基于正交實驗法優(yōu)化從梔子黃色素中制備藏紅花酸的工藝

陽志強，烏 蘭*，李茂星,,4*，李曉琳，韓天翔，王維剛,4，王 芃,4

1西北民族大學化工學院，蘭州 730030；2聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院臨床藥學科；3甘肅省高原藥學行業(yè)技術中心，蘭州 730050；4甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州 730000

藏紅花酸(結構式見圖1)是鳶尾科植物藏紅花(CrocussativusL.)的主要有效成分之一具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1,2]、抗心血管疾病[3,4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6,7]等藥理作用。大量研究表明傳統(tǒng)中藥梔子(GardeniajasminoidesElli)富含以藏紅花酸為苷元的藏紅花苷類成分，且植物資源豐富[8]。項目組前期建立了聚酰胺柱層析法從梔子中富集提取梔子黃色素的制備工藝[9]，并首次證明梔子黃色素具有良好的抗氧化、抗缺氧、抗疲勞的生物活性[10-12]，具有良好的開發(fā)價值。然而，藥代動力學研究表明，藏紅花苷類成分不能以原型吸收入血，口服后體內生物利用度不高，最終會水解成藏紅花酸[13,14]。為了進一步開展相關研究，需要制備高純度的藏紅花酸。Zhang[15]通過大孔吸附樹脂分離富集得到藏紅花總苷，在藏紅花總苷中加入10% KOH水解得到藏紅花酸粗品。Fang等[16]從梔子中提取梔子黃色素后，用10% KOH溶液水解制備了藏紅花酸粗提物。高純度藏紅花酸的制備通常需要進一步采用柱層析法或重結晶等繁瑣復雜的純化工藝[15]，但由于藏紅花酸難溶于水，在乙醇、甲醇等一般有機試劑中溶解性也不好，實際純化過程往往需要使用吡啶、DMF等有機試劑，難以避免有機殘留[17,18]；同時大量有機試劑的使用，還會造成嚴重環(huán)境污染?，F(xiàn)有制備工藝操作步驟繁瑣、制備周期長，難以實現(xiàn)高純度藏紅花酸的工業(yè)化生產(chǎn)[19]。

圖1 藏紅花酸結構式Fig.1 Structure of crocetin

本研究設計正交實驗對堿水解的工藝條件進行系統(tǒng)研究，以藏紅花酸含量和得率為考察指標，對梔子黃色素的堿水解工藝進行正交優(yōu)化，同時對梔子黃色素堿水解后的處理方法進行改進，以期得到一種高得率、高純度，并且制備步驟少，過程不存在有機溶劑殘留的制備方法，為梔子中藏紅花酸的提取制備及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，以利于藏紅花酸在食藥領域的廣泛開發(fā)及應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃色素(實驗室自制，色價 > 500)；藏紅花酸對照品(批號：PS000187，含量 ≥98.0%)購自成都普思生物科技股份有限公司；滅菌注射用水(批號：M20080903B)、甲酸(批號：2019081601)、吡啶(批號：2020032301)、NaOH(批號：2020022701)均購自成都市科隆化學品有限公司；濃鹽酸(批號：20090818)購自天津市風船化學試劑科技有限公司；微孔濾膜(批號：20200628)購自上海密粒膜分離技術有限公司；色譜級甲醇(批號：Me-00040203)、色譜級乙腈(批號：Ac-00030281)購自OCEANPAK公司。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)；Waters Symmetry C18液相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；KQ-100A型超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司)；BP210S電子天平(Sartorius公司)；DF-1集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)；SHB-IV循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18液相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.6%甲酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫，洗脫程序為：0～15 min，25%→70% A；15～18 min，70% A；18～25 min，70%→25% A；25～30 min，25% A。流速1.0 mL/min；檢測波長423 nm；柱溫為30 ℃，進樣量10 μL；分析時間30 min。

1.3.2 溶液制備

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取藏紅花酸對照品適量于棕色容量瓶中，先加入少量吡啶充分溶解，再用75%甲醇溶液定容，搖勻，即得40.00 μg/mL藏紅花酸對照品貯備液，備用。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

梔子黃色素的制備[9]：稱取適量的梔子粉末，用純化水(10倍體積)煎煮1 h，過濾；在過濾后濾渣中加入純化水重復上述操作，合并兩次濾液，得梔子水提液。將上述水提液直接上樣于聚酰胺柱，先用純化水作為洗脫劑，到聚酰胺柱流出液為無色時，繼續(xù)以15%的乙醇除雜，最后以75%的乙醇為洗脫劑，收集并以紫外實時檢測其成分，合并洗脫液，干燥后得到梔子黃色素，用高效液相色譜測定其成分和含量，液相色譜圖見圖2。

圖2 梔子黃色素(A)、藏紅花酸供試品(B)及藏紅花酸對照品(C)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of gardenia yellow pigment(A),crocetin for test article(B),and crocetin reference substance(C)

精密稱取梔子黃色素適量于25 mL棕色容量瓶中，用75%甲醇溶液定容，搖勻，得40.00 μg/mL梔子黃色素供試品溶液。

精密稱取本實驗制備得到的藏紅花酸樣品適量于25 mL棕色容量瓶中，加入少量吡啶充分溶解，用75%甲醇溶液定容，搖勻，得40.00 μg/mL藏紅花酸供試品溶液，備用。

1.3.3 專屬性實驗

分別取上述對照品溶液和供試品溶液適量，用高效液相色譜儀進行檢測，并記錄色譜圖。結果如圖2所示，溶劑中不存在雜峰干擾，在此色譜條件下，藏紅花酸分離度與峰型良好。

1.3.4 方法學考察

線性關系考察：精密吸取對照品貯備液適量，分別進行稀釋，得到系列濃度(1.00、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00、40.00 μg/mL)的對照品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X，μg/mL)為橫坐標，進行線性回歸分析。

精密吸取對照品和供試品適量，分別進行準確度、重復性、穩(wěn)定性和精密度的考察。

1.3.5 梔子黃色素制備藏紅花酸工藝優(yōu)化

稱取4.00 g梔子黃色素加入圓底燒瓶中，按料液比1∶6 g/mL的比例加入NaOH溶液，水浴恒溫反應一段時間后，反應液分別按以下方法處理：

方法1：在反應液中直接加入20%鹽酸酸化，過濾后得到a；方法2：將反應液進行抽濾，分別收集濾液和濾餅，在濾液中加入20%鹽酸酸化，過濾后得到b；方法3：將濾餅超聲分散在大量純化水中，酸化過濾后得到c；方法4：將方法2中的濾餅分散在純化水中后，使用微孔濾膜再次過濾，濾液酸化后過濾得到d。通過HPLC檢測并比較不同方法制得的藏紅花酸的含量，工藝流程如圖3所示。

圖3 梔子黃色素制備藏紅花酸流程圖Fig.3 Flow chart of preparing crocetin from gardenia yellow pigment

1.3.6 單因素實驗

1.3.6.1 堿濃度對藏紅花酸得率的影響

稱取梔子黃色素4.00 g，按料液比1∶6 g/mL的比例加入NaOH溶液，濃度分別為1、1.5、2、2.5、3 mol/L，在55 ℃的環(huán)境中水解30 min，反應液按方法4處理。

1.3.6.2 料液比對藏紅花酸得率的影響

稱取梔子黃色素4.00 g，加入2.5 mol/L的NaOH溶液，料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 g/mL，55 ℃水解反應30 min，反應液按方法4處理。

1.3.6.3 水解時間對藏紅花酸得率的影響

稱取梔子黃色素4.00 g，按料液比1∶6 g/mL的比例加入2.5 mol/L的NaOH溶液，水解時間分別為10、20、30、60、90、120 min，水解溫度為55 ℃，反應液按方法4處理。

1.3.6.4 水解溫度對藏紅花酸得率的影響

稱取梔子黃色素4.00 g，按料液比1∶6 g/mL的比例加入2.5 mol/L的NaOH溶液，分別在45、55、65、75、85 ℃的溫度下水解30 min，反應液按方法4處理。

1.3.7 正交實驗設計

為探究梔子黃色素堿水解過程對藏紅花酸含量和得率的影響，參考文獻[20,21]進行正交實驗設計確定最佳的水解條件。精密稱取9份梔子黃色素，每份4.00 g，按表1設計的因素水平進行試驗，重復三次平行試驗，根據(jù)單因素實驗結果選取料液比(A)、NaOH濃度(B)、水解溫度(C)、水解時間(D)為考察因素，進行L9(34)4因素3水平正交設計和方差分析，因素水平表見表2。同時以樣品的得率和藏紅花酸的含量為考察指標進行綜合評分，將權重系數(shù)分別設置為30%和70%，樣品得率和綜合評分分別按以下公式進行計算：

其中Y為藏紅花酸的得率；mt為得到的藏紅花酸樣品的質量，m0為反應的梔子黃色素的質量。

2 結果與分析

2.1 HPLC檢測方法學考察

線性關系考察：藏紅花酸回歸方程為Y=2.017 5X+0.582(R2=0.999 8，線性范圍：1.00～40.00 μg/mL)。

表1 正交實驗因素與水平

準確度、重復性、穩(wěn)定性和精密度：準確度實驗中，平均回收率為97.35% ± 2.27%，RSD為2.33%，準確度良好；重復性實驗中RSD為2.09%，重復性良好；5.00、15.00、30.00 μg/mL三個濃度下，穩(wěn)定性和精密度的RSD均小于2%，穩(wěn)定性和精密度良好。

2.2 制備工藝的結果分析

方法1：梔子黃色素堿水解后直接酸化，反應液中藏紅花酸和雜質同時沉淀，過濾得到a，其中藏紅花酸含量較低，要再進行繁瑣的純化；方法2：將反應液過濾后的濾液直接酸化后得到b，其中含有的藏紅花酸很少，若要將濾液中藏紅花酸進一步提取純化，所需成本很高；方法3：反應液過濾后的濾餅酸化得到的c中，藏紅花酸含量可達到70%以上；方法4：進一步地優(yōu)化后，d中藏紅花酸的含量可達到95%以上，該優(yōu)化方法簡單，生產(chǎn)周期短，且不需要后續(xù)的純化步驟。不同處理方法樣品中藏紅花酸含量見圖4。

圖4 方法1～4樣品中藏紅花酸的含量Fig.4 The content of crocetin in samples by methods 1-4

2.3 單因素實驗結果與分析

2.3.1 NaOH濃度

如圖5所示，NaOH的濃度從1 mol/L增加到2.5 mol/L之間時，藏紅花酸的得率隨著NaOH濃度的變大而增加，當NaOH濃度>2.5 mol/L時，得率會稍微有些降低?？紤]到提取成本，選擇2、2.5、3 mol/L三個濃度為正交實驗的3個水平。

圖5 NaOH濃度對藏紅花酸得率的影響Fig.5 The effect of NaOH concentration on the yield of crocetin

2.3.2 料液比

如圖6所示，隨著堿液的增加，物料與堿液接觸增多，但是得率會先增大后再減小，當料液比為1∶6 g/mL時得率最大，可能是當料液比增大，體系中可參與反應的OH-增加，使水解反應更加完全，此時得率會隨料液比的增大而增大；當料液比>1∶6時，由于藏紅花酸鹽具有一定的水溶性，過濾后隨雜質進入濾液，使最后的得率降低。因此選擇1∶4、1∶6、1∶8三個料液比為正交實驗的三個水平。

圖6 料液比對藏紅花酸得率的影響Fig.6 The effect of solid to liquid ratio on the yield of crocetin

2.3.3 水解時間

由圖7可知，梔子黃色素得率隨反應時間迅速升高，在30 min時藏紅花酸的得率達到最高，之后得率隨水解時間的延長而出現(xiàn)下降，可能當水解時間過長時，水解副產(chǎn)物增多，不利于水解反應的正向進行?？紤]生產(chǎn)周期和得率，選擇20、30、60 min三個時間為正交實驗三個水平。

圖7 水解時間對藏紅花酸得率的影響Fig.7 The effect of time on the yield of crocetin

2.3.4 水解溫度

由圖8可知，藏紅花酸的得率隨水解溫度升高先增大，當溫度大于55 ℃后，得率隨溫度的升高開始降低。可能是堿水解反應為吸熱反應，在相同的條件下升高溫度有利于反應的進行，當溫度過高時，會對藏紅花酸的穩(wěn)定性造成影響，最后導致得率下降。因此選擇45、55、65 ℃三個溫度為正交實驗的3個水平。

圖8 水解溫度對藏紅花酸得率的影響Fig.8 The effect of temperature on the yield of crocetin

2.4 正交實驗結果與分析

正交實驗的結果見表2，通過各因素的K值和極差進行直觀分析，結果顯示各因素對梔子黃色素堿水解的影響大小主次順序為：B(NaOH濃度)>C(水解溫度)>D(水解時間)>A(料液比)，以極差最小的因素A為作為誤差項，方差分析的結果見表3，其中NaOH濃度、水解溫度、水解時間對藏紅花酸的得率具有顯著性影響；由K值大小確定梔子黃色素堿水解的最優(yōu)條件為A2B3C2D3，即梔子黃色素中加入3 mol/L的NaOH溶液，料液比為1∶6，在55 ℃的條件下反應60 min。

表2 L9(34)正交實驗結果分析(n = 3)

表3 方差分析

2.5 驗證實驗

根據(jù)優(yōu)化后堿水解條件進行3批驗證實驗，進一步考察反應條件的可靠性和穩(wěn)定性。精密稱取梔子黃色素4.00 g，按料液比1∶6的比例加入3 mol/L的NaOH溶液，55 ℃下恒溫反應60 min；冷卻至室溫后抽濾，濾餅用少量純化水淋洗2～3次；將濾餅溶于適量的純化水中，用微孔濾膜進行抽濾，在濾液中加入20%的鹽酸調節(jié)pH值為2～3，過濾得藏紅花酸純品，稱重計算得率，用HPLC法測定其含量。3批驗證實驗平均得率為15.33% ± 1.25%；藏紅花酸的平均含量為97.24% ± 0.78%，RSD(n=3)為0.80%，表明優(yōu)化后的水解工藝穩(wěn)定可行。

2.6 結構表征

2.6.1 核磁共振氫譜(1H NMR)

藏紅花酸結構式見圖1，其氫譜譜圖有8不同類型的氫信號。1H NMR(600 MHz，DMSO)δ：12.22(2H，s，OH-1，OH-1′)，7.21(2H，dd，J=11.4，1.6 Hz，H-3，H-3′)，6.83(2H，dd，J=8.0，2.9 Hz，H-8，H-8′)，6.73(2H，d，J=15.0 Hz，H-5，H-5′)，6.61(2H，dd，J=15.1，11.5 Hz，H-4，H-4′)，6.50(2H，dd，J=7.7，3.1 Hz，H-7，H-7′)，1.98(6H，s，6-CH3，6′-CH3)，1.92(6H，s，2-CH3，2′-CH3)，氫譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道一致。

2.6.2 核磁共振碳譜(13C NMR)

藏紅花酸結構式見圖1，其碳譜譜圖有10種不同類型的碳信號。13C NMR(150 MHz，DMSO)δ：169.6(s，C-1，C-1′)，143.8(s，C-5，C-5′)，138.5(s，C-3，C-3′)，137.1(s，C-6，C-6′)，135.8(s，C-7，C-7′)，132.1(s，C-8，C-8′)，127.4(s，C-2，C-2′)，124.6(s，C-4，C-4′)，13.3(s，2-CH3，2′-CH3)，13.0(s，6-CH3，6′-CH3)，碳譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道一致。

3 討論與結論

課題組前期通過聚酰胺柱層析法快速從梔子中提取富集了高純度的梔子黃色素，通過HPLC檢測其在440 nm處的吸收峰，發(fā)現(xiàn)其主要成分為藏紅花苷-1及藏紅花苷-2，在此基礎上以梔子黃色素為制備藏紅花酸原料。

目前制備藏紅花酸的方法多采用堿水解，將梔子中的藏紅花苷水解為藏紅花酸，而藏紅花酸的后續(xù)純化常用柱層析或重結晶等方法[16,23]。但由于藏紅花酸難溶的物理性質，采用柱層析或重結晶的制備工藝時，不僅操作步驟繁瑣、制備周期長、消耗大量試劑、嚴重污染環(huán)境，而且使用DMF等有機試劑時，更難以避免有機殘留。

本研究對水解后的反應液采用不同的處理方法，對藏紅花酸的制備工藝進行了考察和優(yōu)化，優(yōu)化后工藝步驟簡單，從梔子黃色素中一步制備得到高純度藏紅花酸，省去了柱分離或重結晶等繁瑣的純化過程，避免了有機試劑的消耗和過程中殘留試劑的問題，制備過程綠色無污染，獲得的藏紅花酸含量能達到95%以上。同時為提高藏紅花酸的得率，在優(yōu)化工藝的基礎上，對梔子黃色素堿水解過程進行了考察。選取料液比、NaOH濃度、水解溫度和水解時間進行單因素考察，并通過考察結果設計正交實驗，以含量和得率為評價指標，確定了堿水解的最佳條件。

本實驗對梔子黃色素制備藏紅花酸的路線進行了優(yōu)化，并設計單因素實驗和正交實驗優(yōu)選出堿水解的最佳條件，得到了一種快速、高得率、高純度制備藏紅花酸的方法，相較于常用的方法，不需要進行后續(xù)的純化處理，不涉及有機溶劑，節(jié)約了生產(chǎn)時間和成本，對從梔子中提取制備藏紅花酸具有較好的參考意義。