見(jiàn)圖1A)。測(cè)定各樣品450 nm處的吸光值，利用GraphPad Prism軟件繪制其散點(diǎn)圖(見(jiàn)圖1B)，線性回歸方程為y=-18.40x+ 1.002，R2值為0.979 1，說(shuō)明體系A(chǔ)450 nm值隨著樣品EGT濃度的增加而減少，趨勢(shì)穩(wěn)定，因此可以推論各處理間通過(guò)A450 nm值測(cè)定判斷樣品中的EGT含量的穩(wěn)定性是可行的。

圖1 不同質(zhì)量濃度EGT與硫氰酸鐵反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)450nmFig.1 Absorbance of EGT with different contents reacted with ferric thiocyanate注：A：1～5分別為0.022、0.011、0.005 5、0.002 75、0.002 2 mg/mL EGT標(biāo)準(zhǔn)品的EGT-硫氰酸鐵反應(yīng)體系；B：EGT標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度-體系A(chǔ)450 nm值線性擬合圖。Note:A:1-5 are the EGT ferric thiocyanate reaction system of 0.022,0.011,0.005 5,0.002 75,0.002 2 mg/mL EGT standard respectively.B:The linear fitting diagram of solution concentration-system A450 nm value of EGT standard.

2.2 EGT-硫氰酸鐵體系檢測(cè)不同靈芝菌株中的EGT含量

為確定EGT-硫氰酸鐵體系的實(shí)際應(yīng)用的可行性，將表1中靈芝菌株按照“1.2.2”方法進(jìn)行處理，按照“1.2.3”方法應(yīng)用本體系進(jìn)行檢測(cè)，得到表1各靈芝菌株對(duì)應(yīng)的450 nm處吸光值顯著性差異圖(見(jiàn)圖2)，圖中顯示，除了FQ16和NH12EGT產(chǎn)量差異不顯著外，其余均有顯著差異，而且吸光值大小與EGT含量呈負(fù)相關(guān)?？梢?jiàn)所測(cè)菌株A450 nm值組間存在顯著性差異(P<0.05)，組內(nèi)樣本間差異較小。證明本方法可實(shí)際應(yīng)用于菌株EGT濃度判斷，能靈敏明確區(qū)分菌株EGT濃度的高低，體系穩(wěn)定。

圖2 EGT-硫氰酸鐵體系檢測(cè)不同靈芝菌株的EGT含量吸光值A(chǔ)450 nmFig.2 Detection of EGT content and absorbance of different Ganoderma spp.strains by EGT- ferric thiocyanate system注：圖中a～d為樣本間顯著性差異標(biāo)識(shí)，字母不同表示樣本間P<0.05。Note:a-d are the mark of significant difference between samples,different letters indicate P < 0.05 between samples.

2.3 EGT-硫氰酸鐵體系檢測(cè)EGT含量的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

采用高效液相色譜法驗(yàn)證EGT-硫氰酸鐵體系的準(zhǔn)確性。使用高效液相色譜儀測(cè)定不同濃度EGT標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，繪制麥角硫因-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖3)。

圖3 麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.3 HPLC test results of ergothione standard注：A：EGT標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖，檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；B：EGT濃度(mg/mL)-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。Note:A:Liquid chromatogram of EGT standard,the detection wavelength is 257 nm B:EGT concentration (mg/mL)-peak area standard curve.

使用與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的色譜條件測(cè)定實(shí)驗(yàn)各靈芝菌株的EGT含量，使用GraphPad Prism繪制其峰面積值柱狀圖(見(jiàn)圖4)，可見(jiàn)菌株EGT含量由FQ16至NH8依次降低，與高通量檢測(cè)結(jié)果相符。

圖4 高效液相色譜檢測(cè)不同靈芝菌株的EGT含量Fig.4 Determination of EGT content of different Ganoderma spp.strains by high performance liquid chromatography

進(jìn)一步對(duì)以上圖2和圖4的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，可見(jiàn)各靈芝菌株EGT-硫氰酸鐵體系的A450 nm值隨著EGT濃度的增加而減小，且兩種檢測(cè)方法測(cè)得各樣品EGT濃度高低趨勢(shì)一致，EGT-硫氰酸鐵體系檢測(cè)結(jié)果組內(nèi)差異更小，EGT濃度相近的樣品也能通過(guò)本體系吸光值準(zhǔn)確反映出EGT含量高低，證明本體系檢測(cè)結(jié)果正確可用，檢測(cè)體系靈敏穩(wěn)定。

圖5 不同靈芝菌株EGT含量?jī)煞N檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比Fig.5 Comparison of the results of two detection methods for EGT contents from Ganoderma spp.strains

2.4 EGT-硫氰酸鐵體系在高產(chǎn)EGT靈芝新菌株篩選中的應(yīng)用

將靈芝融合子新菌株分別用EGT-硫氰酸鐵體系法和高效液相色譜法檢測(cè)EGT含量，反應(yīng)體系顏色與色譜結(jié)果比對(duì)(見(jiàn)圖6)，可見(jiàn)融合子菌株EGT-硫氰酸鐵反應(yīng)體系顏色由深到淺依次為RS13、RS14、RS16、RS12、RS10、RS15、RS11，與色譜圖結(jié)果完全吻合，推論本體系方法適用于產(chǎn)EGT靈芝菌株育種過(guò)程EGT含量的檢測(cè)比較。

圖6 靈芝融合子菌株EGT含量?jī)煞N檢測(cè)方法對(duì)比Fig.6 Comparison of two methods for detecting EGT content of Ganoderma spp.fusant strain注：a：融合子RS10-RS16液相色譜圖；b：高通量體系顯色結(jié)果。Note:a:Fusant RS10-RS16 liquid chromatogram;b:Color results of high throughput system.

3 討論與結(jié)論

根據(jù)麥角硫因具有強(qiáng)還原性的理化性質(zhì)，在構(gòu)建出EGT-硫氰酸鐵體系之前，還先后實(shí)驗(yàn)構(gòu)建堿性高錳酸鉀體系、溴甲酚綠體系、藍(lán)瓶子亞甲基藍(lán)體系、愈創(chuàng)木酚體系、氯化鐵-EGT體系，結(jié)果表明：堿性高錳酸鉀體系因?yàn)榉€(wěn)定性低失?。讳寮追泳G體系顯色結(jié)果因?yàn)榕cpH有關(guān)失?。凰{(lán)瓶子亞甲基藍(lán)體系中，由于還原態(tài)亞甲基藍(lán)的還原性太強(qiáng)，與空氣中的氧氣接觸也極易被氧化成亞甲基藍(lán)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)現(xiàn)象而失??；愈創(chuàng)木酚體系同樣因?yàn)檫€原性太強(qiáng)受氧氣接觸干擾而失??；氯化鐵體系因?yàn)轱@色程度太低而失敗。EGT-硫氰酸鐵體系可以用于EGT高通量檢測(cè)方法的研究。

EGT-硫氰酸鐵檢測(cè)體系構(gòu)建過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，待測(cè)樣品按照普通EGT粗提方法即醇沉-氮吹-定容提取時(shí)，提取液中殘留的酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)影響體系的顯色反應(yīng)，降低體系的靈敏度，因此粗提液在氮吹定容后，需增加氯仿除酚步驟。

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)名貴的藥用真菌，含有多種生物活性物質(zhì)和生理功能，其麥角硫因含量在眾多食用菌中含量較高，但是作為商業(yè)化生產(chǎn)的菌株其產(chǎn)量還偏低，因此培育高產(chǎn)麥角硫因的靈芝新菌株具有重要的意義及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，基于以上原因，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)原生質(zhì)體融合再生，分離鑒定得到一批擬融合子，本方法驗(yàn)證過(guò)程使用的靈芝融合子，均來(lái)源于此。

本研究建立的方法基于EGT本身理化性質(zhì)，檢測(cè)體系靈敏穩(wěn)定，適用于產(chǎn)EGT工業(yè)發(fā)酵菌株選育過(guò)程中，大批量樣本的快速比較，且理論上只需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的樣品EGT提取優(yōu)化，即可適用于絕大部分菌株EGT含量的高通量快速檢測(cè)，打破了原有EGT研究檢測(cè)的局限性，為EGT的整體開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究提供了新的方法和思路。