紅毛五加多糖單一組分AHP-Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制

許 財(cái)，郭曉曉，馬 媛，王麒超，孟愛霞，陳 永*

1濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；2濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濰坊 261000

中藥紅毛五加皮為五加科植物紅毛五加(AcanthopanaxgiraldiiHams)的莖皮，主產(chǎn)于甘肅、寧夏、青海、四川等地，具有祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨，活血利水之功效[1]。紅毛五加多糖(AcanthopanaxgiraldiiHams polysaccharide)為其有效成分之一，具有抗腫瘤[2]、抗病毒[3]、保肝[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等藥理作用。

巨噬細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體不同組織中，不但參與固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫，而且是兩者間的“橋梁細(xì)胞”[6]，活化的巨噬細(xì)胞可吞噬外來異物或直接殺死病原體和腫瘤細(xì)胞；并可通過釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、NO等相關(guān)細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。已有研究表明，中藥多糖可以激活巨噬細(xì)胞促進(jìn)TNF-α、IL-6和NO等細(xì)胞因子的釋放[7]。

本文以課題組前期從紅毛五加皮中提取到的多糖單一組分AHP-Ⅲ[8]為研究對(duì)象研究其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞的活化作用，并嘗試探討其機(jī)制。

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

紅毛五加多糖AHP-Ⅲ(由課題組前期制備)；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為8119461、1618862)；Mouse IL-6 Uncoated ELISA Kit 和Mouse TNF-αELISA Kit(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)分別為229646-005、228922-007)；總一氧化氮檢測(cè)試劑盒和CCK-8檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為0827220201019、010919190704)；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(中國(guó)TaKaRa公司，批號(hào)：AJF2613A)；NF-κB p65 Rabbit mAb、phospho-NF-κB p65 Rabbit mAb、IKK-β(D30C6)Rabbit mAb、Phospho-IKKα/β(Ser176/180)Rabbit mAb、IκBα(L35A5)Mouse mAb、Phospho-IκBα(Ser32)Rabbit mAb(美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)分別為8242、3033、8943、2697、7074、7076、4814、2859)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

HERACELL 150i 200型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(丹麥Heto公司)；HE LaserJet 1020 plus Epoch超微量分光光度計(jì)購(gòu)于(美國(guó)Bio Tek公司)；LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(羅氏公司)；Amersham lmager 600超靈敏數(shù)字發(fā)光成像儀(Cytiva公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7巨噬細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，每3天傳代1次，傳代比例1∶3，傳代次數(shù)不超過30代。

2.2 吞噬能力檢測(cè)

采用中性紅吞噬法[9]檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬能力。將細(xì)胞按7×104個(gè)/孔，接種于96孔板，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)孔中加入不同濃度(25、50、100 μg/mL)AHP-Ⅲ，對(duì)照(LPS)孔中加入0.1 μg/mL LPS，空白(blank)孔加入相同體積培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。每孔加入1%中性紅溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，PBS洗滌3次，每孔加200 μL中性紅檢測(cè)裂解液，室溫?fù)u床上裂解10 min，酶標(biāo)儀540 nm檢測(cè)各孔吸光度值。計(jì)算吞噬率：吞噬率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白組吸光度值)×100%。

2.3 TNF-α、IL-6分泌量檢測(cè)

按“2.2”的實(shí)驗(yàn)分組給藥，培養(yǎng)24 h后收集上清，按照Thermo公司ELISA試劑盒說明書，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A450 nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清中的IL-6和TNF-α的濃度。

2.4 NO分泌量檢測(cè)(Griess法)[10]

按“2.2”的試驗(yàn)分組給藥，培養(yǎng)24 h后收集上清(60 μL)，按照試劑說明書進(jìn)行操作，與Griess試劑混合，避光反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀540 nm測(cè)定吸光度。NO濃度參考NaNO2(2～80 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)[11]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW 264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度至7.5×105個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。按“2.2”的實(shí)驗(yàn)分組給藥，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。Trizon試劑提取總RNA。利用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。每樣品各取1 μL的cDNA按照TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ說明書進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，所用引物如表1所示。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s共循環(huán)30次，73 ℃終末延伸5 min。程序運(yùn)行結(jié)束后，記錄收集Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR所用引物序列

2.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)[12]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW 264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度至2×106個(gè)/mL，每個(gè)培養(yǎng)皿(d=60 mm)加入1 mL細(xì)胞懸液、4 mL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)過夜，按“2.2”的實(shí)驗(yàn)分組給藥后繼續(xù)培養(yǎng)1 h。加入RIPA細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞直至細(xì)胞完全裂解，離心收集上清，提取蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。每組各取40 μg蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(濃縮膠電壓80 V，30 min；分離膠電壓100 V，60 min)。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移(100 mA，60 min)至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉于搖床上室溫封閉1 h，再分別加入一抗抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日以TBST洗膜3次，每次10 min；之后加入HRP標(biāo)記的二抗(體積稀釋比例為1∶1 000)，于室溫反應(yīng)1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL試劑盒說明書進(jìn)行曝光顯影。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 AHP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞免疫活性影響檢測(cè)

3.1.1 AHP-Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7吞噬能力的影響

與空白組相比，AHP-Ⅲ在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(25～100 μg/mL)均可增強(qiáng)RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力(P<0.05)，如圖1所示。

圖1 AHP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.1 Effect of AHP-Ⅲ on the phagocytosis of RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05。Note:Compared with blank group,*P<0.05.

3.1.2 AHP-Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞因子分泌的影響

如圖2所示，與空白組相比，AHP-Ⅲ在25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，可顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌TNF-α(P<0.05或P<0.001)，并呈劑量依賴性。同時(shí)，AHP-Ⅲ高劑量實(shí)驗(yàn)組可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-6(P<0.05)。

圖2 AHP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6的影響Fig.2 Effect of AHP-III on the release of TNF-α and IL-6 from RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.3 AHP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7 NO生成的影響

如圖3所示，AHP-Ⅲ在3個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組均能顯著增加RAW 264.7細(xì)胞NO的釋放(P<0.05或P<0.001)，中、高劑量組釋放量高于低劑量組，且AHP-Ⅲ濃度為50 μg/mL時(shí)，RAW 264.7的NO釋放量最高。

圖3 HP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響Fig.3 Effect of HP-III on NO release from RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.4 AHP-Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7中TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響

TNF-α、IL-6和iNOS基因相對(duì)表達(dá)水平的結(jié)果顯示，與空白組相比，AHP-Ⅲ的25 μg/mL濃度組TNF-α基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，50 μg/mL和100 μg/mL濃度組TNF-α基因表達(dá)水平極顯著升高(P<0.001)，如圖4A所示。如圖4B所示，AHP-Ⅲ的50 μg/mL和100 μg/mL濃度組IL-6基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05或P<0.001)。如圖4C所示，AHP-Ⅲ的25 μg/mL濃度組iNOS基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，50 μg/mL和100 μg/mL濃度組iNOS基因表達(dá)水平極顯著升高(P<0.001)。并且，與空白組相比AHP-Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6和iNOS基因相對(duì)表達(dá)量的影響具有明顯的劑量依賴性。

圖4 AHP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of AHP-III on the expression levels of TNF-α,IL-6 and iNOS mRNA in RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.5 AHP-Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響的測(cè)定

如圖5所示，與空白組相比，AHP-Ⅲ實(shí)驗(yàn)組中的磷酸化p65(p-p65)/p65蛋白表達(dá)水平比值升高，當(dāng)AHP-Ⅲ給藥濃度為50 μg/mL時(shí)達(dá)到最高，且具有顯著性差異(P<0.05)(見圖5B)；磷酸化IKKβ(p-IKKβ)/IKKβ蛋白表達(dá)水平比值在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)上升并具有顯著性差異(P<0.001)(見圖5C)。磷酸化IκBα(p-IκBα)/IκBα蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均高于空白組，且具有顯著性差異，但沒有劑量依賴性(見圖5D)。以上結(jié)果表明AHP-Ⅲ作用RAW 264.7細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB通路會(huì)被激活。

圖5 AHP-Ⅲ對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of AHP-Ⅲ on expression of NF-κB related protein in RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

4 討論與結(jié)論

免疫反應(yīng)通過“識(shí)別”和排除抗原性異物，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定。炎癥是由劇烈的免疫反應(yīng)引起[13]，其特征是協(xié)調(diào)激活各種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞和血液白細(xì)胞中促炎和抗炎介質(zhì)的表達(dá)；有效的炎癥反應(yīng)依賴于免疫系統(tǒng)、血管系統(tǒng)和組織之間復(fù)雜的細(xì)胞和分子相互作用，可提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能，例如植物多糖等可激活巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其吞噬殺傷功能，以及釋放相關(guān)的細(xì)胞因子達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用[14,15]。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體中發(fā)揮抵抗感染、保持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及免疫監(jiān)視的作用，活化后的巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥有關(guān)的生物活性分子，如NO、白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等。已有報(bào)道表明巨噬細(xì)胞能夠作為多糖的靶細(xì)胞，通常作為理想的細(xì)胞模型來評(píng)估多糖的免疫調(diào)節(jié)活性[16]。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)西洋參花多糖可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力以及釋放免疫因子等方面增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫活性。另外，靈芝多糖和豬苓多糖經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞同樣具有激活作用[18]。

目前關(guān)于多糖生物活性的研究多針對(duì)粗多糖，其成分復(fù)雜，不便于闡明多糖作用機(jī)制[19]。課題組前期從紅毛五加粗多糖分離純化得到3個(gè)單一組分[20]，本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，探討紅毛五加多糖AHP-Ⅲ對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的激活作用及機(jī)制。

巨噬細(xì)胞的吞噬作用是先天性免疫的基本防御機(jī)制，中性紅實(shí)驗(yàn)表明AHP-Ⅲ可以增強(qiáng)RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)具有顯著性差異。NO是由巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種信號(hào)分子，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)方面起重要作用[21]，由3種NO合成酶催化產(chǎn)生，其中一些外來刺激如干擾素類、炎癥因子類(TNF-α、IL-6)等都可激活誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)[22,23]。IL-6和TNF-α常被用作促炎細(xì)胞因子系統(tǒng)激活的標(biāo)志[24]，RT-qPCR和ELISA實(shí)驗(yàn)表明，AHP-Ⅲ通過提高TNF-α、IL-6基因表達(dá)水平，增加該細(xì)胞因子釋放量，其中ELISA實(shí)驗(yàn)中空白組TNF-α細(xì)胞因子的釋放量低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低閾值，釋放量較少，計(jì)算結(jié)果為0；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明iNOS基因表達(dá)水平隨著給藥劑量增大而升高，且與空白組相比具有顯著性差異；同時(shí)，通過Griess試驗(yàn)可知，與空白組相比給藥組NO分泌量顯著增加。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AHP-Ⅲ可通過提高細(xì)胞因子基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，起到免疫調(diào)節(jié)作用。

NF-κB長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是一種典型的促炎信號(hào)通路，很大程度上基于促白細(xì)胞介素等促炎細(xì)胞因子和腫瘤壞死因子激活，可通過巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[25,26]。RAW 264.7巨噬細(xì)胞受TNF-α和IL-6等炎癥因子刺激后激活NF-κB信號(hào)通路中的IKK激酶，磷酸化的IKK可使IκBa磷酸化并被降解，釋放NF-κB二聚體，提高NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平[27]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AHP-Ⅲ刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞后，NF-κB中的p65、IKKβ和IκBα磷酸化水平明顯升高。證實(shí)AHP-Ⅲ可能通過誘導(dǎo)NF-κB中p65和IKKβ磷酸化來激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞活化。

綜上所述，AHP-Ⅲ試驗(yàn)組相較于空白組RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著提升，細(xì)胞因子NO、IL-6和TNF-α釋放量和基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，且具有一定的劑量依賴性；同時(shí)NF-κB信號(hào)通路中的p65、IKKβ磷酸化水平明顯提高。由此可知AHP-Ⅲ可能通過激活NF-κB信號(hào)通路達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用，為紅毛五加多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。