羊角拗莖的化學(xué)成分及其抗炎活性研究

于 淼，冉紅玲，梅文莉，黃圣卓，魏艷梅，蔡彩虹，戴好富，王 昊*

1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院 海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?71101

羊角拗(Strophanthusdivaricatus(Lour.) Hook.et Arn.)又名羊角扭、鯉魚(yú)橄欖、山羊角，為夾竹桃科(Apocynaceae)羊角拗屬(Strophanthus)植物，主要分布在我國(guó)海南、云南、貴州、廣東和福建等省份，老撾、越南等南亞國(guó)家也有分布，野生于丘陵山地、路旁疏林中或山坡灌木叢中[1]。羊角拗全株植物含毒，為藥用強(qiáng)心劑，可用于治療血管硬化、跌打扭傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、蛇咬傷等癥，也可在農(nóng)業(yè)上用作殺蟲(chóng)劑[1]。研究表明羊角拗主要含有強(qiáng)心苷[2-4]，也含有倍半萜、三萜和木脂素等化學(xué)成分[5]，羊角拗的提取物具有強(qiáng)心、抗菌、抗氧化和殺蟲(chóng)等作用[6-8]，強(qiáng)心苷類化合物具有抗腫瘤、強(qiáng)心等生物活性[9,10]。為了進(jìn)一步完善羊角拗化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究，深入挖掘該植物的化學(xué)成分及其抗炎活性，本研究采用硅膠、Sephadex LH-20凝膠等多種色譜分離技術(shù)對(duì)羊角拗莖乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物分離研究，并采用LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7體外細(xì)胞炎癥模型對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行體外抗炎活性測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Autospec 300質(zhì)譜儀(英國(guó)VG公司)；分析型高效液相色譜儀(Agilent 1260)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph Laborota)；ELX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)；ZHJH-C1109C超凈工作臺(tái)(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；HHB11360-S CO2培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(德國(guó)Merck公司)；柱層析硅膠G(200～300目，60～80目)、薄層層析硅膠H(青島海洋化工廠)；氘代試劑(青島騰龍微波科技有限公司)；常用有機(jī)試劑為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)試劑(天津市康科德科技有限公司)；色譜純甲醇和乙腈(天津市科密歐有限公司)；水為超純水；濃硫酸(山東淄博濱嶺化工有限公司)；RAW 264.7細(xì)胞株(購(gòu)于中科院干細(xì)胞庫(kù))；潔特96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(TCP011096)(廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司)；磷酸緩沖液PBS、DMEM 高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)21010702)；青鏈霉素混合液(北京Solarbio公司)；胰蛋白酶(美國(guó) Amresco公司)；脂多糖(LPS)、Griess試劑、槲皮素和四甲基偶氮唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 材料

羊角拗莖于2019年9月采自海南省?？谑?，并經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所黃圣卓博士鑒定為夾竹桃科(Apocynaceae)羊角拗屬(Strophanthus)植物羊角拗(Strophanthusdivaricatus(Lour.) Hook.et Arn.)，憑證標(biāo)本(WANG202002)保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取與分離

羊角拗莖(24.4 kg)，干燥粉碎后用95%乙醇浸泡提取3次，提取液減壓濃縮得到乙醇提取物(1.5 kg)。將提取物分散于水中成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物(256.0 g)、乙酸乙酯萃取物(328.1 g)和正丁醇萃取物(438.0 g)。乙酸乙酯萃取物經(jīng)正相硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析分析后，合并得流分A～H。在HPLC-UV的指導(dǎo)下，F(xiàn)經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脫，得到12個(gè)流分(F1～F12)。F6經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1→0∶1)多次梯度洗脫后，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到化合物2(4.6 mg)、3(4.5 mg)、8(1.3 mg)、9(4.8 mg)和10(2.1 mg)。 F7經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)梯度洗脫后，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離，再經(jīng)多次硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脫得到化合物4(3.1 mg)、6(3.8 mg)和7(1.0 mg)。F8經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(6∶1→0∶1)梯度洗脫后，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離，得到化合物11(2.0 mg)、12(10.5 mg)和13(4.1 mg)，未純化部分再經(jīng)多次硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫后，通過(guò)制備薄層色譜得到化合物5(4.1 mg)。F10在甲醇中重結(jié)晶得到化合物1(115.0 mg)。

1.3.2 抗炎活性

采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7模型對(duì)化合物1～13進(jìn)行抗炎活性篩選[11,12]。實(shí)驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組(槲皮素)、LPS誘導(dǎo)組、空白對(duì)照組和不同濃度的樣品組，并將待測(cè)樣品梯度稀釋為5個(gè)濃度：100、50、25、12.5、6.25 μM。RAW 264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞液以5×104個(gè)/mL密度接種于96孔板上，于37 ℃、5% CO2、90%以上濕度條件下培養(yǎng)24 h，再分別加入50 μL配制的LPS (終濃度0.5 μg/mL)和50 μL待測(cè)化合物溶液(100～6.25 μM)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中，之后在每孔中加入100 μL的Griess試劑，于酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定并記錄吸光度A，根據(jù)公式(1)計(jì)算出NO的抑制率，通過(guò)繪制化合物濃度-抑制率曲線圖，計(jì)算化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的半抑制濃度。

抑制率=(C2-C1)/(C2-C0)×100%

(1)

式中：C0、C1、C2分別為540 nm下測(cè)得的空白對(duì)照組、不同濃度的樣品組、LPS組的吸光度。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 25.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，表中數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無(wú)色針狀晶體(甲醇)；C30H48O4，ESI-MS：m/z473.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.03(1H，s，28-OH)，5.16(1H，m，H-12)，4.40(1H，t，J= 4.1 Hz，23-OH)，4.16(1H，d，J= 4.9 Hz，3-OH)，3.42(1H，m，H-3)，3.31(1H，m，H-23a)，3.07(1H，dd，J= 10.5，4.1 Hz，H-23b)，2.74(1H，dd，J= 13.5，4.1 Hz，H-18)，1.09(3H，s，27-CH3)，0.86(3H，s，25-CH3)，0.86(3H，s，29-CH3)，0.86(3H，s，30-CH3)，0.71(3H，s，26-CH3)，0.52(3H，s，24-CH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：37.9(C-1)，26.6(C-2)，70.3(C-3)，41.4(C-4)，47.1(C-5)，17.5(C-6)，32.1(C-7)，38.8(C-8)，46.4(C-9)，36.3(C-10)，22.6(C-11)，121.6(C-12)，143.9(C-13)，41.9(C-14)，27.2(C-15)，22.9(C-16)，45.5(C-17)，40.8(C-18)，45.7(C-19)，30.4(C-20)，33.3(C-21)，30.2(C-22)，64.5(C-23)，12.7(C-24)，15.5(C-25)，16.9(C-26)，25.7(C-27)，178.6(C-28)，32.9(C-29)，23.4(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物1為常春藤皂苷元(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。

圖1 羊角拗莖中化合物1～13的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-13 from the stems of S.divaricatus

化合物2黃色油狀；C11H16O3，ESI-MS：m/z197.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.75(1H，s，H-2)，4.22(1H，m，H-6)，2.42(1H，m，H-7a)，1.99(1H，m，H-5a)，1.74(1H，d，J= 4.0 Hz，H-7b)，1.53(1H，dd，J= 14.4，4.0 Hz，H-5b)，1.76(3H，s，H-10)，1.47(3H，s，H-11)，1.28(3H，s，H-9)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：174.4(C-1)，113.3(C-2)，185.7(C-3)，37.2(C-4)，47.9(C-5)，67.3(C-6)，46.4(C-7)，88.9(C-8)，31.0(C-9)，27.4(C-10)，26.9(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物2為(-)-loliolide。

化合物3黃色油狀；C13H22O4，ESI-MS：m/z243.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.17(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.18(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，3.75(1H，m，H-3)，2.30(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4a)，1.65(1H，dd，J= 9.1，5.2 Hz，H-4b)，1.57(1H，d，J= 11.9 Hz，H-2a)，1.26(1H，d，J= 11.9 Hz，H-2b)，2.28(3H，s，H-10)，1.19(3H，s，H-12)，1.18(3H，s，H-13)，0.96(3H，s，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：36.1(C-1)，47.6(C-2)，64.3(C-3)，41.3(C-4)，68.7(C-5)，70.8(C-6)，145.5(C-7)，133.8(C-8)，200.3(C-9)，27.5(C-10)，25.2(C-11)，29.8(C-12)，20.1(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物3為(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物4黃色油狀；C13H20O2，ESI-MS：m/z209.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.75(1H，dd，J= 15.7，9.5 Hz，H-7)，6.11(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，5.55(1H，br s，H-4)，4.15(1H，m，H-3)，2.34(1H，d，J= 9.5 Hz，H-6)，1.60(1H，dd，J= 12.9，6.7 Hz，H-2a)，1.43(1H，dd，J= 12.9，9.5 Hz，H-2b)，2.25(3H，s，H-11)，1.62(3H，s，H-13)，0.97(3H，s，H-12)，0.88(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：35.9(C-1)，41.0(C-2)，66.9(C-3)，127.7(C-4)，136.1(C-5)，55.5(C-6)，150.3(C-7)，133.4(C-8)，201.0(C-9)，29.6(C-10)，27.2(C-11)，27.0(C-12)，22.6(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物4為(3R,6R,7E)-3-hydroxy-4,7-megastigmadien-9-one。

化合物5白色粉末；C20H22O6，ESI-MS：m/z359.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.94(2H，d，J= 1.7 Hz，H-2，H-2′)，6.80(2H，dd，J= 8.1，1.8 Hz，H-6，H-6′)，6.76(2H，d，J= 8.1 Hz，H-5，H-5′)，4.70(2H，d，J= 4.4 Hz，H-7，H-7′)，4.22(2H，m，H-9a，H-9a′)，3.82(2H，m，H-9b，H-9b′)，3.13(2H，m，H-8，H-8′)，3.84(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：133.8(C-1，C-1′)，111.0(C-2，C-2′)，149.1(C-3，C-3′)，147.3(C-4，C-4′)，116.1(C-5，C-5′)，120.1(C-6，C-6′)，87.5(C-7，C-7′)，55.4(C-8，C-8′)，72.6(C-9，C-9′)，56.4(3-OCH3，3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物5為松脂素。

化合物6黃色粉末；C20H22O6，ESI-MS：m/z359.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.96(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2)，6.91(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′)，6.89(1H，m，H-5)，6.89(1H，m，H-5′)，6.84(1H，dd，J= 8.1，1.5 Hz，H-6)，6.79(1H，dd，J= 8.1，1.5 Hz，H-6′)，4.86(1H，d，J= 5.3 Hz，H-7′)，4.43(1H，d，J= 7.1 Hz，H-7)，4.12(1H，d，J= 9.5 Hz，H-9a)，3.85(1H，m，H-9b)，3.85(1H，m，H-9a′)，3.33(1H，m，H-8′)，3.33(1H，m，H-9b′)，2.91(1H，dd，J= 14.8，7.0 Hz，H-8)，3.92(3H，s，5-OCH3)，3.90(3H，s，5′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：133.2(C-1)，108.7(C-2)，146.9(C-3)，145.5(C-4)，114.4(C-5)，119.3(C-6)，87.9(C-7)，54.6(C-8)，71.1(C-9)，130.5(C-1′)，108.5(C-2′)，146.6(C-3′)，144.7(C-4′)，114.4(C-5′)，118.6(C-6′)，82.2(C-7′)，50.3(C-8′)，69.8(C-9′)，56.1(5-OCH3)，56.1(5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物6為表松脂素。

化合物7黃色粉末；C15H14O5，ESI-MS：m/z275.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.51(2H，d，J= 1.9 Hz，H-2，H-2′)，7.36(2H，dd，J= 8.3，1.9 Hz，H-6，H-6′)，6.89(2H，d，J= 8.3 Hz，H-5，H-5′)，3.94(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：126.5(C-1，C-1′)，111.9(C-2，C-2′)，149.7(C-3，C-3′)，155.4(C-4，C-4′)，116.3(C-5，C-5′)，127.7(C-6，C-6′)，195.6(C-7)，56.4(3-OCH3，3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物7為4,4′-dihydroxy-3,3′-dimethoxybenzophen-one。

化合物8黃色粉末；C15H12O6，ESI-MS：m/z289.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.81(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3′，H-5′)，5.88(1H，s，H-8)，5.33(1H，dd，J= 12.9，3.0 Hz，H-2)，3.11(1H，dd，J= 17.1，12.9 Hz，H-3a)，2.69(1H，dd，J= 17.1，3.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：80.5(C-2)，44.1(C-3)，197.8(C-4)，159.0(C-5)，131.3(C-6)，164.9(C-7)，96.2(C-8)，165.4(C-9)，103.3(C-10)，131.1(C-1′)，129.0(C-2′)，116.3(C-3′)，165.5(C-4′)，116.3(C-5′)，129.0(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物8為6-羥基柚皮素。

化合物9黃色油狀；C10H8O4，ESI-MS：m/z193.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.90(1H，d，J= 9.4 Hz，H-4)，7.20(1H，s，H-5)，6.77(1H，s，H-8)，6.31(1H，d，J= 9.4 Hz，H-3)，3.81(3H，s，6-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：160.7(C-2)，111.7(C-3)，144.5(C-4)，109.6(C-5)，145.3(C-6)，149.5(C-7)，102.8(C-8)，151.2(C-9)，110.6(C-10)，56.0(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物9為東莨菪素。

化合物10棕色粉末；C11H10O5，ESI-MS：m/z223.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.88(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4)，6.75(1H，s，H-6)，6.35(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，3.92(3H，s，8-OCH3)，3.91(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：163.1(C-2)，115.3(C-3)，146.3(C-4)，101.0(C-5)，141.7(C-6)，151.7(C-7)，140.0(C-8)，139.8(C-9)，116.0(C-10)，56.6(7-OCH3)，61.4(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物10為6-羥基-7,8 -二甲氧基香豆素。

化合物11棕色粉末；C7H6N2，ESI-MS：m/z119.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6)，7.93(1H，s，H-3)，7.42(1H，d，J= 8.2 Hz，H-7)，7.17(1H，m，H-4)，7.16(1H，m，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：132.7(C-3)，121.9(C-4)，121.8(C-5)，127.2(C-6)，112.5(C-7)，137.6(C-8)，121.3(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物11為吲唑。

化合物12黃色粉末；C8H8O4，ESI-MS：m/z169.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，overlapped，H-2)，7.57(1H，overlapped，H-6)，6.85(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5)，3.91(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：123.4(C-1)，114.1(C-2)，149.0(C-3)，153.0(C-4)，116.1(C-5)，125.6(C-6)，56.7(3-OCH3)，170.3(1-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物12為香草酸。

化合物13白色粉末；C7H6O3，ESI-MS：m/z139.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.89(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，H-6)，6.84(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：122.7(C-1)，133.0(C-2，C-6)，116.0(C-3，C-5)，163.3(C-4)，170.1(1-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物13為對(duì)羥基苯甲酸。

2.2 抗炎活性結(jié)果

化合物1～13的抗炎活性結(jié)果表明，僅化合物5能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO，IC50值為18.09 ± 1.09 μM，略弱于陽(yáng)性對(duì)照槲皮素(11.54±0.23 μM)。其他化合物未顯示明顯抗炎活性(見(jiàn)表1)。

表1 化合物1～13的對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的半數(shù)抑制濃度(n = 3)

3 結(jié)論

本研究首次從羊角拗莖中分離鑒定13個(gè)化合物(1～4和6～13)，其中文獻(xiàn)報(bào)道五環(huán)三萜常春藤皂苷元(1)具有抗腫瘤、抗抑郁和抗菌等活性[26]，有待進(jìn)一步研究。采用LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7模型的抗炎活性篩選結(jié)果表明，松脂素(5)具有顯著的抗炎活性，IC50值為18.09±1.09 μM。本研究豐富了羊角拗的化合物類型，也為其抗炎活性研究提供了依據(jù)。