土壤真菌Aspergillus fumigatus固體發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分及抗氧化活性研究

趙江源，范簫藝，鄒雪峰，楊佩文，唐蜀昆，李銘剛*，劉世巍，丁建海*

1云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091；2寧夏師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，固原756000；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明650201；4云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205

近年來(lái)，土壤真菌多樣性的研究受到了廣泛關(guān)注，土壤中含有豐富的微生物資源，是地球上最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一[1]。由于真菌和土壤、植物的根系聯(lián)系緊密，共同參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、保存和循環(huán)，具有獨(dú)特的代謝途徑，因此產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的代謝產(chǎn)物。土壤真菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)化學(xué)成分及活性已有報(bào)道，Mohamed等[2]從土壤真菌Aspergillusfumigatus3T-EGY次生代謝產(chǎn)物中分離鑒定得到8個(gè)化合物，其中化合物juglanthraquinone A-5-O-D-rhodosamine (4′→1′′) -2-deoxy-D-glucose (4′′→1′′′) -cinerulose B 對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌具有中等體外抗菌活性。Liu等[3]從沿海鹽漬土壤真菌煙曲霉中分離出一種新的倍半萜類(lèi)衍生物，命名為aspergiketone,該化合物對(duì)HL-60和A549具有細(xì)胞毒性，IC50值分別為12.4和22.1 μM。Liang等[4]發(fā)現(xiàn)土壤真菌煙曲霉是個(gè)高活性鐵載體菌株，該菌株無(wú)抑制植物病原菌活性，但其發(fā)酵提取物可明顯促進(jìn)土壤生物活性。本研究前期對(duì)來(lái)源于哀牢山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)河谷的土壤真菌煙曲霉進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其粗體物對(duì)DPPH(IC50= 3.3 mg/mL)、ABTS+(IC50= 0.094 mg/mL)、OH自由基(IC50= 1.8 mg/mL)具有清除效果，因此本研究對(duì)土壤真菌的乙酸乙酯層的發(fā)酵提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究和抗氧化活性測(cè)試，為后續(xù)該菌種的活性成分的開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX-500 MHz核磁共振儀測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo)，Bruker公司)；AutoSpec Premier P776三扇型雙聚焦磁質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司)；柱層析硅膠和GF254TLC預(yù)制板(青島海洋化工廠(chǎng))；Sephadex LH-20(瑞典 Amersham Biosciences公司)；反相硅膠(德國(guó)Merck公司)；DPPH(C11753365)、ABTS(C12193480)、抗壞血酸(C12455241)、過(guò)硫酸鉀(C11974937)、硫酸亞鐵(C12175404)、水楊酸(C12173991)、磷酸氫二鈉(C12113745)和磷酸二氫鈉(C10095240)(分析純，麥克林生化試劑有限公司)。

1.2 菌株來(lái)源

菌株來(lái)源于云南省哀牢山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)河谷土壤樣本，并通過(guò)DNA提取、ITS序列擴(kuò)增以及序列比對(duì)，供試菌種被鑒定為Aspergillusfumigatus[4]。

1.3 菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

1.3.1 培養(yǎng)基

菌株斜面培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g(煮20 min后過(guò)濾)；葡萄糖20 g；瓊脂20 g；pH自然；蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌15 min后，擺斜面?zhèn)溆谩?/p>

液體種子培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 000 mL。500 mL三角瓶分裝(100 mL/500 mL)，121 ℃滅菌15 min后備用。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g珍珠巖，30 g大米(提前用液體種子培養(yǎng)液浸泡20 min)，50 mL液體種子培養(yǎng)液。混勻后分裝到罐頭瓶中(瓶口用12層紗布包口)。121 ℃滅菌15 min后備用。

1.3.2 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：將菌株轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上，30 ℃，7天進(jìn)行培養(yǎng)。待有明顯孢子生成即可用于液體種子培養(yǎng)。

液體種子培養(yǎng)：將1支斜面孢子轉(zhuǎn)接到1瓶液體培養(yǎng)三角瓶?jī)?nèi)。將三角瓶置于恒溫?fù)u床上，120 rpm，30 ℃培養(yǎng)5天。待有明顯顆粒狀菌絲球出現(xiàn)即可用于固體發(fā)酵接種。

固體發(fā)酵：將液體種子接入固體培養(yǎng)基內(nèi)(1瓶液體種子可以接種5瓶固體培養(yǎng)基。接種量為20 mL液體種子/固體培養(yǎng)瓶)。攪拌均勻后，置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20天。待培養(yǎng)基被孢子完全覆蓋，培養(yǎng)基顏色及質(zhì)地發(fā)生明顯變化后即可停止發(fā)酵。

1.4 提取與分離

發(fā)酵物用二氯甲烷和甲醇等體積混合作為提取溶劑，連續(xù)提取5次，減壓濃縮，得到提取物浸膏，將提取物浸膏與水混懸后，用乙酸乙酯萃取5次，萃取液合并減壓濃縮得浸膏50.0 g。浸膏用80～100目的硅膠拌樣，經(jīng)正相硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇，1∶0→0∶1)梯度洗脫得到7個(gè)極性依次增大的片段。由二氯甲烷/甲醇(80∶1)洗脫得到片段3，在80∶1段析出白色粉末，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱(二氯甲烷/甲醇，1∶1)純化，得到化合物1、2的混合物，繼續(xù)正相硅膠柱層析純化得到化合物1(15 mg)、2(2 mg)。由二氯甲烷/甲醇(60∶1)洗脫得到片段4，在該段析出白色晶體，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱純化，得到化合物3(7.4 mg)。由二氯甲烷/甲醇(40∶1)洗脫得到片段5，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱分離純化，得到化合物4(20.7 mg)。由二氯甲烷/甲醇(20∶1)洗脫得到片段6，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱和反相硅膠柱層析(甲醇/水 3∶2)分離純化，得到化合物的5(10.7 mg)。由二氯甲烷/甲醇(20∶1)洗脫得到片段6，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱分離純化，得到化合物6、7(共4.5 mg)的混合物，繼續(xù)正相硅膠柱層析純化得到化合物6(3 mg)。在片段4通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱純化得到化合物8(1.8 mg)、11(3.5 mg)、12(2.9 mg)、13(2.3 mg)。由二氯甲烷/甲醇(80∶1)洗脫得到片段3，在80∶1段析出白色粉末，得到化合物通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱，在經(jīng)過(guò)反相硅膠柱層析(甲醇/水，7∶3)分離純化，得到化合物9(2.3 mg)、10(2.3 mg)。

1.5 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

將化合物分別配置成一定濃度梯度的乙醇溶液，作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)配制一定濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。將不同濃度的樣品溶液和DPPH(0.5 mmol/L)同體積混合，避光保存30 min，在517 nm最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A1)；同時(shí)測(cè)定不加DPPH的樣品空白吸光度(A2)和加DPPH不加樣品的吸光度(A0)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，陽(yáng)性對(duì)照與待測(cè)樣品一致，根據(jù)公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.6 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)

將化合物分別配置成一定濃度梯度的乙醇溶液，作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)配制一定濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。將過(guò)硫酸鉀(2.6 mmol/L)和ABTS(7.4 mmol/L)混合反應(yīng)12 h，用無(wú)水乙醇稀釋30倍，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。將不同濃度的樣品溶液和ABTS溶液按照體積比1∶10混合，避光保存6 min，在734 nm最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A1)；同時(shí)測(cè)定不加ABTS的樣品空白吸光度(A2)和加ABTS不加樣品的吸光度(A0)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，陽(yáng)性對(duì)照與待測(cè)樣品一致，根據(jù)公式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

ABTS+自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.7 OH自由基清除實(shí)驗(yàn)

將化合物分別配置成一定濃度梯度的乙醇溶液，作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)配制一定濃度的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照組。首先加入樣品，依次加入硫酸亞鐵(5 mmol/L)、水楊酸(2.5 mmol/L)各1 mL，最后加入過(guò)氧化氫(1%)1 mL啟動(dòng)反應(yīng)，40 ℃水浴30 min，在510 nm最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A1)；同時(shí)測(cè)定不加過(guò)氧化氫的樣品空白吸光度(A2)和不加樣品的吸光度(A0)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，陽(yáng)性對(duì)照與待測(cè)樣品一致，根據(jù)公式計(jì)算OH自由基清除率。

OH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；分子式：C16H14O5；HR-ESI-MS：m/z287.092 6[M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：14.96(1H，s，5-OH)，6.97(1H，s，H-10)，6.58(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9)，6.39(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7)，6.00(1H，s，H-3)，4.00(3H，s，6-OCH3)，3.92(3H，s，8-OCH3)，2.36(3H，s，2-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.4(C-2)，107.2(C-3)，184.2(C-4)，153.4(C-5)，160.7(C-6)，97.2(C-7)，161.4(C-8)，97.7(C-9)，101.1(C-10)，110.1(C-11)，108.3(C-12)，141.1(C-13)，162.7(C-14)，20.7(C-15)，55.5(6-OCH3)，56.1(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為rubrofusarin B。

化合物2白色粉末；分子式：C15H12O5；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：14.96(1H，s，5-OH)，12.79(1H，s，6-OH)，6.96(1H，s，H-10)，6.60(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9)，6.40(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7)，5.98(1H，s，H-3)，3.96(3H，s，8-OCH3)，2.49(3H，s，2-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為rubrofusarin A。

化合物3針狀晶體；分子式：C13H11NO3；HR-ESI-MS：m/z229.096 6[M]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.40(1H，s，H-2)，7.24(1H，d，J= 7.0 Hz，H-9)，7.32(1H，t，J= 7.1 Hz，H-11)，7.23(1H，d，J= 7.0 Hz，H-13)，7.30(1H，d，J= 7.0 Hz，H-11)，7.33(1H，t，J= 7.0 Hz，H-12)，6.32(1H，s，H-5)，3.94(2H，s，H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：178.4(C-4)，168.7(C-6)，168.7(C-14)，164.7(C-2)，137.4(C-8)，130.5(C-9)，130.5(C-10)，128.3(C-11)，130.5(C-12)，130.5(C-13)，118.3(C-5)，119.5(C-3)，39.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為carbonarone A。

化合物4針狀晶體；分子式：C13H12N2O2；HR-ESI-MS：m/z229.097 3[M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.14(1H，br s，1-NH)，9.51(1H，br s，14-NH2)，8.31(1H，s，H-2)，7.33(1H，s，H-10)，7.33(1H，s，H-12)，7.29(1H，s，H-9)，7.29(1H，s，H-13)，7.28(1H，s，H-11)，6.21(1H，s，H-5)，3.89(2H，s，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：141.9(C-2)，117.4(C-3)，177.3(C-4)，118.3(C-5)，150.8(C-6)，37.6(C-7)，137.1(C-8)，128.7(C-9)，128.9(C-10)，126.9(C-11)，128.9(C-12)，128.7(C-13)，165.5(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為aspernigrin A。

化合物5針狀晶體；分子式：C16H14O5；HR-ESI-MS：m/z287.090 7[M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.78(1H，s，5-OH)，6.87(1H，s，H-6)，6.59(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7)，6.40(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9)，6.28(1H，s，H-3)，3.97(3H，s，10-OCH3)，3.92(3H，s，8-OCH3)，2.50(3H，s，2-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.5(C-2)，110.3(C-3)，182.8(C-4)，156.8(C-5)，105.8(C-6)，97.9(C-7)，161.4(C-8)，96.9(C-9)，159.1(C-10)，155.7(C-11)，104.9(C-12)，141.1(C-13)，108.7(C-14)，20.5(C-2)，55.4(10-OCH3)，55.9(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為flavasperone。

化合物6白色粉末；分子式：C28H44O3；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.54(1H，d，J= 8.5 Hz，H-7)，6.27(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6)，5.30(1H，dd，J= 15.3，7.5 Hz，H-23)，5.15(1H，dd，J= 15.3，7.5 Hz，H-22)，3.78(1H，m，H-3)，1.03(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.95(3H，d，J= 6.3 Hz，H-28)，0.92(3H，s，H-19)，0.87(3H，d，J= 6.5 Hz，H-27)，0.85(3H，s，H-18)，0.82(3H，d，J= 6.5 Hz，H-26)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:137.0(C-6)，133.7(C-22)，132.0(C-23)，131.9(C-7)，83.7(C-5)，80.9(C-8)，67.2(C-3)，57.8(C-17)，53.3(C-14)，53.0(C-9)，44.5(C-13)，41.3(C-24)，40.9(C-20)，40.6(C-12)，38.0(C-10)，36.1(C-4)，34.6(C-1)，32.9(C-25)，30.0(C-2)，29.4(C-16)，24.6(C-15)，20.7(C-11)，20.3(C-21)，19.5(C-27)，18.8(C-26)，18.2(C-19)，16.10(C-28)，13.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為(22E，24R)-5α，8α-過(guò)氧麥角甾-6，22-二烯-3β-醇。

化合物7白色晶體；分子式：C28H42O3；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.66(1H，d，J= 7.3 Hz，H-7)，6.31(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6)，5.49(1H，dd，J= 7.0，1.5 Hz，H-11)，5.43(1H，dd,J=6.0,1.9 Hz，H-23)，5.24(1H，m，H-22)，3.94(1H，m，H-3)，1.07(3H，s，H-19)，1.02(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.91(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J= 3.5 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J= 3.5 Hz，H-26)，0.82(3H，s，H-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為(22E，24R)-5α，8α-過(guò)氧麥角甾-6，9(11)，22-三烯-3β-醇。

化合物8黃色粉末；分子式：C32H26O10；HR-ESI-MS：m/z571.160 7[M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：15.25(1H，s，5′-OH)，14.84(1H，s，5-OH)，7.15(1H，s，H-10)，6.97(1H，s，H-9)，6.41(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7′)，6.20(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9′)，6.05(1H，s，H-3)，5.95(1H，s，H-3′)，4.02(3H，s，6′-OCH3)，3.79(3H，s，8-OCH3)，3.60(3H，s，8′-OCH3)，3.46(3H，s，6-OCH3)，2.41(3H，s，2-CH3)，2.12(3H，s，2′-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.6(C-2)，20.8(2-CH3)，107.4(C-3)，184.5(C-4)，104.6(C-4a)，161.9(C-5)，111.4(C-5a)，158.4(C-6)，61.9(6-OCH3)，117.6(C-7)，160.1(C-8)，55.8(8-OCH3)，101.3(C-9)，140.8(C-9a)，101.2(C-10)，153.3(C-10a)，167.5(C-2′)，20.6(2′-CH3)，107.2(C-3′)，184.6(C-4′)，104.2(C-4a′)，162.6(5′-OH)，108.5(C-5′a)，160.9(C-6′)，56.2(6′-OCH3)，96.8(C-7′)，161.4(C-8′)，55.1(8′-OCH3)，96.4(C-9′)，140.5(C-9′a)，105.1(C-10′)，150.7(C-10′a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為ourosperone A。

化合物9白色粉末；分子式：C28H44O；HR-ESI-MS：m/z395.329 5[M-H]-；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.57(1H，m，H-6)，5.34(1H，m，H-7)，5.14-5.24(2H，m，H-22，H-23)，3.64(1H，m，H-3)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-21)，0.94(3H，s，H-19)，0.91(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)，0.83(3H，d，J= 7.2 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J= 7.2 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.4(C-1)，32.0(C-2)，70.5(C-3)，40.8(C-4)，139.9(C-5)，119.6(C-6)，116.3(C-7)，141.4(C-8)，46.2(C-9)，37.3(C-10)，21.1(C-11)，39.1(C-12)，42.8(C-13)，54.6(C-14)，23.0(C-15)，28.3(C-16)，56.0(C-17)，12.0(C-18)，16.3(C-19)，40.4(C-20)，21.1(C-21)，135.6(C-22)，132.0(C-23)，42.8(C-24)，33.1(C-25)，19.9(C-26)，19.7(C-27)，17.6(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為(22E，24R)-麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇。

化合物10白色粉末；分子式：C29H48O；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，d，J= 5.1 Hz，H-6)，5.14(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1)，5.02(1H，dd，J= 8.6，8.6 Hz，H-2)，3.53(1H，m，H-3)，1.00(3H，brs，H-19)，0.97(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，0.84(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J= 5.3 Hz，H-27)，0.68(3H，br s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：139.7(C-1)，129.5(C-2)，71.8(C-3)，42.4(C-4)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，29.8(C-7)，31.7(C-8)，50.1(C-9)，36.2(C-10)，21.1(C-11)，37.2(C-12)，39.8(C-13)，56.8(C-14)，24.3(C-15)，28.3(C-16)，56.1(C-17)，11.9(C-18)，19.4(C-19)，34.0(C-20)，18.8(C-21)，31.9(C-22)，26.1(C-23)，45.9(C-24)，29.2(C-25)，19.0(C-26)，19.8(C-27)，23.1(C-28)，12.0(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為stigmast-1，5-dien-3β-ol。

化合物11黃色粉末；分子式：C32H26O10；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：15.24(1H，s，-OH)，12.82(1H，s，5-OH)，7.05(1H，s，H-6)，6.97(1H，s，H-7)，6.42(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7′)，6.33(1H，s，H-3)，6.19(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9′)，6.00(1H，s，H-3′)，4.03(3H，s，6′-OCH3)，3.78(3H，s，8-OCH3)，3.61(3H，s，8′-OCH3)，3.48(3H，s，10-OCH3)，2.42(3H，s，2-CH3)，2.12(3H，s，2′-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.5(C-2)，20.6(2-CH3)，110.6(C-3)，183.0(C-4)，109.4(C-4a)，156.7(C-5)，106.1(C-6)，140.8(C-6a)，101.6(C-7)，160.0(C-8)，56.0(8-OCH3)，117.3(C-9)，156.9(C-10)，61.3(10-OCH3)，108.0(C-10a)，155.1(C-10b)，166.9(C-2′)，20.7(2′-CH3)，107.4(C-3′)，184.6(C-4′)，104.3(C-4a′)，162.8(5′-OH)，108.6(C-5′a)，161.1(C-6′)，56.3(6′-OCH3)，161.1(C-6′)，56.3(6′-OCH3)，97.0(C-7′)，161.1(C-8′)，55.2(8′-OCH3)，96.3(C-9′)，140.6(C-9′a)，105.0(C-10′)，150.8(C-10′a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為fonsecinones A。

化合物12黃色粉末；分子式：C32H26O10；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：14.75(1H，s，5-OH)，13.11(1H，s，5′-OH)，7.13(1H，s，H-10)，6.98(1H，s，H-9)，6.42(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9′)，6.32(1H，s，H-3′)，6.25(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7′)，6.03(1H，s，H-3)，3.99(3H，s，10′-OCH3)，3.81(3H，s，10-OCH3)，3.63(3H，s，6-OCH3)，3.61(3H，s，8′-OCH3)，2.54(3H，s，2′-CH3)，2.40(3H，s，2-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物12為asperpyrone C。

化合物13黃色粉末；分子式：C32H26O10；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.18(1H，s，5-OH)，12.80(1H，s，5′-OH)，7.03(1H，s，H-10)，6.98(1H，s，H-9)，6.41(1H，d，J= 2.2 Hz，H-9′)，6.33(1H，s，H-3′)，6.31(1H，s，H-3)，6.20(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7′)，4.00(3H，s，10′-OCH3)，3.80(3H，s，10-OCH3)，3.63(3H，s，6-OCH3)，3.61(3H，s，8′-OCH3)，2.54(3H，s，2′-CH3)，2.47(3H，s，2-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物13為asperpyrones B。

2.2 抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

土壤真菌Aspergillusfumigatus固體發(fā)酵產(chǎn)物分離得到化合物1～13，對(duì)其中10個(gè)化合物和陽(yáng)性對(duì)照Vc進(jìn)行了DPPH、ABTS+和OH自由基抗氧化活性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表1)顯示，聚酮類(lèi)化合物8對(duì)DPPH、ABTS+和OH自由基都有一定的清除自由基效果，而甾體化合物6、9和10對(duì)DPPH沒(méi)有清除效果，但是對(duì)OH自由基有很強(qiáng)的清除自由基活性，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照。

表1 化合物對(duì)DPPH、ABTS+、OH自由基的清除活性

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 結(jié)論

本論文通過(guò)對(duì)土壤真菌煙曲霉進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，從該菌種中的乙酸乙酯層部位共分離鑒定了13個(gè)化合物，其中1、5、8、11、12和13均為聚酮類(lèi)化合物，化合物6、7、9和10為甾體類(lèi)，化合物3和4為其他類(lèi)型。其中，除化合物6以外，其他化合物均從該菌種固體發(fā)酵物中首次分離。從該土壤真菌煙曲霉分離鑒定的化合物主要是聚酮和甾體，并對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，聚酮類(lèi)化合物8對(duì)DPPH、ABTS+和OH自由基都有一定的清除效果，化合物11和12對(duì)DPPH和ABTS+有清除效果，自由基清除活性表明，芳族羥基對(duì)清除自由基活性很重要，但是甾體類(lèi)化合物6、9和10對(duì)DPPH沒(méi)有的清除效果，只對(duì)OH自由基有較強(qiáng)的清除效果。前人的研究表明甾體類(lèi)化合物對(duì)DPPH無(wú)清除效果，但是對(duì)OH自由基的效果較強(qiáng)，聚酮類(lèi)化合物對(duì)DPPH具有較強(qiáng)活性，甾體化合物和聚酮化合物都是煙曲霉中主要抗氧化活性成分。聚酮類(lèi)化合物具有一定的抗氧化作用，因?yàn)榫弁忘S酮的取代基類(lèi)似，基于自由基理論，酚羥基有很強(qiáng)的還原性，聚酮類(lèi)化合物也大多為多羥基結(jié)構(gòu)，其抗氧化能力較強(qiáng)。本研究豐富了煙曲霉的化學(xué)成分，并為今后該菌種的固體發(fā)酵培養(yǎng)和開(kāi)發(fā)利用提供了一定的參考價(jià)值。