中藥靈芝降羊毛甾烷三萜類成分研究

梁旭博，王 妍，司盈盈，趙琪璐，趙晨光，杜 錕，馮衛(wèi)生*，趙珍珠*

1河南中醫(yī)藥大學藥學院；2河南省中藥開發(fā)工程技術研究中心，鄭州 450046

目前被報道的真菌約有100 000種，但是據(jù)估計仍有更多的真菌還未被具體鑒定種類[1]。許多大型真菌(俗稱蘑菇)是許多結構新穎和(或)活性顯著的天然產(chǎn)物的來源，多孔菌科的靈芝便是其中一種[2-5]。

靈芝為擔子菌門多孔菌科靈芝屬多種靈芝的干燥子實體，是我國常見的藥食兩用的真菌，作為藥物使用最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，迄今已有上千年的用藥歷史[9-11]。自20世紀50年代以來，靈芝子實體已實現(xiàn)了人工栽培，隨著靈芝菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)技術的發(fā)展，靈芝的研究和開發(fā)日益廣泛[11]。靈芝中的化學成分十分豐富，包含多糖、蛋白質、有機酸、小分子生物堿、倍半萜、三萜、甾體，這些化合物均表現(xiàn)出多種藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化等[6-8]。其中三萜是靈芝子實體中的主要活性次生代謝產(chǎn)物，具有廣泛藥理活性，逐步引起人們的重視[11,12]。目前從靈芝中分離得到的三萜多為6/6/6/5駢合的四環(huán)羊毛甾烷類，數(shù)量已超過200個[5,11-13]。前期，我們從不同種類的靈芝中發(fā)現(xiàn)了大量新穎三萜、少量生物堿和倍半萜[14-16]。為了進一步了解中藥靈芝的藥效物質基礎，提高其資源綜合利用效率，本文對靈芝子實體的95%乙醇部位的化學成分進行了分離純化和結構鑒定，并測試了分離化合物的體外抗腫瘤活性，以期發(fā)現(xiàn)具有進一步研究價值的活性分子。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

白血病(HL-60)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC-7721)、乳腺癌(MCF-7)、結腸癌(SW480)細胞均由中國科學院昆明植物研究所天然藥物活性篩選中心提供。

柱色譜為正相硅膠(青島海洋化工有限公司)和Sephadex LH-20凝膠(40～70 μm，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞士)；預制硅膠薄層G板(10～40 μm青島海洋化工廠)；ODS(40～60 μm，YMC)；中壓制備色譜系統(tǒng)Sepacore X10(德國Büchi公司)；1260高壓制備液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AVANCE 600核磁共振儀(TMS為內標)(德國布魯克公司)；Maxis HD型飛行時間質譜儀(德國布魯克公司)；Agilent Zorbax SB-C18液相色譜柱(粒徑5 μm，規(guī)格9.4 mm × 150 mm)；SCIEX Qtrap 5500質譜儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，所用分析純和色譜純試劑為天津恒興和天津四友精細化學有限公司生產(chǎn)。顯色劑：10%濃硫酸乙醇，同時結合紫外燈(254 nm)觀察。

靈芝2015年買自云南省昆明市螺螄灣中藥材市場，經(jīng)北京林業(yè)大學戴玉成教授鑒定為G.lingzhi，標本(NO.HFC 20150518)收藏于河南中醫(yī)藥大學天然產(chǎn)物研究室。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取分離

靈芝子實體G.lingzhi自然晾干并稱重(10.0 kg)，粉碎后，95%的工業(yè)乙醇提取三次(每次浸泡3天，每次50 L)。將三次收集的乙醇液合并得含有靈芝成分的提取液，隨后減壓濃縮至10 L的水濃縮液。濃縮液用等體積乙酸乙酯萃取四次得到總乙酸乙酯層，減壓濃縮得粗浸膏400 g。粗浸膏拌樣后過正相硅膠柱，石油醚和丙酮梯度洗脫(體積比10∶1洗脫10 L；5∶1洗脫10 L；2∶1洗脫10 L；1∶1洗脫10 L)，每500 mL接一瓶，減壓濃縮至溶劑揮干；根據(jù)硅膠薄層層析結果合并成5個組分(A～E)。

組分C(27 g)和D(34 g)經(jīng)中壓色譜制備系統(tǒng)分別制備得到22個組分(C1～C22)和10個組分(D1～D10)，洗脫劑為甲醇/水(V/V，20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0，每個梯度各沖5 000 mL，流速為35 mL/min)。

組分C17(44 mg)過甲醇凝膠柱，結合硅膠薄層層析結果合并后減壓濃縮得到6個組分C17a～C17f。組分C17a經(jīng)丙酮凝膠(型號LH-20)分成5個部位(C17a1～C17a5)，最后化合物1(8.5 mg，tR= 15.0 min)經(jīng)高壓制備液相色譜分離純化得到(條件為梯度洗脫，MeCN/H2O(V/V)：45∶55→65∶35，25 min，7 mL/min)。組分D9經(jīng)甲醇凝膠色譜分為6部分(D9a～D9f)，接著各組分分別經(jīng)丙酮凝膠處理。經(jīng)高壓制備液相色譜純化，化合物2(1.3 mg，tR= 20.2 min)從D9d8組分獲得(條件為梯度洗脫，MeCN/H2O(V/V)：60∶40→80∶20，25 min，7 mL/min)。組分D8經(jīng)甲醇凝膠得D8a～D8i組分，接著D8d經(jīng)丙酮凝膠分離得6個組分(D8d1～D8d6)，然后D8d2過正相色譜(洗脫劑為石油醚/丙酮，體積比為2∶1，等度洗脫)得到8個組分，而化合物3(4.4 mg，tR= 8.8 min)從組分D8d28制備(條件為梯度洗脫，MeCN/H2O(V/V)：28∶72→53∶47，25 min，7 mL/min)獲得。組分D4經(jīng)甲醇凝膠色譜分為10個組分(D4a～D4J)，組分D4b經(jīng)高壓制備液相色譜(條件為梯度洗脫，MeCN/H2O(V/V)，25∶75→50∶50，25 min，7 mL/min)純化獲得化合物4(12.3 mg，tR= 11.0 min)和化合物5(14.6 mg，tR= 19.0 min)。

1.2.2 細胞毒活性篩選

MTS法檢測細胞活性原理：MTS為一種全新的MTT類似物，全稱為3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一種黃顏色的染料?；罴毎€粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTS，生成可溶性的甲臜(formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶標儀在490 nm處進行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細胞的數(shù)目。具體實驗方法為：

接種細胞：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM或者RMPI1640)配成單個細胞懸液(白血病(HL-60)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC-7721)、乳腺癌(MCF-7)、結腸癌(SW480))，以每孔3 000～15 000個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，細胞提前12～24 h接種培養(yǎng)。加入待測化合物溶液：化合物用DMSO溶解，化合物以40 μM濃度初篩，每孔終體積200 μL，每種處理均設3個復孔。顯色：37 ℃培養(yǎng)48 h后，貼壁細胞棄孔內培養(yǎng)液，每孔加MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL；懸浮細胞棄100 μL培養(yǎng)上清液，每孔加20 μL的MTS溶液；設3個空白復孔(MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL的混合液)，繼續(xù)孵育2～4 h，使反應充分進行后測定光吸收值。比色：選擇492 nm波長，多功能酶標儀(MULTISKAN FC)讀取各孔光吸收值，記錄結果，數(shù)據(jù)處理后以化合物編號為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標繪制5株細胞的抑制率圖。

抑制率的計算公式為：

抑制率=(1-OD加藥/OD對照)× 100%

2 結果

2.1 結構鑒定

表1 化合物1和2的1H和13C NMR數(shù)據(jù)(600和150 MHz)

續(xù)表1 (Continued Tab.1)

圖1 化合物1～5的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-5

圖2 化合物1的結構及關鍵2D NMR相關信號Fig.2 The structure and key 2D NMR correlations of compound 1

圖3 化合物2的結構及關鍵2D NMR相關信號Fig.3 The structure and key 2D NMR correlations of compound 2

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z456.5，結合13C NMR和DEPT譜推導其分子式為C27H36O6。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：2.87(1H，m，H-1)，1.59(1H，m，H-1)，2.54(1H，m，H-2)，2.49(1H，m，H-2)，1.75(1H，dd，J= 13.6，1.1 Hz，H-5)，2.12(1H，dd，J= 12.3，8.4 Hz，H-6)，1.61(1H，m，H-6)，4.93(1H，d，J= 5.8 Hz，H-7)，3.02(1H，d，J= 17.0 Hz，H-12)，2.57(1H，m，H-12)，2.69(1H，m，H-16)，2.59(1H，m，H-16)，3.15(1H，m，H-17)，0.90(3H，s，H-18)，1.23(3H，s，H-19)，5.08(1H，s，H-21)，4.94(1H，s，H-21)，2.43(1H，m，H-22)，2.31(1H，m，H-22)，2.50(1H，m，H-23)，1.13(3H，s，H-28)，1.09(3H，s，H-29)，1.43(3H，s，H-30)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：36.7(C-1)，35.1(C-2)，219.7(C-3)，47.8(C-4)，49.5(C-5)，29.0(C-6)，67.1(C-7)，160.0(C-8)，142.2(C-9)，39.3(C-10)，200.0(C-11)，50.2(C-12)，46.4(C-13)，59.7(C-14)，218.1(C-15)，39.8(C-16)，47.1(C-17)，19.5(C-18)，18.6(C-19)，146.9(C-20)，112.2(C-21)，33.4(C-22)，34.7(C-23)，178.1(C-24)，27.5(C-28)，21.1(C-29)，25.3(C-30)。由EI-MS、1H NMR、13C NMR、DEPT及2D NMR數(shù)據(jù)確定化合物3的結構，并且數(shù)據(jù)與文獻報道的20(21)-dehydrolucidenic acid A[17]一致。

化合物4針狀結晶(甲醇)；mp.280～281 ℃，ESI-MS：m/z402.2，結合13C NMR和DEPT譜推導其分子式為C24H34O5。13C NMR(150 MHz，C5D6N)δ：37.1(C-1)，29.0(C-2)，77.9(C-3)，39.7(C-4)，50.0(C-5)，28.6(C-6)，66.9(C-7)，158.8(C-8)，143.2(C-9)，39.7(C-10)，197.8(C-11)，50.0(C-12)，45.7(C-13)，58.9(C-14)，215.2(C-15)，35.8(C-16)，54.6(C-17)，19.0(C-18)，20.0(C-19)，206.5(C-20)，31.4(C-21)，29.1(C-28)，16.8(C-29)，25.6(C-30)。經(jīng)與文獻[18,19]對照，鑒定化合物4為赤芝酮A。

化合物5無色油狀；ESI-MS：m/z398.2，結合13C NMR和DEPT譜推導其分子式為C24H30O5。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.90(1H，m，H-1)，1.75(1H，m，H-1)，2.63(1H，m，H-2)，2.48(1H，m，H-2)，2.32(1H，dd，J= 15.0，2.2 Hz，H-5)，2.70(1H，dd，J= 15.0，13.9 Hz，H-6)，2.49(1H，dd，J= 13.9，2.2 Hz，H-6)，3.06(1H，d，J= 15.8 Hz，H-12)，2.84(1H，d，J= 15.8 Hz，H-12)，2.85(1H，overlapped，H-16)，2.62(1H，overlapped，H-16)，3.37(1H，dd，J= 8.7，8.7 Hz，H-17)，0.77(3H，s，H-18)，1.27(3H，s，H-19)，2.20(3H，s，H-21)，1.14(3H，s，H-28)，1.11(3H，s，H-29)，1.69(3H，s，H-30)。經(jīng)與文獻[20]對照，鑒定化合物5為4,4,14α-trimethyl-3,7，11,15,20-pentaoxo-5α-pregn-8-en(即lucidadone H)。同時結合lucidone D[21]和lucidone H[22]的碳譜數(shù)據(jù)，首次歸屬了化合物5的碳譜數(shù)據(jù)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.5(C-1)，33.9(C-2)，215.3(C-3)，43.8(C-4)，51.0(C-5)，37.4(C-6)，199.1(C-7)，146.3(C-8)，150.1(C-9)，39.6(C-10)，198.3(C-11)，47.7(C-12)，47.1(C-13)，56.8(C-14)，205.5(C-15)，34.7(C-16)，52.5(C-17)，18.8(C-18)，20.4(C-19)，205.2(C-20)，31.5(C-21)，27.8(C-28)，17.9(C-29)，21.2(C-30)。

2.2 體外細胞毒活性篩選

對分離得到化合物1～5在五株常規(guī)腫瘤細胞株進行活性篩選。結果顯示在40 μM時，化合物1～5均未表現(xiàn)出明顯的細胞毒活性。

3 結論

靈芝三萜類化合物相對分子質量一般為400～600，母核上常見含氧官能團，如羥基、羧基、酮基、甲氧基、乙酰氧基等。根據(jù)骨架上碳原子數(shù)靈芝三萜可分為C30、C27和C24；依據(jù)所連接官能團和側鏈結構不同，又可分為靈芝酸類、醇類、醛類、內酯類等幾大類[11,12]。通過對靈芝(G.lingzhi)子實體進行提取分離，共得到5個高氧化度的降羊毛甾烷三萜，其中化合物1和2為新的24-降羊毛甾烷三萜類化合物，和化合物3同屬于C27類；化合物4和5屬于C24類羊毛甾烷三萜。靈芝中的三萜結構復雜多樣，表現(xiàn)出生物活性也十分豐富，尤其是抗腫瘤活性[11,12]。因此，對化合物1～5進行了體外抗腫瘤活性篩選(HL-60、A549、SMMC-7721、MCF-7、SW480)，但均未表現(xiàn)出明顯細胞毒活性。G.lingzhi是2012年首次被戴玉成教授提出的靈芝新種[23]，后來被認為和G.sichuanense是同一個品種[24]，對其化學成分的報道較少[16,25]。本文的研究為更好地開發(fā)利用靈芝屬的靈芝、豐富該菌化學成分的種類和探究其有效活性成分奠定了一定的理論基礎。