活性氧物種熒光探針研究進(jìn)展*

王博，鄧威力，李達(dá)諒

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

1 引言

活性氧物種(Reactive Oxygen Species，ROS)在炎癥、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)退行性損傷等不同生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用，其濃度異常極易引起的氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激導(dǎo)致各種疾病。因此，定量測定活性細(xì)胞、組織和生物體內(nèi)ROS的濃度水平是非常重要的。小分子的熒光探針能夠用于定量定性分析ROS在體內(nèi)外的分布情況，且能夠?qū)OS存在的空間和時間進(jìn)行有效分辨。因此，熒光探針被認(rèn)為是幫助現(xiàn)代氧化還原生物學(xué)突破的一個極好的工具[1]。將熒光探針與影像技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)不同細(xì)胞器的微環(huán)境進(jìn)行量身定做，實現(xiàn)了亞細(xì)胞水平相關(guān)生物分子濃度變化的示蹤和動態(tài)成像檢測[2,3]。熒光成像因其高靈敏度、原位觀察、實時監(jiān)測、無創(chuàng)測量和高性價比的性能而被公認(rèn)為活細(xì)胞研究最強(qiáng)大的工具之一[4]。

2 ROS 熒光探針的研究進(jìn)展

當(dāng)前，檢測ROS含量的方法主要有原子吸收光譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法等，這些方法普遍存在消耗時間長、檢測方式復(fù)雜、靈敏度較低等問題，極大地限制了其實際應(yīng)用。相比之下，利用熒光探針作為新型的檢測手法，擁有著操作簡易、靈敏度高、成像速度快、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[5]。

2.1 次氯酸熒光探針的研究進(jìn)展

次氯酸（HClO）作為生物體內(nèi)一種重要的活性氧物質(zhì)， 在免疫防御等生理過程中具有重要的作用。HClO/ClO-能破壞侵入性細(xì)菌和病原體，以低濃度調(diào)節(jié)機(jī)體的生理平衡，也能引起生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、膽固醇、核酸等生物分子的氧化。由于ROS合成和抗氧化劑之間的平衡對于維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要，故而生物體內(nèi)一旦產(chǎn)生過量的次氯酸，極易引起骨關(guān)節(jié)炎、肺損傷、心血管疾病和癌癥等各種疾病，尤其在發(fā)育早期階段，過量的HClO/ClO-可能導(dǎo)致長期影響、致畸性甚至死亡[6]。

Xianhui Wang 團(tuán)隊[7]設(shè)計并合成了一種以BODIPY為骨架，含有DMTC（HOCl受體基團(tuán)）的紅色熒光探針DM-BDP-OCl。探針本身不具有顏色，這是由于光照誘導(dǎo)富電子的母核向貧電子的4-DMTC芐基吡啶轉(zhuǎn)移電子導(dǎo)致的，探針在與HOCl反應(yīng)后母核不能向吡啶部分轉(zhuǎn)移電子進(jìn)而產(chǎn)生紅色熒光（圖1A）。與其他ROS相比，探針DM-BDP-OCl對HOCl具有良好的特異性和快速反應(yīng)能力。成像實驗表明，探針可直接監(jiān)測活HeLa和RAW 264.7細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性HOCl的波動。

圖1 “脫保護(hù)”型次氯酸探針

基于雙光子熒光探針和遠(yuǎn)紅-近紅外區(qū)域熒光探針的優(yōu)點(diǎn)，Guo-Jiang Mao團(tuán)隊[8]研制了一種具有遠(yuǎn)紅-近紅外開啟信號功能的線粒體靶向雙光子熒光探針Mito-TP-ClO。Mito-TP-ClO由三苯基膦陽離子作為線粒體靶向單位，二甲酰肼結(jié)構(gòu)作為ClO-的反應(yīng)單位組成（圖1B）。Mito-TP-ClO表現(xiàn)出高靈敏度、線性范圍廣和對ClO-的高選擇性，由于其良好的雙光子特性和紅外光發(fā)射范圍，Mito-TP-ClO展現(xiàn)出不錯的性能，包括自身熒光強(qiáng)度低、光敏感程度低和深層組織滲透能力。此外，該實驗成功應(yīng)用該探針檢測到細(xì)菌感染細(xì)胞時的內(nèi)源性ClO-和炎癥小鼠模型中的ClO-，證實Mito-TP-ClO是監(jiān)測線粒體ClO-和研究次氯酸鹽對線粒體影響的有效工具。Xiaojun He 團(tuán)隊[9]以香豆素為熒光團(tuán)單元，合成了一種用于ClO-檢測的比率比色熒光探針CMSH。實驗證明，探針對ClO-具有較高的選擇性和靈敏度（圖1C）。在體外實驗中，該探針表現(xiàn)出對ClO-的快速識別能力和靈敏性能，隨著ClO-的加入溶液的熒光由綠色迅速變?yōu)樗{(lán)色，整個過程都伴隨著強(qiáng)烈的熒光。此外，CMSH已經(jīng)成功地作為比率傳感器用于低細(xì)胞毒性和良好通透性的活細(xì)胞、細(xì)菌和斑馬魚成像。

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是由過量ROS破壞正常生理結(jié)構(gòu)和功能的協(xié)調(diào)而引起的肺彌漫性炎癥性損傷。HOCl的過度生成可能是ALI的重要原因，因此Na He團(tuán)隊[10]開發(fā)了一種合成簡單、產(chǎn)率高的熒光探針Bcy-HOCl，用于活細(xì)胞和體內(nèi)定量監(jiān)測和可視化HOCl。探針包含2個部分：一個二甲基硫代氨基甲酸酯基團(tuán)作為反應(yīng)單元和一個苯并吲哚菁熒光團(tuán)作為熒光調(diào)節(jié)劑（圖1D）。Bcy-HOCl具有較高的選擇性和靈敏度，表現(xiàn)出對HOCl的特異性熒光增強(qiáng)。采用Bcy-HOCl對ALI細(xì)胞模型和ALI小鼠模型中HOCl的變化進(jìn)行評估，闡明ALI與HOCl之間的關(guān)系，結(jié)果證明,HOCl水平隨著ALI的嚴(yán)重程度明顯增加。

Sourav Samanta 團(tuán)隊[11]研發(fā)了一種檢測阿爾茲海默癥（AD，Alzheimer's disease）產(chǎn)生的HOCl熒光探針CM2。非熒光硫酰胺探針CM2在HOCl存在下選擇性轉(zhuǎn)化為熒光酰胺探針CM1，具有較高的選擇性和靈敏度，且CM2在一定條件下可以與CM1互相轉(zhuǎn)化；OCl-將CM2的硫羰基中的硫原子氧化，隨后被水解除去，生成羰基（圖2A）。CM1作為熒光開啟狀態(tài)，用于HOCl的體外和體內(nèi)檢測和成像；CM2出色的細(xì)胞攝取和血腦屏障穿越能力，使HOCl在細(xì)胞環(huán)境、野生型和AD小鼠大腦中得到明確的鑒別檢測、成像和定量。

圖2 其他反應(yīng)次氯酸探針

Aishan Zheng 團(tuán)隊研發(fā)了一種檢測限低（90 nmol/L），選擇性強(qiáng)，并且能夠靶向定位線粒體的近紅外次氯酸熒光探針CVS[12]。該探針的設(shè)計主要基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)原理，以硫醚作為識別位點(diǎn)來檢測HOCl，與HOCl反應(yīng)后硫化物被氧化成亞砜，消除PET效應(yīng)，使得熒光顯著增強(qiáng)（圖2B）。實驗證明，探針CVS與次氯酸的反應(yīng)為瞬態(tài)反應(yīng)，能夠消除許多不確定的干擾，且反應(yīng)后熒光迅速增強(qiáng)18倍，熒光變化明顯。

研究表明睡眠不足會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但關(guān)于睡眠不足相關(guān)ROS的信息卻很少被檢測報道。Qineng Xia團(tuán)隊[13]針對相關(guān)ROS的捕獲，設(shè)計了一種新型雙光子熒光分子探針JX-1，用于檢測活細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)的HClO，實驗證明，JX-1探針實時響應(yīng)速度快，具有較高的靈敏度和針對HClO的選擇性（圖2C）。此外，探針JX-1具有低細(xì)胞毒性和針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向能力的優(yōu)點(diǎn)，用該探針標(biāo)記HeLa細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光，伴隨著外源HClO的添加，熒光出現(xiàn)出明顯的衰減。這些顯著的特性使該探針能夠用于監(jiān)測活細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)的外源性和內(nèi)源性HClO。

Shrabani Saha 團(tuán)隊[14]制備了一種新穎的熒光素加萘二酰亞胺探針FANDI，并通過獨(dú)特的化學(xué)劑量學(xué)方法對混合于其他ROS和生物相關(guān)離子中的次氯酸鹽或氯離子進(jìn)行了選擇性識別，該探針表現(xiàn)出了對次氯酸根離子良好的選擇性。由于探針FANDI在其框架中含有熒光素的一部分，它保留了該染料的優(yōu)點(diǎn)，同時，由于對結(jié)構(gòu)的改造，探針FANDI的熒光性質(zhì)發(fā)生了劇烈的變化，在較寬的pH范圍內(nèi)能夠成功激發(fā)ClO-的氧化性質(zhì)并產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2D）。該論文還評價了該探針的細(xì)胞通透性、檢測特異性和光穩(wěn)定性，證實其成為一種可靠的細(xì)胞內(nèi)ClO-離子識別和實時監(jiān)測手段的可行性。

2.2 過氧化氫熒光探針的研究進(jìn)展

過氧化氫（H2O2）是一種典型的活性氧，主要由存在于幾乎所有細(xì)胞中的活性三磷酸吡啶核苷酸（NADPH）氧化酶產(chǎn)生的必需氧代謝物，越來越多的證據(jù)支持其作為氧化應(yīng)激的重要標(biāo)記物和各種生理過程中細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使的作用[15]。在細(xì)胞器水平上，線粒體是產(chǎn)生H2O2的主要部位，在生理和病理條件下，線粒體H2O2在細(xì)胞的生存、生長、分化和維持中起著至關(guān)重要的作用。然而隨著時間的推移，由于氧化應(yīng)激、基因突變，細(xì)胞線粒體中異常產(chǎn)生或積累H2O2與許多人類疾病，如癌癥、糖尿病、肥胖、神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)密切相關(guān)[16]。因此，實時在線監(jiān)測活體內(nèi)H2O2水平的變化，對于深入了解生命體氧化還原平衡調(diào)控的機(jī)制，實現(xiàn)疾病的早期診斷與跟蹤治療具有重要意義。

Jun Liu 團(tuán)隊[17]提出了一個通用和可靠的雙猝滅概念設(shè)計低本底熒光探針，建立了一種新的檢測活癌細(xì)胞線粒體內(nèi)源性H2O2的熒光探針骨架（Mito-FR）并合成了兩種熒光探針Mito-FN、Mito-FB結(jié)構(gòu)。該探針骨架同時利用硼酸鹽驅(qū)動的內(nèi)酰胺形成和可消除的猝滅部分來降低背景熒光，最終實現(xiàn)50倍的熒光開啟響應(yīng)效率（圖3A）。探針骨架Mito-FR包含熒光素骨架、可替換的緩沖基團(tuán)R、雙淬滅基團(tuán)（內(nèi)酰胺和4-甲基苯硼酸頻哪醇酯）、線粒體的識別基團(tuán)（三苯基膦），能高效、準(zhǔn)確識別線粒體中產(chǎn)生的過氧化氫。

圖3 典型的過氧化氫探針

Jialing Han 團(tuán)隊[18]設(shè)計了一種結(jié)構(gòu)簡單的過氧化氫淬滅型熒光探針BNBD。以4-氯-7-硝基苯并呋唑為熒光團(tuán)的核心結(jié)構(gòu)，結(jié)合特定的芳基硼酸鹽作為H2O2反應(yīng)基團(tuán)，對H2O2進(jìn)行特異性檢測。芳基硼酸鹽能夠在弱堿性條件下與H2O2反應(yīng)生成甲醌，隨后整個基團(tuán)脫去，將核心結(jié)構(gòu)裸露后使其熒光消失（圖3B）。該實驗考慮到取代基的位置對化合物熒光性能的影響，實驗設(shè)計了三種鄰位、間位、對位取代的芳基硼酸衍生物。實驗證明，對位取代的芳基硼酸衍生物BNBD是本研究中合適的選擇性關(guān)閉熒光探針。體外實驗證明，BNBD是一種高靈敏度，低毒性，對H2O2有選擇性的高效探針，在細(xì)胞實驗中，被探針標(biāo)記的細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，加入外源性過氧化氫后，細(xì)胞熒光消失。

Wenxin Wang 團(tuán)隊[19]報道了一種基于喹啉-黃嘌呤染料的近紅外熒光探針QX-B用于H2O2的成像。探針QX-B在772 nm處有10倍的熒光增強(qiáng)，比一般半菁染料的發(fā)射波長（約700 nm）長。QX-B在各種分析物上對H2O2具有良好的選擇性（圖3C），由于QX-B細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，在HeLa細(xì)胞、HCT116細(xì)胞、4T1細(xì)胞和斑馬魚中，QX-B對外源性和內(nèi)源性H2O2進(jìn)行成像的效果較好。

Hao Han 團(tuán)隊[20]設(shè)計并合成了一種比色近紅外熒光探針HAA，一種具有乙?；碾s環(huán)芳香胺，用于選擇性檢測活細(xì)胞中的H2O2。該探針具有新穎、結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)射波長長、Stokes位移大、較高的特異性和靈敏度、較低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。該探針使用乙酰作為H2O2的識別基團(tuán)，由于乙?；囊耄结樂肿觾?nèi)產(chǎn)生了顯著的電子推拉現(xiàn)象，促進(jìn)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT），增強(qiáng)了系統(tǒng)熒光。H2O2的識別反應(yīng)會去除HAA的乙?；瑥亩鴮?dǎo)致ICT的終止，導(dǎo)致隨后的熒光猝滅（圖3D）。

2.3 過氧亞硝酸鹽熒光探針的研究進(jìn)展

過氧亞硝酸鹽（ONOO-）是體內(nèi)由一氧化氮自由基和超氧陰離子產(chǎn)生的一種重要的生理活化劑，是ROS的常見組成成分。在生物系統(tǒng)中，ONOO-具有較高的氧化和硝化能力，過量的ONOO-的產(chǎn)生會對重要的細(xì)胞成分，如蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA造成嚴(yán)重的損傷。細(xì)胞內(nèi)異常高水平的ONOO-極易誘導(dǎo)疾病，例如炎癥性疾病、心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退化性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、帕金森?。?、癌癥、糖尿病、近視、聽力障礙等疾病[21,22]，因此開發(fā)能夠在生物系統(tǒng)中特異性和敏感地跟蹤ONOO-的方法對于了解氧化應(yīng)激疾病的致病機(jī)制以及病理是至關(guān)重要的。

Maria Weber 團(tuán)隊[23]以香豆素開發(fā)了一系列比率熒光探針，探針CM、探針CE、探針CL，能夠選擇性、靈敏地檢測活性氧ONOO-。香豆素基探針具有良好的光穩(wěn)定性、大的Stokes位移和高的量子產(chǎn)率。三種比率探針均包含用于檢測ONOO-的4-甲基苯硼酸頻哪醇酯基團(tuán)和獨(dú)特的細(xì)胞器靶向組（圖4A），其在特定的細(xì)胞器中對ONOO-產(chǎn)生的精確定位能夠提供更準(zhǔn)確的疾病分析。將線粒體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的靶向組引入香豆素支架可以定向檢測ONOO-的產(chǎn)生，探針CM能夠定向檢測線粒體中產(chǎn)生的ONOO-，相對應(yīng)的探針CE、探針CL分別用于檢測溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生的ONOO-，3種比率探針對ONOO-具有較高的敏感性和選擇性。

圖4 經(jīng)典的過氧亞硝酸鹽熒光探針

Maria L.Odyniec 團(tuán)隊[24]同樣以香豆素為核心設(shè)計了2種新型探針-藥物偶聯(lián)物，探針CC-RNS和探針Cl-RNS。熒光反應(yīng)由ONOO-介導(dǎo)，反應(yīng)首先將4-甲基苯硼酸頻哪醇酯脫去，香豆素相應(yīng)的位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為苯酚，同時另一端釋放治療藥物（圖4B）。CC-RNS和Cl-RNS對過氧亞硝酸鹽的檢出限分別為0.29 μmol/L和37.2 μmol/L，擁有低檢測限的優(yōu)勢，2種探針對ONOO-具有良好的線性范圍和選擇性，能夠有效避免其他ROS的干擾。

Guanyang Wang 團(tuán)隊[25]設(shè)計并合成了一種基于三氰基呋喃的近紅外熒光探針ACDM-BE，該探針對ONOO-具有快速響應(yīng)能力、高選擇性和高靈敏度。ACDM-BE不僅能夠檢測活細(xì)胞中的ONOO-，還成功檢測到活體斑馬魚在炎癥狀態(tài)下ONOO-的表達(dá)（圖4C）。該團(tuán)隊在實驗有效消除生物系統(tǒng)的背景自熒光，確保了ONOO-在活體生物系統(tǒng)中的精確定量檢測。

Minghao Ren 團(tuán)隊[26]提出了一種苯并噻唑功能化吡咯寧染料BTP，作為一個紅色熒光染料平臺用于生物成像應(yīng)用。由于苯并噻唑基具有吸電子性質(zhì)，與傳統(tǒng)羅丹明相比，BTP在吸收和發(fā)射波長上表現(xiàn)出較大的紅移（圖4D）。不僅如此，BTP在各種溶劑中幾乎沒有熒光，但在高黏度甘油中熒光強(qiáng)烈，可以作為分子轉(zhuǎn)子來反映黏度的變化，而且還能特異性靶向溶酶體，并在溶酶體黏性微環(huán)境的輔助下發(fā)出熒光?；贐TP平臺，Minghao Ren團(tuán)隊開發(fā)了其二氫衍生物探針HBTP，并測試了其對ROS的傳感性能。結(jié)果表明，HBTP是一種對內(nèi)源ONOO-具有高選擇性的熒光探針，熒光響應(yīng)速度快，靈敏度高。

Xilei Xie 團(tuán)隊[27]開發(fā)了一種單分子雙光子熒光探針BTNPO（圖4E），該探針對ONOO-在單光子以及雙光子體系中均有較好的響應(yīng)能力，并順利對阿爾茲海默癥進(jìn)行了分析。該探針可以實現(xiàn)對AD過程中的αβ斑塊和ONOO-的雙通道響應(yīng)，利用BTNPO可以通過活細(xì)胞和腦組織中兩個獨(dú)立的熒光通道同時鑒別這兩種AD病理因子，而不需要多次實驗進(jìn)行分析，減少了額外的實驗誤差。利用BTNPO，該團(tuán)隊通過雙光子成像方式，在活細(xì)胞模型和動物模型中，同時觀察到αβ斑塊和ONOO-的分布和變化，以及它們在AD發(fā)病和進(jìn)展過程中的緊密貼壁和相關(guān)性，為AD的發(fā)病機(jī)理研究以及治療提供了強(qiáng)有力的分析工具。

2.4 其他ROS熒光探針的研究進(jìn)展

羥自由基（·OH）作為活性氧（ROS）的一種，與多種疾病密切相關(guān)。Liqin Chen團(tuán)隊[28]研究開發(fā)了一種基于羅丹明結(jié)構(gòu)的·OH近紅外熒光探針RH-EDA（圖5A）。RH-EDA探針對·OH具有較高的選擇性和靈敏度，不受其他ROS的干擾，RHEDA可用于內(nèi)源性·OH在活細(xì)胞和斑馬魚不同條件下的成像。值得注意的是，RH-EDA可以根據(jù)藥物刺激下正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的不同·OH水平，來區(qū)分高熒光對比度的癌細(xì)胞，因此該探針可用于體內(nèi)監(jiān)測·OH，提高對·OH相關(guān)生物學(xué)過程的認(rèn)識。

圖5 經(jīng)典的羥自由基熒光探針

Xingyu Qu 團(tuán)隊[29]開發(fā)了2種探針ox-a、ox-b（圖5B），以三苯基膦作為取代基的近紅外BODIPY探針，位于BODIPY核心的3,5位。探針ox-a與ox-b均具有較高的選擇性和靈敏度，表現(xiàn)出對·OH的特異性熒光增強(qiáng)，且這2種探針具有優(yōu)異的光學(xué)性能，可作為熒光開啟化學(xué)傳感器用于·OH的檢測，使·OH觸發(fā)三苯基膦氧化反應(yīng)，這2種探針自身的熒光強(qiáng)度可以忽略不計，但在受到·OH的觸發(fā)后，探針ox-a、探針ox-b均發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，它們的傳感特性已被用于研究活細(xì)胞圖像。

Chenchen Li 團(tuán)隊[30]研究了一種用于內(nèi)源性NO的雙光子熒光探針Lyso-TP-NO，該探針以4-乙基氨基-1,8-萘酰亞胺為雙光子熒光團(tuán)，N-甲基苯胺為反應(yīng)位點(diǎn)合成。實驗證明，Lyso-TP-NO探針本身顯示的單光子和雙光子熒光強(qiáng)度幾乎可以忽略不計。利用芳香仲胺在好氧條件下容易與NO發(fā)生N-亞硝化反應(yīng)的特點(diǎn)，將Lyso-TP-NO轉(zhuǎn)化為Lyso-F-NOP，Lyso-F-NOP在單光子以及雙光子的激發(fā)下均產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光（圖6A）。除此之外，Lyso-TP-NO針對其他ROS/RNS具有一定的選擇性和靈敏度。

圖6 其他活性氧物種熒光探針

Chen Ling 團(tuán)隊[31]報道了一種基于雙氰亞甲基-4H-吡喃（DCM）的新型熒光探針DCM-O3，以丁烯基團(tuán)作為監(jiān)測臭氧的識別部分。DCM-O3本身不具有熒光，與臭氧反應(yīng)后發(fā)出紅色熒光（圖6B），實驗證明，該探針對臭氧具有較高的選擇性，在最佳條件下，其對臭氧的響應(yīng)時間可在短內(nèi)迅速完成。DCM-O3針對熒光強(qiáng)度與臭氧濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可以通過熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱來對臭氧濃度進(jìn)行定量分析，此外探針DCM-O3細(xì)胞毒性低，并成功地應(yīng)用于檢測在活細(xì)胞中的臭氧。考慮到所有這些優(yōu)點(diǎn)，該探針可以作為研究人員在復(fù)雜生物環(huán)境中研究臭氧相關(guān)疾病的有力工具。

·O2-在維持細(xì)胞氧化還原平衡中起著重要作用，而·O2-濃度失衡可導(dǎo)致多種疾病，如神經(jīng)退行性疾病、關(guān)節(jié)炎、動脈硬化、腫瘤等，因此，超氧陰離子是機(jī)體生理和病理過程中產(chǎn)生的活性氧物種的重要生物標(biāo)志物[32]。然而，由于·O2-的半衰期短和細(xì)胞組織的高自發(fā)熒光，對內(nèi)源性·O2-的原位實時跟蹤和監(jiān)測相對于其他的ROS而言是比較困難的。

Yaru Lu 團(tuán)隊[33]提出使用探針ER-Rs在活細(xì)胞、組織和斑馬魚內(nèi)檢測內(nèi)源·O2-。ER-Rs為開環(huán)形態(tài)，本身在PBS中不具有熒光，對·O2-具有高靈敏度和選擇性的響應(yīng)。該探針以熒光素為主體，以對甲苯磺?；鳛閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位熒光基團(tuán)，以三氟甲基磺酰基作為·O2-的響應(yīng)基團(tuán)。探針ER-Rs在響應(yīng)·O2-后，脫去三氟甲基磺?；?，生成具有綠色熒光的產(chǎn)物（圖6C）。生物成像實驗表明，探針ERRs可作為特異性雙光子探針，對活細(xì)胞、組織和斑馬魚體內(nèi)內(nèi)源性產(chǎn)生的·O2-進(jìn)行成像。

Shan Jiao 團(tuán)隊[34]設(shè)計合成了一種檢測細(xì)胞內(nèi)源性·O2-的雙光子熒光探針I(yè)FP-O2。探針能與·O2-迅速發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生熒光效應(yīng)。探針本身不具有熒光，在檢測到·O2-后，迅速發(fā)出強(qiáng)烈熒光（圖6D）。細(xì)胞實驗也表明該探針具有低毒性和線粒體的靶向能力。實驗證明，IFP-O2具有檢測內(nèi)源性·O2-的能力。此外，這篇文章首次提出了一種可用于測量口腔癌Cal-27細(xì)胞內(nèi)源性·O2-的探針，并為監(jiān)測和評估細(xì)胞凋亡提供了一種有前景的工具。

3 結(jié)論與展望

用于監(jiān)測細(xì)胞微環(huán)境中活性氧物種的有機(jī)熒光探針的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，毫無疑問，ROS熒光探針的開發(fā)有助于探索并明確ROS在生物體內(nèi)發(fā)揮的重要作用。為了設(shè)計理想的、高效的熒光探針來成像ROS，除了探針本身所具有的敏感性、高效性、低毒性等，還需要考慮以下因素：首先，ROS壽命短、活性高，探針應(yīng)能夠?qū)崟r監(jiān)測ROS；其次，應(yīng)發(fā)展具有更深入的組織穿透、更少的光損傷和更低自熒光的近紅外或雙光子熒光探針以滿足生物需求；最后，探索新熒光傳感機(jī)理是開發(fā)高性能熒光探針的關(guān)鍵。

綜上，現(xiàn)有的ROS熒光探針已發(fā)展到較高水平，能夠為研究ROS與疾病之間的相互作用提供有效的工具，但仍需繼續(xù)深入地探索研究靈敏度更高、組織特異性更好和生物兼容性更好的新一代ROS熒光探針，為ROS相關(guān)研究提供更多、更有效的技術(shù)手段。