基于多元統(tǒng)計(jì)分析的酒制前后女貞子成分差異分析

李煥茹，馮志毅，趙 迪，胡雁萍，李 柯，馮素香

1河南中醫(yī)藥大學(xué)；2呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心；3鄭州市中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046

女貞子為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果實(shí)，女貞子的炮制基本繼承了古代炮制方法，以?xún)糁坪笊谩⒕普艉途茻鯙橹鱗1]。生女貞子在補(bǔ)肝腎的同時(shí)更傾向于清肝明目、滋陰潤(rùn)燥，而酒制不僅緩解了女貞子的涼滑之性，還增強(qiáng)了女貞子補(bǔ)肝腎的作用。女貞子功效發(fā)生變化的根本原因可能是女貞子酒制過(guò)程中化學(xué)成分的變化。女貞子的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)大多基于指紋圖譜[2-4]、集中于幾個(gè)已知的成分的變化[5-8]、對(duì)炮制品進(jìn)行化學(xué)成分的鑒別[9]、采用成分鑒別結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析女貞子化學(xué)成分[10-12]。缺乏一種全面、快速的分析方法對(duì)女貞子酒制前后的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。

基于質(zhì)譜的分子網(wǎng)絡(luò)是一種新的可用于鑒別中藥的化學(xué)成分的方法?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物具有相似的質(zhì)譜碎片，在GNPS中通過(guò)數(shù)據(jù)處理這些質(zhì)譜碎片可以自動(dòng)聚集成分子網(wǎng)絡(luò)，以快速識(shí)別化合物的不同類(lèi)別。并且，通過(guò)設(shè)置組別，產(chǎn)地、藥用部位及炮制方法不同的中藥樣品間的化學(xué)成分特征可以在分子網(wǎng)絡(luò)的餅圖上可視化。因此，該技術(shù)可用于鑒別中藥不同炮制品的化學(xué)成分[13,14]。多元統(tǒng)計(jì)分析是一種廣泛應(yīng)用于中藥差異化學(xué)成分識(shí)別的分析方法[15]。多元統(tǒng)計(jì)分析與分子網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合應(yīng)用來(lái)鑒別中藥化學(xué)成分，篩選差異性化學(xué)成分，可以得到更直觀(guān)和準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究綜合了UPLC-Orbitrap-MS技術(shù)、分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)并結(jié)合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對(duì)女貞子酒制前后的化學(xué)成分進(jìn)行分析，探究酒制對(duì)女貞子化學(xué)成分的影響，是鑒別生女貞子、酒女貞子中化學(xué)成分和篩選差異性化學(xué)成分的一種新的合理策略，為女貞子及其炮制品的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。

1 材料

Vanquish高效液相色譜儀(Accucore C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)色譜柱，Thermo Scientific)；Orbitrap Fusion超高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)；ME204E分析天平(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)；KQ-700DE超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司) ；Milli-QPOD超純水儀(德國(guó)Merck公司)。

羥基酪醇(批號(hào)MUST-15040805，純度≥98%)、紅景天苷(批號(hào)MUST-16041802，純度98.96%)、蕓香苷(批號(hào)MUST-16031712，純度98.87%)、木犀草苷(批號(hào)MUST-14060918，純度≥98%)、特女貞苷(批號(hào)MUST-16021904，純度98.01%)、橄欖苦苷(批號(hào)MUST-16052512，純度99.72%)、松果菊苷(批號(hào)MUST-17030701，純度98.88%)均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈(美國(guó)TEDIA公司)；甲酸為質(zhì)譜純，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；超純水(自制)。女貞子樣品經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果實(shí)(見(jiàn)表1)。

表1 女貞子樣品信息

2 方法

2.1 酒女貞子的制備

取女貞子飲片，按《中國(guó)藥典》2020年版通則0213燉法進(jìn)行酒女貞子的炮制，按女貞子-黃酒5∶1比例混入黃酒中，拌勻，密閉悶潤(rùn)4 h，在悶潤(rùn)過(guò)程中，每隔0.5 h攪拌1次，置于蒸鍋中水蒸汽燉4 h，至女貞子呈黑褐色，取出，晾干備用，得到酒女貞子。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取羥基酪醇、紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、松果菊苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

取女貞子粉末約2 g，精密稱(chēng)定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入80%的甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲提取(功率：700 W，頻率：40 kHz)1 h，放冷，用80%的甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

取黃酒2 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，離心，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 色譜、質(zhì)譜條件

Accucore C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0～8 min，20%A→30%A；8～18 min，30%A→37%A；18～22 min，37%A→38%A；22～24 min，38%A→79%A；24～37 min，79%A→100%A；37～39 min，100%A→5%A；39～42 min，5%A→20%A)；流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫25 ℃。

電噴霧離子化源(ESI)，正、負(fù)離子掃描；噴霧電壓+3.50、-2.50 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，載氣為氮?dú)猓蕷鈮毫?.5 Mpa，輔助氣壓力1.0 Mpa，輔助器加熱溫度275 ℃，分辨率120 000，掃描范圍m/z150～1500。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

Compound Discoverer 3.1、Cytoscape 3.8.0、GNPS(http://gnps.ucsd.edu)和SIMCA 14.1均用于數(shù)據(jù)分析。

GNPS參數(shù)如下：質(zhì)量誤差小于0.2 Da，匹配峰大于6，余弦得分大于0.50。形成生女貞子及酒女貞子的分子網(wǎng)絡(luò)，下載可視化集群網(wǎng)絡(luò)圖，以便基于Cytoscape 3.8.0進(jìn)行進(jìn)一步分析。

采用Compound Discoverer 3.1軟件對(duì)LC/MS檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和預(yù)處理，并在Excel 2019中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行編輯，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時(shí)間、分子量、峰強(qiáng)度等信息。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用PCA分析初步觀(guān)察各樣品的聚集情況；隨后，采用OPLS-DA進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行分類(lèi)，其中判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為R2Y(該值為模型的解釋率)及Q2值(該值為模型的預(yù)測(cè)率)，R2Y越接近1，表示模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示預(yù)測(cè)率高。根據(jù)OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP>1)尋找潛在的化學(xué)標(biāo)志物。

式中，NL為離子強(qiáng)度。

3 結(jié)果與分析

3.1 生女貞子及酒女貞子提取物的分子網(wǎng)絡(luò)

同一類(lèi)的化合物更容易聚集在同一分子網(wǎng)絡(luò)中，因?yàn)榛瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物也具有相似的二級(jí)質(zhì)譜片段。因此，在本研究中，基于它們的質(zhì)譜相似性，獲得了生女貞子和酒女貞子提取物的分子網(wǎng)絡(luò)，局部見(jiàn)圖1。分子網(wǎng)絡(luò)中共包含12 450個(gè)前體離子，包括1 323個(gè)簇(節(jié)點(diǎn)≥ 2)和5 448個(gè)單節(jié)點(diǎn)。更多詳細(xì)信息可以在公開(kāi)網(wǎng)站GNPS上獲得(https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/result.jsp?task=404f44ed69a04c5cabd803b452f28c43&view=view_all_clusters_withID_beta)。另外，由于處理方法相同，分子網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)餅點(diǎn)的面積可以代表女貞子酒制前后相對(duì)含量的變化。

從圖1可以明顯觀(guān)察到炮制前后女貞子的化學(xué)成分在種類(lèi)和含量上發(fā)生了很大變化。通過(guò)生女貞子、酒女貞子在圓中的占比，餅圖中，紅色部分占比大于藍(lán)色部分，表明炮制后化學(xué)成分含量降低；反之，表明炮制后化學(xué)成分含量升高。圓全部為紅色，表明該成分為生女貞子中含有的成分，而酒女貞子中未檢測(cè)到該成分。圓全部為藍(lán)色，表明該成分為炮制后新增成分，生女貞子中未檢測(cè)到該成分。

圖1 生女貞子和酒女貞子的分子網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Molecular network of RLLF and WLLF

3.2 總離子流色譜圖

生女貞子和酒女貞子的正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖2。黃酒中未檢測(cè)出與女貞子中相同的化學(xué)成分。

圖2 總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms注：a、b為正離子模式；c、d為負(fù)離子模式；a、c為生女貞子；b、d為酒女貞子。Note:a and b represent the positive mode;c and d represent the negative mode;a and c represent raw Ligustri Lucidi Fructus (RLLF);c and d represent and wine-processed Ligustri Lucidi Fructus(WLLF).

3.2.1 環(huán)烯醚萜苷類(lèi)

女貞子中的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分從結(jié)構(gòu)上可以分為環(huán)烯醚萜類(lèi)和裂環(huán)烯醚萜類(lèi)兩種，該類(lèi)化合物母核中具有半縮醛結(jié)構(gòu)，較為活潑，易導(dǎo)致母核發(fā)生斷裂，形成一些特征離子碎片，從女貞子中共鑒定出10個(gè)環(huán)烯醚萜苷成分(見(jiàn)表2)。

表2 化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息及特征碎片離子

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

化合物1和2在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z377.144 52[M+H]+、391.160 11[M+H]+，丟失一分子葡萄糖形成碎片m/z197.080 46、211.096 24，該碎片繼續(xù)丟失一分子水后形成的碎片m/z179.069 82、193.080 52?；衔?碎片m/z211.096 24丟失一分子甲氧基后形成碎片m/z179.069 95，該碎片繼續(xù)脫水后形成碎片m/z161.059 55，見(jiàn)圖3、4，該裂解特征與文獻(xiàn)[16]基本一致，推測(cè)化合物2為馬錢(qián)苷?；衔?比化合物2少一分子CH2，推測(cè)化合物1為馬錢(qián)苷酸，在女貞子中已有報(bào)道[10]。化合物3在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z229.107 11[M+H]+，丟失一分子甲氧基形成碎片m/z197.080 35，繼續(xù)丟失一分子CO形成碎片m/z169.085 74，再丟失一分子水形成碎片m/z151.075 12。此外，還檢測(cè)到母離子丟失兩分子水形成的碎片m/z193.080 52，初步推測(cè)化合物3為馬錢(qián)苷元。

圖3 馬錢(qián)苷主要碎片離子裂解途徑Fig.3 Ion cleavage pathway of main fragment of loganin

圖4 馬錢(qián)苷二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectrometry of loganin

化合物4～10為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷，除化合物5、6外，均檢測(cè)到m/z225的特征碎片離子。化合物4和10為一對(duì)同分異構(gòu)體，化合物10通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比較，鑒定為橄欖苦苷。已有報(bào)道女貞子中含有橄欖苦苷和10-羥基女貞苷[17]，化合物4初步推測(cè)為10-羥基女貞苷?；衔?比化合物10多一個(gè)羥基，初步推測(cè)為10-羥基橄欖苦苷，在女貞子中已有報(bào)道[20]?；衔?初步推測(cè)為橄欖苦苷酸，在女貞子中已有報(bào)道[9]?；衔?在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z525.197 14[M+H]+，初步推測(cè)為女貞苷，在女貞子中已有報(bào)道[19]。化合物8在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z687.250 04[M+H]+，其二級(jí)碎片離子主要有酯苷鍵斷裂并丟失葡萄糖殘基形成的碎片m/z285.096 07[M+H-C4H8O4-C14H18O6]+及該碎片繼續(xù)丟失甲氧基和糖苷鍵斷裂形成的碎片m/z211.060 07，繼續(xù)丟失一分子水形成的碎片m/z193.049 06，還檢測(cè)到酯苷鍵斷裂與糖苷鍵斷裂并丟失紅景天苷片段及一分子葡萄糖形成的特征碎片離子m/z225.074 92、苯乙醇苷元特征離子碎片m/z137.059 43和糖裂解碎片m/z145.048 71等，該裂解特征與文獻(xiàn)[9]基本一致，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，確定化合物8為特女貞苷?；衔?推測(cè)為oleonuezhenide，在女貞子中已經(jīng)有報(bào)道[21]。

馬錢(qián)苷元為酒制后女貞子中新增成分，可能是由于炮制過(guò)程中，馬錢(qián)苷酸與馬錢(qián)苷丟失葡萄糖基轉(zhuǎn)化為馬錢(qián)苷元。一般認(rèn)為特女貞苷酒制后含量降低，紅景天苷含量升高，并且認(rèn)為這與酒制過(guò)程中特女貞苷轉(zhuǎn)化為紅景天苷有關(guān)。然而，本實(shí)驗(yàn)中特女貞苷酒制后含量升高，推測(cè)是由于炮制過(guò)程中，oleonuezhenide及其異構(gòu)體分解造成的。

3.2.2 苯乙醇類(lèi)

女貞子中苯乙醇類(lèi)成分通常與環(huán)烯醚萜類(lèi)共同存在。在質(zhì)譜條件下經(jīng)過(guò)能量碰撞，容易丟失中性碎片(咖啡?；?和分子中的端基糖，或苯乙醇苷元等，這些特征離子碎片的丟失為有效鑒別苯乙醇苷類(lèi)化合物提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，從女貞子中共鑒定出6個(gè)苯乙醇類(lèi)成分(見(jiàn)表2)。

化合物12在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z299.113 78[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有丟失葡萄糖殘基形成的碎片m/z137.060 04[M-H-C6H10O5]-、及糖裂解碎片m/z113.024 42，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)化合物12為紅景天苷?；衔?4在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z153.055 37[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有m/z123.045 06[M-H-CH2OH]-的碎片離子，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)化合物14為羥基酪醇。

化合物11與化合物13為同分異構(gòu)體，化合物13可以通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比較，準(zhǔn)確地鑒定為松果菊苷?；衔?3在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z787.264 85[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有m/z325.091 28[M+H-C20H30O12]+、181.049 54[caffeic acid+H]+，咖啡酸部分脫水形成的碎片m/z163.038 97[caffeic acid-H2O]+，以及糖苷鍵斷裂形成的苯乙醇苷碎片m/z155.070 27、153.054 62、151.039 08等，見(jiàn)圖5、6。化合物15在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z625.212 30[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜信息與化合物13相似，主要有m/z325、181、163的特征碎片離子，與文獻(xiàn)[9]基本一致，推測(cè)化合物15為毛蕊花糖苷。化合物16在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z479.154 93 [M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜主要有m/z181、163的特征碎片離子，與文獻(xiàn)[22]基本一致，推測(cè)化合物16為木通苯乙醇苷B。

圖5 松果菊苷主要碎片離子裂解途徑Fig.5 Ion cleavage pathway of main fragment of of echinacoside

酒制后，紅景天苷、羥基酪醇含量升高，推測(cè)是由于炮制過(guò)程中，含有紅景天苷片段及羥基酪醇片段的苯乙醇苷類(lèi)及環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分分解造成的。

圖6顯示，化合物13、15、16聚集在同一分子網(wǎng)絡(luò)中，這可能是由于它們具有相同的質(zhì)譜碎片m/z325、163，該碎片為苯乙醇苷特征離子?；衔?3圓中紅色占比明顯多于藍(lán)色，表明炮制后含量明顯減少，與變化指數(shù)0.43相對(duì)應(yīng)。

圖6 松果菊苷所在分子網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Molecular network of echinacoside

3.2.3 黃酮類(lèi)

黃酮苷類(lèi)化合物主要的裂解方式是糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生糖基碎片及黃酮苷元；黃酮類(lèi)化合物主要裂解方式是C環(huán)的RDA裂解，從而產(chǎn)生兩個(gè)碎片離子，在質(zhì)譜條件下經(jīng)能量碰撞會(huì)失去H2O、CO2、CO等一系列中性小分子。從女貞子中共鑒定出18個(gè)黃酮類(lèi)成分(見(jiàn)表2)。女貞子中黃酮類(lèi)化合物分子網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖7。

圖7 黃酮類(lèi)化合物分子網(wǎng)絡(luò) Fig.7 Molecular network of flavonoids

化合物17在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z305.065 51[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有丟失一分子水形成的碎片m/z287.054 35[M+H-H2O]+、繼續(xù)丟失CO形成的碎片m/z259.059 54[M+H-H2O-CO]+、231.064 65[M+H-H2O-2CO]+，推測(cè)化合物17為花旗松素，花旗松素在女貞子中已有報(bào)道。女貞子酒制后，花旗松素含量明顯降低。

化合物18在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z609.146 33[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有m/z301.035 40、300.027 86，該裂解特征與文獻(xiàn)[9]基本一致，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比較，推測(cè)化合物18為蕓香苷。化合物20、21為一對(duì)同分異構(gòu)體，化合物20在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z463.088 63[M-H]-，二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到m/z301.035 25、300.027 86的碎片離子，初步推測(cè)化合物20為金絲桃苷。化合物21在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z465.103 25[M+H]+， 并且檢測(cè)到m/z303的離子峰對(duì)應(yīng)槲皮素，初步推測(cè)化合物21為異槲皮苷，在女貞子中已有報(bào)道可能含有金絲桃苷及其異構(gòu)體[12]，尚需進(jìn)一步采用對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)。化合物22在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z303.049 80[M+H]+，推測(cè)為槲皮素，在女貞子中已有報(bào)道[9]?；衔?3在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z449.107 93[M+H]+，檢測(cè)到m/z303的離子峰對(duì)應(yīng)槲皮素，推測(cè)化合物23為槲皮苷，在女貞子中已有報(bào)道[9]。

化合物24在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z449.109 578[M-H]-，并且檢測(cè)到m/z287的離子峰對(duì)應(yīng)圣草酚，推測(cè)化合物24為圣草酚-7-O-葡萄糖苷?；衔?5在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z289.070 69[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到m/z153.017 99、135.044 14的離子峰，這是典型的RDA裂解的過(guò)程，推測(cè)化合物25為圣草酚，女貞子中已有報(bào)道[9]?；衔?6在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z597.180 82[M+H]+，推測(cè)化合物26為圣草次苷。

化合物29在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z463.124 04[M+H]+，并且檢測(cè)到丟失葡萄糖基形成的m/z301.069 82的離子峰，推測(cè)化合物29為高車(chē)前苷。

化合物30在正、負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z435.128 54[M+H]+、m/z433.114 49[M-H]-，正、負(fù)離子下分別檢測(cè)到m/z273、271的離子峰對(duì)應(yīng)柚皮素，推測(cè)化合物30為柚皮素-7-O-葡萄糖苷?；衔?1檢測(cè)到m/z273.075 90[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰和m/z153.018 02、121.064 30的離子峰，這是典型的RDA裂解的過(guò)程，推測(cè)化合物31為柚皮素。

化合物33通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，鑒定為木犀草素?；衔?9、32的二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到m/z287的離子峰對(duì)應(yīng)木犀草素，推測(cè)化合物19、32分別為木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草苷，女貞子中已有報(bào)道含有這三種化合物[20]。

化合物34在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z271.060 21[M+H]+，在質(zhì)譜能量碰撞下，化合物34發(fā)生了C環(huán)的RDA裂解得到特征離子碎片m/z153.017 91、145.02829、119.048 97，該裂解特征與文獻(xiàn)[9]基本一致，推測(cè)化合物34為芹菜素?；衔?7、28的二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)到m/z271的離子峰對(duì)應(yīng)芹菜素，推測(cè)化合物27、28分別為芹菜素-7-O-蕓香糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷。女貞子已有報(bào)道含有這三種化合物[20]。

圖7顯示，化合物18、20、21、30、32聚集在同一分子網(wǎng)絡(luò)中，這可能是由于它們具有相同的質(zhì)譜碎片m/z153或m/z151，該碎片為黃酮苷元發(fā)生RDA裂解形成的特征碎片離子。其中，化合物18、20兩者均含有m/z301、300的碎片離子，且兩者結(jié)構(gòu)極為相似，化合物18僅比化合物20多一分子鼠李糖?；衔颽、b為生女貞子中獨(dú)有成分，化合物a可能為槲皮素-3-O丙二酰葡萄糖苷，化合物b可能為槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，與蕓香苷、金絲桃苷在具有相同的黃酮苷元?；衔颿 可能為山奈酚-7-O-葡萄糖苷，經(jīng)鑒定化合物c的保留時(shí)間處為木犀草苷，提示分子網(wǎng)絡(luò)存在一定的假陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件相結(jié)合，綜合鑒別中藥含有的化合物。化合物18、30、32圓中紅色占比明顯多于藍(lán)色，表明炮制后含量明顯降低，與變化指數(shù)相對(duì)應(yīng)。

3.2.4 三萜類(lèi)

三萜類(lèi)化合物在質(zhì)譜條件下經(jīng)過(guò)能量碰撞，當(dāng)環(huán)內(nèi)具有雙鍵時(shí)一般都有較特征的RDA裂解；如果無(wú)環(huán)內(nèi)雙鍵，常從C環(huán)斷裂為兩個(gè)碎片，有時(shí)也會(huì)同時(shí)發(fā)生上述兩種裂解，女貞子中鑒定出8個(gè)三萜皂苷類(lèi)成分(見(jiàn)表2)。

化合物37在正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子峰為m/z457.367 98[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有丟失一分子水形成的碎片m/z439.356 84[M+H-H2O]+、丟失一分子COOH形成的碎片m/z411.362 30[M+H-COOH]+及再丟失一分子水形成的碎片m/z393.351 59[M+H-COOH-H2O]+，熊果酸中環(huán)內(nèi)含有雙鍵，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜能量的碰撞，發(fā)生較為特征的RDA裂解，C環(huán)發(fā)生斷裂，形成具有共軛雙烯或烯烴的特征離子碎片m/z257.168 88、217.194 31、163.147 83等，見(jiàn)圖8、9，推測(cè)化合物37為熊果酸?；衔?6與化合物37為同分異構(gòu)體，文獻(xiàn)報(bào)道齊墩果酸和熊果酸為女貞子中含有的兩個(gè)同分異構(gòu)體，推測(cè)化合物36為齊墩果酸?；衔?5和39初步鑒定為委陵菜酸和2α-羥基熊果酸，這兩種三萜皂苷在女貞子中已有報(bào)道[20]。

化合物38在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z471.346 67[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子主要有丟失一分子水形成的碎片m/z453.336 46[M+H-H2O]+，丟失一分子COOH形成的碎片m/z425.340 58[M+H-COOH]+及再丟失一分子水形成的碎片m/z407.330 36[M+H-COOH-H2O]+，推測(cè)化合物38為18-β-甘草次酸?；衔?0、41為一對(duì)同分異構(gòu)體，初步鑒定為3β-O-反式-對(duì)香豆?；介?、3β-O-順式-對(duì)香豆酰基山楂酸，在女貞子中已有報(bào)道[20]?；衔?2初步鑒定為白樺酯醇，在女貞子中已有報(bào)道[4]。

圖8 熊果酸主要碎片離子裂解途徑Fig.8 Ion cleavage pathway of main fragment of ursolic acid

圖9 熊果酸二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9 Secondary mass spectrometry of ursolic acid

3.3 主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

為進(jìn)一步分析驗(yàn)證分子網(wǎng)絡(luò)分析生女貞子及酒女貞子差異性化學(xué)成分的準(zhǔn)確性，使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用的PCA多變量模式識(shí)別方法對(duì)生女貞子、酒女貞子進(jìn)行降維分析，圖10為其PCA得分散點(diǎn)圖(R2X=0.982，Q2=0.763)。生女貞子、酒女貞子可以明顯分開(kāi)，并各自聚為一類(lèi)，說(shuō)明女貞子酒制前后的化學(xué)成分存在差異。進(jìn)一步采用OPLS-DA研究女貞子酒制前后的差異化學(xué)成分，其得分圖見(jiàn)圖11，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生女貞子與酒女貞子可明顯分開(kāi)，模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.999，Q2=0.968)表明，該模型有效可靠。采用常用的變量重要性投影(VIP)值對(duì)組間質(zhì)量差異標(biāo)志物進(jìn)行篩選，共有22個(gè)特征峰的VIP值大于1，分別為特女貞苷、女貞苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷、橄欖苦苷、蕓香苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、2α-羥基熊果酸、圣草酚、柚皮素、羥基酪醇、木犀草苷、馬錢(qián)苷、馬錢(qián)苷酸、木通苯乙醇苷B、10-羥基女貞苷、oleonuezhenide、槲皮苷、芹菜素、圣草次苷、松果菊苷、槲皮素、10-羥基橄欖苦苷(見(jiàn)圖12)。

圖10 生女貞子、酒女貞子數(shù)據(jù)的PCA得分圖Fig.10 PCA score chart of RLLF and WLLF data

圖11 生女貞子、酒女貞子數(shù)據(jù)的OPLS-DA得分圖Fig.11 OPLS-DA score chart of RLLF and WLLF data

圖12 VIP值圖 Fig.12 VIP value diagram

4 討論與結(jié)論

本研究建立了一種基于UPLC-Orbitrap-MS技術(shù)、質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)的綜合分析方法，用于鑒別生女貞子、酒女貞子的化學(xué)成分，尋找差異性化學(xué)成分，探究女貞子酒制前后物質(zhì)基礎(chǔ)的改變。共鑒定出42種化學(xué)成分，包括環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷、黃酮、三萜類(lèi)化合物。經(jīng)分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)生女貞子、酒女貞子樣品中化學(xué)成分存在明顯差異，篩選出的差異性成分有特女貞苷、女貞苷、紅景天苷、蕓香苷、橄欖苦苷等。

分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)與高分辨質(zhì)譜定性分析相結(jié)合與傳統(tǒng)單一質(zhì)譜定性方法相比，具有一定的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的定性分析只能與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的化合物的信息進(jìn)行比對(duì)，給出可能的質(zhì)譜信息，得到單一的化合物的信息，難以對(duì)未知化合物進(jìn)行分析。分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)可以根據(jù)質(zhì)譜信息，將具有相同碎片的可能的同一類(lèi)型類(lèi)化合物聚集到同一網(wǎng)絡(luò)中，并且根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)中的餅圖的占比可以直觀(guān)地顯示出中藥生品與炮制品之間的化學(xué)成分的差別。將分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)與多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)相結(jié)合，可以準(zhǔn)確篩選生制品之間的化學(xué)標(biāo)記物。

本研究的結(jié)果為中藥女貞子生品和炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，并為明確女貞子酒制前后藥效發(fā)生變化的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。此外，本研究建立的研究女貞子化學(xué)成分的綜合分析方法，可為快速鑒別其他炮制品及中藥復(fù)方的化學(xué)成分的提供一種新的分析策略。