淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵提取物對采后柑橘綠霉病菌的抑制作用

林書華，汪林蘭，羅 攀，張 斌，吳曉玉

（江西農業(yè)大學生物科學與工程學院 江西農業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室江西省果蔬采后處理關鍵技術及質量安全協(xié)同創(chuàng)新中心 南昌 330045）

柑橘果肉組織柔嫩多汁且富含糖分，在貯藏和運輸過程中果皮易受損而被病原菌侵染，引發(fā)采后柑橘病害。其中，柑橘綠霉病是引起柑橘果實腐敗的主要病害之一，其致病菌為指狀青霉（Penicillium digitatum）。目前，我國預防柑橘采后病害主要采用化學殺菌劑，如：鄰苯基苯酚鈉、噻苯咪唑、嘧霉胺等[1]。化學殺菌劑具有高效、廣譜和使用方便等優(yōu)勢，然而，其安全性問題備受社會關注[2]。因微生物殺菌劑具有高效、低毒、無殘留等特點，故眾多學者正積極尋找能替代化學殺菌劑的采后柑橘生物防腐劑。

Liu 等[3]發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌（Streptomyces albμLus）發(fā)酵產物ε-聚賴氨酸（ε-PL）對指狀青霉具有顯著抑制效果，經質量濃度為200 mg/L 的ε-PL 處理后，對指狀青霉細胞膜有損傷作用，破壞膜結構并誘導脂質過氧化，從而降低綠霉病的發(fā)病率。Liu 等[4]從檸檬克勒克酵母（Kloeckera apiculata）34-9 中分離的2-苯基乙醇 （PEA），通過競爭苯丙氨酸-tRNA 合成酶的活性位點來控制柑橘青霉病發(fā)生。Ouyang 等[5]用質量濃度為1.78 mg/mL 的植物精油——檸檬醛處理，導致指狀青霉細胞膜的一系列變化，包括麥角固醇含量減少以及大量羊毛甾醇積累，抑制麥焦固醇合成基因ERG7，ERG11，ERG6，ERG3，ERG5 的表達。Xin等[6]從直立白薇（Cynanchum atratum Bunge）中分離出生物堿安托芬。安托芬通過破壞指狀青霉細胞完整性，干擾能量代謝系統(tǒng)來抑制柑橘綠霉病菌。

本課題組從柑橘根系土壤中分離篩選到1 株柑橘綠霉病的拮抗菌，經鑒定，命名為淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）X33。前期研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵液提取物對柑橘意大利青霉、白地霉、指狀青霉等病原菌等均有良好殺菌效果，且無毒、極性強，易溶于水[7]。在隨后的結構解析中發(fā)現(xiàn)提取物的活性成分為低聚賴氨酸類化合物[8]。本研究以指狀青霉為研究對象，分析菌株X33 發(fā)酵提取物（Extract of fermentation broth from Streptomyces lavendulae X33，SLFE）對指狀青霉的抑制作用，為SLFE 作為柑橘采后防腐劑的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 提取發(fā)酵液的菌株X33：淡紫灰鏈霉菌X33（Streptomyces lavendulae X33）。

采后柑橘綠霉病菌Pd165：指狀青霉Pd165（Penicillium digitatum Pd165）。

以上菌株均由江西省農業(yè)微生物資源開發(fā)利用工程實驗室分離、提供。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基 主要試劑：氯金酸、檸檬酸三鈉、乙醇、濃硫酸、乙酸鉛等試劑均為分析純級，BCA 含量測試盒、丙酮酸試劑盒，南京建成生物工程研究所；基因組DNA 提取試劑盒，康為世紀公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉20，牛肉膏3，魚粉蛋白胨10，NH4Cl 0.6，NaCl 10，CaCO30.02，初始pH 7.0。

PDA 培養(yǎng)基（g/L）：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH。

PDB 培養(yǎng)基：不含瓊脂的PDA 培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器及設備 Quanta 250 掃描電子顯微鏡，美國賽默飛世爾科技公司；SCIENTists-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；NanoDrop one 超微量分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司；Eclipse Ti-S 倒置熒光顯微鏡，日本尼康儀器有限公司；DXR 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，美國Thermo Scientificic 公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SLFE 的提取與配制 基于課題組前期的提取方法，略有改進[9]。將菌株X33 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)96 h，離心、收集上清液；利用D101 大孔樹脂柱洗脫上清液，經薄層檢測和抑菌活性追蹤后，收集抑菌活性物質粗提液；粗提液再經C18 柱層析，純水洗脫，將有抑菌活性的精提液冷凍干燥，獲得粉末狀物質為淡紫灰鏈霉菌X33 發(fā)酵液提取物 （SLFE），SLFE 稱量后溶于無菌水，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 病菌Pd165 孢子懸液制備 用生理鹽水將28 ℃培養(yǎng)5 d 的病菌Pd165 孢子洗入三角瓶，8 層無菌紗布過濾，除去菌絲，血球計數板計數，調整孢子懸液濃度為107個/mL。

1.2.3 SLFE 處理對病菌Pd165 生長的檢測

1） 對病菌Pd165 菌絲干重的影響 將1 mL菌株Pd165 孢子懸液接入50 mL PDB 培養(yǎng)液，28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數生長期（48 h），加入不同濃度的SLFE，以加等量無菌水為對照，繼續(xù)培養(yǎng)96 h，過濾，收集菌絲體，干燥至恒重后稱重。

2） 對病菌Pd165 產孢量的影響 參考曾志紅等[10]的方法。取200 μL 菌株Pd165 孢子懸液，分別均勻涂布于含質量濃度1.2，2.4，4.8 mg/mL的SLFE 的PDA 平板上，對照組涂布等量無菌水。置于28 ℃，培養(yǎng)5 d 后，0.85%生理鹽水將斜面孢子洗入三角瓶，8 層紗布過濾，制成孢子懸液，用血球計數板分別計算對照組（A1）、處理組（A2）的孢子數量，單位：個/mL。

1.2.4 SLFE 處理對菌株Pd165 菌絲體形態(tài)的觀察 參考Ju 等[11]方法并略作修改。取200 μL 菌株Pd165 孢子懸液均勻涂布在SLFE 質量濃度為4.8 mg/mL 的PDA 平板上，對照組加入等量無菌水，取滅菌蓋玻片45°傾斜插入平板，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲爬片長滿蓋玻片時取出。將蓋玻片置于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃避光固定12 h；磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH 7）漂洗3 次，每次10 min；進行梯度脫水，乙醇體積分數分別為30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%，每個體積分數處理6 min。

最后將處理好的蓋玻片置于冷凍干燥機中干燥，噴金后掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.5 SLFE 處理對菌株Pd165 菌絲細胞完整性的觀察 采用FDA-PI 雙色熒光法檢測指狀青霉細胞完整性[12]。在PDA 培養(yǎng)基中加入4.8 mg/mL的SLFE、插片培養(yǎng)指狀青霉（方法同1.2.4 節(jié)）。選取已長滿病原菌的蓋玻片，加入二乙酸熒光素（FDA）2.5 μmol/L，避光反應10 min，再加入10 μL 0.5 μmol/L 碘化丙啶（PI），避光反應10 min。將其置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 表面增強拉曼光譜（SERS）在抑菌過程中的應用

1.2.6.1 SERS 基底的制備 在250 mL 的燒杯中加入0.01%氯金酸溶液100 mL，超聲混勻，將其置于預熱好的電爐上加熱至沸騰。迅速加入0.7 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，待其顏色變成紅棕色后，繼續(xù)加熱8 min，冷卻至室溫，避光保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.6.2 SERS 對細胞外漏物質的檢測 采用1.2.3 節(jié)的方法培養(yǎng)菌絲體，通過真空抽濾收集約1 g 2日齡的菌絲體，并重懸于20 mL 0.85%的生理鹽水中，4 ℃冷藏使菌絲饑餓24 h。分別加入質量濃度1.2，2.4，4.8 mg/mL 的SLFE，對照組（CK）加入等量無菌水。SLFE 與CK 分別處理120 min 后，取1 mL 懸浮液轉移至EP 管中，并在12 000 r/min 冷凍離心5 min，收集上清液。將100 μL 上清液滴入含有400 μL 的膠體Au 納米顆粒中，并充分混合，置于共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測[14]。

1.2.7 SLFE 處理對菌株Pd165 菌絲內容物的測定 采用1.2.3 節(jié)的方法，分別取對照組和處理組的菌絲各0.5 g，置于含pH 7.0 PBS 2 mL 的研缽中，加入適量石英砂，冰浴研磨成勻漿，4 ℃，10 000 r/min 冷凍離心20 min，取上清液，用于測定可溶性蛋白、還原糖和丙酮酸的含量。

分別采用蒽酮比色法[15]，二辛可寧酸法（Bicinchoninic acid method，BCA）法[16]和硫代巴比妥酸法[17]測定上述上清液中還原糖、可溶性蛋白和丙酮酸的含量。

1.2.8 SLFE 處理對與菌株Pd165 遺傳物質的影響

1.2.8.1 熒光光譜法檢測SLFE 對指狀青霉DNA含量的影響 采用康為世紀基因組DNA 提取試劑盒提取病菌Pd165 DNA。采用超微量分光光度計檢測提取DNA 的純度和濃度。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）將真菌基因組DNA 稀釋至60 μg/mL。將不同質量濃度的SLFE（0，1.2，2.4，4.8 mg/mL）加入到相同體積（60 μg/mL）的DNA 溶液中，黑暗處理1 h。采用熒光酶標儀在激發(fā)波長280 nm 下，測量混合物從360～500 nm 波長下的熒光光譜[18]。

1.2.8.2 SLFE 對細胞應答相關基因表達的影響根據有關絲狀真菌細胞應答基因的報道[19-21]，本研究選擇并設計4 對熒光定量PCR 引物（表1）。提取處理組 （1.2 mg/mL） 和對照組菌絲體總RNA，經完整性檢測合格后，反轉錄成cDNA，并進行熒光定量PCR 試驗。20 μL 反應體系：2×T5 Fast qPCR 預混液10 μL、PCR 正向引物0.8 μL、PCR反向引物0.8 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7.4 μL。擴增條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，40 個循環(huán)；采用2-ΔΔCt法以actin 作為內參來量化每個樣本的值。

表1 熒光定量PCR 基因擴增的引物序列Table 1 Primer sequences for gene amplification by fluorescence quantitative PCR

1.3 數據處理

所有試驗設置3 組重復，數據以“平均值±標準差”表示。采用Origin 9.0 作圖，DPS 7.05 進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 SLFE 對菌株Pd165 菌絲干重與產孢量的影響

指狀青霉菌絲的生長受到SLFE 顯著抑制（圖1）。不同質量濃度SLFE 處理組的菌絲干重均顯著低于對照組 （菌絲干重3.82 mg/mL）；隨著SLEF 質量濃度增大，對指狀青霉抑制作用增強；當SLFE 的質量濃度達到4.8 mg/mL 時，菌絲干重（2.13 mg/mL）較對照組（CK）降低1.69 mg/mL，降低了44.24%。

圖1 SLFE 對指狀青霉菌絲生長的影響Fig.1 Effect of SLFE on mycelial growth of P.digitatum

SLFE 處理菌株Pd165 后，其產孢量明顯降低（表2）。與對照組（CK）相比，質量濃度為1.2，2.4，4.8 mg/mL 的SLFE 處理組產孢量分別為2.09×108，1.27×108，9.4×107個/mL，產孢抑制率分別為94.9%，97.0%，97.8%；各處理組產孢量均顯著低于對照組（P＜0.05）；且SLFE 濃度越高，對指狀青霉產孢能力的抑制更強。

表2 SLFE 對指狀青霉產孢量的影響Table 2 Effect of SLFE on sporulation quantity of P.digitatum

上述結果表明：SLFE 對指狀青霉的菌絲生長及產孢能力具有較好的抑制效果。

2.2 SLFE 對菌株Pd165 菌絲和孢子形態(tài)的影響

從圖2可知，經SLFE 處理后的菌株Pd165形態(tài)發(fā)生明顯改變。對照組的分生孢子為球形，形態(tài)規(guī)則且飽滿（圖2a），而處理組的分生孢子變形為不規(guī)則的橢圓，且孢子表面出現(xiàn)凹陷、皺縮（圖2b）；對照組的菌絲形態(tài)飽滿、生長旺盛（圖2c），而處理組菌絲細、干癟，并發(fā)生折疊（圖2d）。

圖2 SLFE 對指狀青霉分生孢子和菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effect of SLFE on morphology of the conidia and hyphae of P.digitatum

2.3 SLFE 對菌株Pd165 菌絲細胞完整性的影響

為探明SLFE 對指狀青霉菌絲體細胞活性狀態(tài)的影響，使用FDA-PI 雙染色法對菌株Pd165菌絲體染色。當細胞膜完整時，PI 無法進入細胞著色，F(xiàn)DA 在胞內酯酶作用下形成熒光素，使完整細胞發(fā)出綠色熒光；當細胞膜受損時，F(xiàn)DA 形成的熒光素無法在細胞內積聚，無法發(fā)出綠色熒光，而PI可進入細胞，與胞內核酸物質作用生成紅色熒光物，因而受損細胞呈紅色熒光。將染色后的菌絲體置于熒光顯微鏡下觀察。對照組菌絲體經染色后細胞顯現(xiàn)綠色熒光（圖3a），僅有微弱的紅色熒光（圖3c），而SLFE 處理組菌絲細胞大部分呈紅色熒光（圖3d），少數為綠色熒光（圖3b）。結果表明：菌株Pd165 菌絲體經SLFE 處理后，細胞膜的完整性受到破壞。

圖3 熒光顯微鏡觀察指狀青霉菌絲細胞膜的完整性Fig.3 Observation of the integrity of pathogenic P.digitatum membrane by laser confocal microscope

2.4 SLFE 對病菌Pd165 菌絲細胞物質外漏的影響

利用拉曼光譜進一步研究了SLFE 對病菌Pd165 菌絲細胞物質外泄的影響。與對照組相比，SLFE 處理后的菌株Pd165 胞外液在400～1 800 cm-1范圍內呈現(xiàn)出顯著的特征峰變化（圖4）。其中，最明顯的特征峰1 330 cm-1（核酸特征峰）[22]、1 129 cm-1（脂肪酸特征峰）[23]、1 570 cm-1（蛋白質酰胺II 特征峰）[24]在經不同濃度的SLFE 處理后，較對照組的峰值明顯增強，且隨SLFE 質量濃度增加，特征峰峰值增大。表明與對照組相比，SLFE 處理后胞外液中脂肪酸、蛋白質及核酸等大分子物質含量增加，推測可能是由于菌絲細胞膜受損，引發(fā)胞內大分子物質外泄。

圖4 不同質量濃度SLFE 處理指狀青霉的SERSFig.4 SERS spectra of P.digitatum treated with different concentrations of SLFE

2.5 SLFE 對菌株Pd165 菌絲內容物的影響

2.5.1 對病菌Pd165 菌絲還原糖含量的影響 病菌Pd165 經質量濃度1.2，2.4，4.8 mg/mL 的SLFE處理后，病菌菌絲體內還原糖含量分別為0.53%，0.39%，0.10%，均顯著低于對照組（0.87%，圖5a）；且SLFE 質量濃度越高，菌絲還原糖含量越低；當SLFE 質量濃度為4.8 mg/mL 時，處理組菌絲總糖較對照組下降了81.13%。

2.5.2 對病菌Pd165 可溶性蛋白含量的影響 病菌Pd165 經不同濃度SLFE 處理后，各濃度處理組（1.2，2.4，4.8 mg/mL SLFE）菌絲可溶性蛋白含量分別為0.09，0.07，0.04 mg/g（圖5b），較對照組（0.12 mg/g） 含量分別降低25.00%，41.67%，66.67%。SLFE 處理后菌株Pd165 菌絲體內可溶性蛋白含量顯著減少，SLFE 質量濃度越高，可溶性蛋白含量下降越顯著。

2.5.3 對病菌Pd165 菌絲丙酮酸含量的影響 病菌Pd165 菌絲體內丙酮酸含量隨著SLFE 處理濃度的升高呈下降趨勢（圖5c）。對照組菌絲體丙酮酸含量為2.74 mg/g，而經4.8 mg/mL 的SLFE 處理后，菌絲體內丙酮酸含量為1.61 mg/g，含量降低率達到41.41%。

圖5 SLFE 對指狀青霉菌絲內容物的影響Fig.5 Effect of SLFE on mycelial ingredients of P.digitatum

2.6 SLFE 對菌株Pd165 遺傳物質的影響

2.6.1 對病菌Pd165 基因組DNA 的影響 采用熒光光譜技術分析SLFE 與DNA 的體外結合情況[25]。與對照組相比，隨著SLFE 質量濃度的增加，各處理組中均表現(xiàn)出明顯的熒光猝滅 （圖6），表明SLFE 可與DNA 結合，導致DNA 的結構和構象發(fā)生變化。

圖6 SLFE 對指狀青霉基因組DNA 的影響Fig.6 Effect of SLFE treatment on genetic DNA of P.digitatum

2.6.2 對細胞應答相關基因表達的影響 選取與細胞壁生物合成、能量代謝、氧化應激與產孢等有關的4 個基因：cej60377.1 （編碼幾丁質酶——CHI）、oko99898.1 （編碼?；o酶A 脫氫酶——ACAD）、crl18986.1（編碼過氧化物酶——POD）和kzn90160.1（編碼BRLA），熒光定量PCR測定其基因表達量，結果見表3。經1.2 mg/mL SLFE 處理后，4 個基因的表達水平均顯著高于對照組。

表3 SLFE 對指狀青霉細胞應答相關基因表達的影響Table 3 Effects of SLFE on the expression of response-related genes in P.digitatum

3 討論

與化學殺菌劑相比，SLFE 具有易溶于水、無毒、廣譜、抗菌性強等優(yōu)勢。正常條件下，菌株Pd165 在PDB、PDA 培養(yǎng)基中可快速生長、產孢，而經SLFE 處理后，菌株Pd165 菌絲生長量和產孢量明顯減少，且菌絲體和孢子形態(tài)被嚴重破壞，菌絲細而干癟，并發(fā)生折疊，分生孢子變形為不規(guī)則的橢圓，且孢子表面出現(xiàn)凹陷、皺縮。1.2 mg/mL的SLFE 對病菌Pd165 產孢抑制率高達94.86%，且SLFE 的抑菌效果呈現(xiàn)劑量-效應關系。

為深入探討SLFE 對菌株Pd165 的抑制機制，本研究使用FDA-PI 雙染色法對病菌Pd165菌絲體染色，SLFE 處理組菌絲細胞大部分呈紅色熒光，少數為綠色熒光，說明經SLFE 處理后的病菌Pd165 菌絲體細胞膜的完整性受到破壞。運用拉曼光譜檢測SLFE 處理后的病菌Pd165 胞外液，其中代表脂肪酸、核酸和蛋白質的吸收峰：1 129，1 330，1 565 cm-1同時增強。由此更進一步證實由于細胞膜完整性被破壞，造成病菌Pd165胞內脂肪酸、核酸和蛋白質的外泄。這與黃飛[26]研究發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛處理對意大利青霉菌絲體細胞膜結構具有損傷作用的研究結果相似。

通過檢測菌株Pd165 菌絲體胞內的還原糖、可溶性蛋白、丙酮酸含量在添加不同質量濃度SLFE 后的變化，發(fā)現(xiàn)三者含量均顯著降低，4.8 mg/mL 的SLFE 處理后，三者分別下降81.13%，66.67%和41.41%。還原糖和可溶性蛋白是細胞內重要組成成分，丙酮酸是參與生物體基礎代謝的中間產物之一，在糖、脂肪、氨基酸的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用，這3 種胞內物質含量的下降表明菌絲體合成代謝出現(xiàn)紊亂，無法維持正常的生長與生理功能。Chen 等[27]研究發(fā)現(xiàn)經7-脫甲氧基酪氨酸處理后的意大利青霉菌體胞內還原糖、可溶性蛋白含量顯著降低，這與本研究結果一致。

Parveen 等[28]研究表明酵母細胞通過誘導CHI的過量表達，進而激活了細胞壁的代償機制以克服α-萜品烯的毒性；Guo 等[29]研究表明2-甲氧基-1，4-萘醌上調了與能量產生相關的蛋白——ACAD，從而擾亂病菌Pd165 的代謝過程，以發(fā)揮抑菌作用；Fan 等[30]研究表明，NO 通過誘導抗氧化酶（SOD 和POD）基因的過表達，以保護狗牙根免受冷脅迫；王明爽[31]報道BrlA 的過量表達會導致病菌Pd165 菌絲停止生長和菌絲尖端直接形成分生孢子。本研究的熒光定量PCR 試驗發(fā)現(xiàn)，SLFE處理病菌Pd165 后，菌株顯著上調了上述4 種酶的基因表達量，推測病菌Pd165 受到SLFE 脅迫后，激活細胞壁代償機制，導致細胞壁結構受損；?；o酶A 脫氫酶是參與催化脂肪酸與氨基酸分解代謝中的脫氫酶，其基因表達量上調加速了脂肪酸和氨基酸分解代謝，引起細胞合成代謝紊亂。過氧化物酶（POD）作為細胞內重要的內源活性氧清除劑，其基因的過表達可能是SLFE 處理激活了病菌Pd165 細胞內防御酶系，以增強細胞清除活性氧能力，防止細胞損傷；BrlA 是調節(jié)分生孢子形成的重要元件，其基因的過量表達可能是造成菌絲生長慢和分生孢子少的原因之一。此外，DNA結合試驗發(fā)現(xiàn)SLFE 可與指狀青霉DNA 結合導致破壞其結構與構象。

綜上，SLFE 對柑橘病原菌菌株Pd165 的抑菌作用主要是引發(fā)細胞完整性受損，擾亂細胞內原有的穩(wěn)態(tài)，使核酸、糖類、可溶性蛋白等內容物滲出；SLFE 可與DNA 結合，抑制DNA 功能的表達；同時誘導與細胞壁生物合成、能量代謝、氧化應激與產孢等有關的基因的過表達，最終達到殺菌作用。一些活性抗菌成分也有相似的抑菌機制，如α-水芹烯和壬醛對圓弧青霉的抑菌機制是攻擊細胞膜和破壞菌絲結構[32]。石竹烯對熱殺索絲菌的抑菌機理是攻擊病菌細胞壁和細胞膜，使胞內物質外泄，影響細胞正常生長代謝；且與基因組DNA 結合，破壞其結構與構象，抑制病菌生長[33]。

4 結論

本研究將SLFE 作用于病菌Pd165，結果表明不同質量濃度的SLFE 對菌株Pd165 均有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量效應。SLFE 通過影響菌株Pd165 細胞結構的完整性，致使核酸、糖類、可溶性蛋白等細胞內容物外滲，誘導參與細胞應答反應的部分基因過量表達，從而達到抑菌、殺菌效果。SLFE 能抑制病菌Pd165 的生長，可用于柑橘采后綠霉病的防治，有望開發(fā)為環(huán)境友好型的新型生物防腐劑。