酸奶弱后酸化菌株搖瓶增菌工藝及發(fā)酵罐擴(kuò)培試驗

趙麗娜，鞏俊明，張 娜，李 晨，5，田洪濤，2，5*，王妙姝，康紅艷，羅云波

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071001 2 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定 071001 3 保定學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院 河北保定 071001 4 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定 071001 5 河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心 河北保定 071001 6 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

近年來，隨著乳酸菌與健康關(guān)系研究的深入，發(fā)酵食品越來越多的健康功能被揭示，發(fā)酵乳制品行業(yè)快速崛起，成為全球發(fā)展最快的高附加值行業(yè)之一[1-3]。隨之，發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)技術(shù)受到極大關(guān)注，而發(fā)酵劑制備是其核心技術(shù)之一。傳統(tǒng)人工型液態(tài)發(fā)酵劑存在弊端，20世紀(jì)初，國外開始研究高效直投式發(fā)酵劑，至20世紀(jì)60年代后逐漸商品化。而我國在高效直投式發(fā)酵劑方面研究起步較晚，長期被國外企業(yè)壟斷，主要依賴進(jìn)口，價格異常昂貴[4-5]。高效直投式發(fā)酵劑在酸奶中應(yīng)用時普遍存在后酸化的問題，原因是保加利亞乳桿菌是主要的產(chǎn)酸菌株，在長期高溫發(fā)酵、低溫貯存的過程中，菌株繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵乳制品貯藏期質(zhì)量不穩(wěn)定，保質(zhì)期縮短[6]。目前，國外研究出一些弱后酸化效果顯著的菌株，然而均受專利保護(hù)。目前，我國主要在工藝水平上控制酸奶后酸化，不能從根本上解決問題。研制開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的弱后酸化高效直投式發(fā)酵劑，是解決酸奶后酸化問題的關(guān)鍵。

制備弱后酸化高效直投式發(fā)酵劑的關(guān)鍵技術(shù)主要包括：弱后酸化乳酸菌株的選育、廉價增菌培養(yǎng)基的篩選、細(xì)胞增菌培養(yǎng)；菌體細(xì)胞濃縮分離；高效保護(hù)劑篩選與干燥工藝；高效直投式發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性等。本實驗室研究人員前期對弱后酸化乳酸菌株進(jìn)行選育，并對選育的菌株進(jìn)行廉價增菌培養(yǎng)基的篩選。關(guān)于乳酸菌細(xì)胞增菌培養(yǎng)技術(shù)，考慮到乳酸菌生長繁殖速度較快，采用分批式培養(yǎng)，對培養(yǎng)設(shè)備要求簡單，易于控制。為獲得高濃度細(xì)胞培養(yǎng)物，采用分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，主要有化學(xué)中和法、緩沖鹽法、膜滲析法。化學(xué)中和法可獲得高密度菌體，簡便易行，是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法，然而，當(dāng)乳酸與堿液反應(yīng)產(chǎn)生乳酸氨或乳酸鈉等鹽類物質(zhì)達(dá)到一定濃度時，也會抑制菌體生長繁殖[7-8]。緩沖鹽的緩沖作用有一定范圍，發(fā)酵菌液不能達(dá)到很高的菌體濃度，高鹽濃度會對乳酸菌菌體生長產(chǎn)生抑制作用[7]。膜滲析法是目前最先進(jìn)的方法，培養(yǎng)效果最好，然而設(shè)備投資大，多次過濾耗能大，對超濾膜材料和操作要求較嚴(yán)格，同時在培養(yǎng)過程中易感染噬菌體，工業(yè)上應(yīng)用并不廣泛[4，7-9]。本實驗室新選育的弱后酸化菌株生長特性是否發(fā)生改變？ 該菌株究竟適宜采用何種培養(yǎng)方法？需要用產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率指標(biāo)來衡量，并通過試驗探明。

針對以上問題，選用選育并優(yōu)化組合的優(yōu)良弱后酸化乳酸菌菌株及廉價胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基，通過300 mL 三角瓶水平的搖瓶分批式培養(yǎng)，采用單因素和正交優(yōu)化試驗研究培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基起始pH 值、接種量對弱后酸化菌株生長的影響。通過50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗研究調(diào)節(jié)pH 值、流加葡萄糖補(bǔ)料以及既調(diào)節(jié)pH 值又流加葡萄糖補(bǔ)料對弱后酸化菌株生長的影響。通過優(yōu)化后酸化乳酸菌的增殖培養(yǎng)條件，為高效直投式發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種 弱后酸化保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）Lb-s1 rp-1：本試驗室（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院發(fā)酵工程試驗室）前期自行選育。

1.1.2 原料 胡蘿卜，購自本市大型超市，用于制作胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基。

1.1.3 培養(yǎng)基

1） MRS 培養(yǎng)基[10]液體用于菌種的活化，固體用于活菌計數(shù)；

2） 胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基 挑選新鮮、完好、大小適中的胡蘿卜→洗凈→切片（厚度2 mm）→煮沸 （料∶水＝1∶1，100 ℃，10 min）→打漿（10 min）→過慮（100 目濾布，2 遍）→磨漿（膠體磨，10 min）→添加促生長物質(zhì)（0.3%大豆蛋白胨、1.0%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%碳酸鈣）→調(diào)糖度 （2～3 Bix°）→調(diào)pH 值→滅菌（115 ℃，20 min）→冷卻至37 ℃?zhèn)溆茫糜趽u瓶分批式培養(yǎng)試驗和發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 YXQ-LS-18SI/22L 手提式濕熱滅菌鍋，上海東亞壓力容器公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JM-80F 型膠體磨，江蘇丹徒縣紀(jì)中電器五金廠；FOM-Z150-2 打漿機(jī)，鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)紀(jì)中電器廠；STARTER 2100 實驗室pH 計，奧豪斯（OHAUS）儀器（上海）有限公司；50 L 全自動發(fā)酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；阿貝折光儀，上海歡奧科技有限公司；78-1 磁力加熱攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗室搖瓶分批式培養(yǎng)試驗 首先通過單因素實驗研究培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基起始pH 值、接種量對實驗室搖瓶分批式培養(yǎng)菌種增菌的影響，然后對有交互作用的因素條件進(jìn)行正交優(yōu)化，最后在正交優(yōu)化試驗得到的最佳工藝條件下培養(yǎng)菌種進(jìn)行驗證試驗。

1） 培養(yǎng)溫度對菌種增菌的影響 弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基活化后，以體積分?jǐn)?shù)0.6%（約3×106CFU/mL）接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）、pH 值為6.5～7.0 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，分別置于32，37，42 ℃恒溫、靜置培養(yǎng)12 h，定時取樣檢測活菌數(shù)，繪制生長曲線。

2） 培養(yǎng)方式對菌種增菌的影響 菌株活化后，以體積分?jǐn)?shù)0.6%（約3×106CFU/mL）接種量分別接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）和滅菌的250 mL 厭氧瓶 （即輸液瓶，裝液量200 mL，裝液過程中通過Hungate 厭氧系統(tǒng)充氮除氧）、pH 值為6.5～7.0 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，于37 ℃分別進(jìn)行轉(zhuǎn)速80 r/min 搖床培養(yǎng)（三角瓶）、靜置培養(yǎng)（三角瓶）、厭氧培養(yǎng)（厭氧瓶）8 h，檢測活菌數(shù)。

3） 培養(yǎng)基起始pH 值對菌種增菌的影響 用2 mol/L Na2CO3溶液經(jīng)磁力攪拌器將胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基pH 值分別調(diào)至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 梯度系列，分裝300 mL 三角瓶（裝液量均為200 mL），115 ℃滅菌20 min 冷卻備用。菌株活化后，每株菌以體積分?jǐn)?shù)0.6%（約3×106CFU/mL）接種量分別接入不同pH 值的三角瓶胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)8 h，檢測活菌數(shù)。

4） 接種量對菌種增菌的影響 菌株活化后，分別以體積分?jǐn)?shù)0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）、pH 值為6.5 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，定時取樣檢測活菌數(shù)，繪制生長曲線。

5） 菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗 考慮增菌因素之間存在交互協(xié)同作用，在單因素實驗中選擇培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基起始pH 值、接種量為主要因素，利用L9（33）正交試驗優(yōu)化弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 菌株的搖瓶增菌工藝條件，因素水平見表1。

表1 Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗中各因素水平表Table 1 Factor level table of Lb-s1 rp-1 in orthogonal optimization experiment of shake flask enrichment process

6） 驗證試驗 根據(jù)菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗得到的最佳增菌工藝條件培養(yǎng)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1，對正交試驗結(jié)果進(jìn)行驗證。

1.2.2 50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗 根據(jù)實驗室搖瓶分批式培養(yǎng)試驗得到的最佳增菌工藝，利用胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進(jìn)行50 L （30 L 培養(yǎng)基）全自動發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)試驗，以分批式擴(kuò)大培養(yǎng)為對照，設(shè)置3 種補(bǔ)料方式：①用2 mol/L 的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基恒定pH 值為5.5；②在對數(shù)生長末期6 h 時補(bǔ)加1.5 mol/L 葡萄糖溶液使發(fā)酵罐中葡糖糖質(zhì)量濃度保持20 g/L；③既用2 mol/L 的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基恒定pH 值為5.5，又在對數(shù)生長末期6 h 時補(bǔ)加1.5 mol/L 葡萄糖溶液。定時取樣檢測活菌數(shù)，繪制生長曲線。

1.3 檢測方法

1.3.1 乳酸菌活菌計數(shù) 參照GB 4789.35-2016平板計數(shù)法[11]，每個試驗均重復(fù)3 次。

1.3.2 pH 值的測定 采用OHAUS Starter 2100 pH 計直接測定，每個試驗均重復(fù)3 次。

1.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗室搖瓶分批式培養(yǎng)試驗

2.1.1 培養(yǎng)溫度對菌種增菌的影響 溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一，通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝，不同微生物最適生長溫度隨著培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段變化而改變[9，12]。根據(jù)1.2.1（1）節(jié)的試驗方法，探究不同培養(yǎng)溫度對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 Lb-s1 rp-1 在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中不同溫度培養(yǎng)生長曲線Fig.1 Growth curve of Lb-s1 rp-1 in carrot juice complex enrichment medium at different temperatures

圖1可知，菌株在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，分別于32，37，42 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，到達(dá)對數(shù)生長末期或穩(wěn)定初期的培養(yǎng)時間分別為9，7，5 h，穩(wěn)定期活菌數(shù)分別為1.33×109，9.98×109，4.89×109CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)的活菌數(shù)顯著高于32 ℃和42 ℃培養(yǎng)（P<0.05）。原因是在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時，細(xì)胞內(nèi)的酶催化和化學(xué)反應(yīng)速率都會加快，菌體生長也會加快，同時營養(yǎng)物和代謝物的溶解度提高，細(xì)胞膜流動性增大，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排除。然而，當(dāng)超過一定溫度后繼續(xù)升溫，會使蛋白質(zhì)和核酸等受到不可逆的損害，從而抑制菌體生長代謝，甚至導(dǎo)致死亡[13]。確定培養(yǎng)溫度37 ℃作為下一步正交優(yōu)化試驗的主要因素與基準(zhǔn)水平。

2.1.2 培養(yǎng)方式對菌種增菌的影響 供氧情況影響培養(yǎng)基的氧化還原電位值，可使乳酸菌的代謝途徑發(fā)生改變，這對菌種的生長尤為重要[12]。因此，根據(jù)1.2.1（2）節(jié)的試驗方法，采用不同的培養(yǎng)方式研究對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1生長的影響，結(jié)果見圖2。

圖2可知，菌株在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃分別進(jìn)行搖床培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速為80 r/min）、靜置培養(yǎng)、厭氧培養(yǎng)8 h 后，活菌數(shù)分別為2.02×1010，1.93×1010，3.23×107CFU/mL，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的活菌數(shù)極顯著高于搖床培養(yǎng) （P＜0.01），而且靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，培養(yǎng)方式對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的生長影響很大，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)優(yōu)于搖床好氧培養(yǎng)。

圖2 Lb-s1 rp-1 在不同培養(yǎng)方式下穩(wěn)定期的活菌數(shù)Fig.2 Number of Lb-s1 rp-1 viable bacteria in the stationary phase of different culture methods

本研究結(jié)果與古元懿[8]、蔡毅等[14]研究結(jié)果相符，這主要是由于保加利亞乳桿菌基因組中缺少超氧化物歧化酶，導(dǎo)致其在有氧條件下的生長較差，只有在發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧含量較低的情況下，才能快速生長[15]。根據(jù)本試驗結(jié)果，為簡化工藝操作，節(jié)省能源，降低生產(chǎn)成本，減少設(shè)備投資，確定弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 采用靜置培養(yǎng)方式。

2.1.3 培養(yǎng)基起始pH 值對菌種增菌的影響 培養(yǎng)基起始pH 值也是影響菌株活菌數(shù)量的關(guān)鍵因素之一，合適的起始pH 值能縮短菌株生長的延滯期，較快的進(jìn)入對數(shù)生長期，不同菌株的最適生長pH 值范圍也不同[16]。因此，根據(jù)1.2.1（3）節(jié)的試驗方法，研究培養(yǎng)基不同起始pH 值對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 Lb-s1 rp-1 在不同起始pH 值培養(yǎng)基中穩(wěn)定期的活菌數(shù)Fig.3 Number of Lb-s1 rp-1 viable bacteria in stationary phase at different initial pH media

圖3可知，菌株在起始pH 值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 后，活菌數(shù)分別為9.17×109，1.18×1010，2.12×1010，1.86×1010，1.14×1010CFU/mL，在起始pH值為5.5～7.5 的范圍內(nèi)，活菌數(shù)隨著pH 值的增大先升高后降低，pH 值為6.5 時，活菌數(shù)最高，顯著高于其它起始pH 值（P＜0.05）?？赡苡捎趐H 值從多方面影響著微生物的生命活動，不僅影響胞內(nèi)、外酶的生物活性，還影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以及改變培養(yǎng)基中化合物離子化程度，從而促進(jìn)或抑制菌株的生長繁殖。因此，確定培養(yǎng)基起始pH 值為6.5 作為下一步正交優(yōu)化試驗的主要因素與基準(zhǔn)水平。

2.1.4 接種量對菌種增菌的影響 不同的接種量對菌體活性影響不同，從而影響菌體適應(yīng)能力和生長速率[13]。因此，根據(jù)1.2.1（4）節(jié)的試驗方法，研究不同接種量對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，菌株分別以0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的接種量在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)，通過檢測活菌數(shù)，到達(dá)對數(shù)生長末期的培養(yǎng)時間分別為10，9，7，6，5 h；穩(wěn)定期活菌數(shù)分別達(dá)到2.09×1010，2.13×1010，2.18×1010，2.28×1010，2.20×1010CFU/mL。結(jié)果表明，接種量對菌種到達(dá)對數(shù)生長末期的時間有顯著影響（P＜0.05），對穩(wěn)定期的活菌數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。接種量較低會延長菌體的延滯期，接種量較高菌體會較快進(jìn)入對數(shù)生長期，進(jìn)而較快進(jìn)入菌體穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期菌體容易發(fā)生自溶現(xiàn)象[16]。因此，選擇1.0%的接種量作為下一步正交優(yōu)化試驗的主要因素與基準(zhǔn)水平。

圖4 Lb-s1 rp-1 在胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中不同接菌量培養(yǎng)生長曲線Fig.4 Growth curve of Lb-s1 rp-1 in carrot juice complex enriched medium with different inoculation amount

2.1.5 菌株搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗 根據(jù)1.2.1（5）節(jié)的試驗方法進(jìn)行弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗，結(jié)果見表2。

表2 Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優(yōu)化試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal optimization test results of Lb-s1 rp-1 in shake flask enrichment process

表2表明，三因素對菌株的影響順序為：培養(yǎng)溫度（A）＞接菌量（C）＞起始pH 值（B），通過對活菌數(shù)極差分析得到菌株的最佳增菌培養(yǎng)條件為：A2B2C3，即培養(yǎng)溫度37 ℃、起始pH 值6.5、接菌量1.0%。

2.1.6 驗證試驗 根據(jù)1.2.1（6）節(jié)的試驗方法對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝條件正交優(yōu)化試驗結(jié)果進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見圖5。

本實驗室前期研究結(jié)果[17]：未經(jīng)過弱后酸化選育的保加利亞乳桿菌Lb-s1 在番茄復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)達(dá)到2.25×1010CFU/mL。與本研究結(jié)果圖5所示：保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在最佳增菌培養(yǎng)條件下，6 h 到達(dá)對數(shù)生長末期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為2.28×1010CFU/mL。對比表明：經(jīng)過弱后酸化選育后，穩(wěn)定期活菌數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），到達(dá)對數(shù)末期的時間極顯著縮短（P＜0.01）。

圖5 Lb-s1 rp-1 在最佳增菌培養(yǎng)條件下生長曲線Fig.5 Growth curve of Lb-s1 rp-1 under optimal culture conditions

進(jìn)一步證明保加利亞乳桿菌Lb-s1 經(jīng)過弱后酸化選育之后，其細(xì)胞生長特性大大提高，細(xì)胞生長量未發(fā)生顯著改變。因此，優(yōu)化的搖瓶分批式培養(yǎng)工藝是可行的，可為下一步研究50 L 全自動發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)工藝奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 實驗室搖瓶分批式培養(yǎng)最佳增菌工藝條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)基起始pH 值6.5、接菌量1.0%、靜置培養(yǎng)，在此工藝條件下培養(yǎng)該菌株，6 h到達(dá)對數(shù)生長末期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為2.28×1010CFU/mL。

2.2 50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗

根據(jù)1.2.2 節(jié)的試驗方法對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進(jìn)行50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)優(yōu)選試驗，結(jié)果如圖6所示。

圖6可知，按照搖瓶分批式培養(yǎng)試驗得到的最佳增菌工藝將弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在50 L 發(fā)酵罐中分批式擴(kuò)大培養(yǎng)，6 h 到達(dá)對數(shù)生長末期，活菌數(shù)為2.35×1010CFU/mL。通過3 種補(bǔ)料方式，即調(diào)節(jié)pH 值、補(bǔ)料、調(diào)節(jié)pH 值與補(bǔ)料，到達(dá)對數(shù)生長末期的時間分別是8，6，8 h，穩(wěn)定期活菌數(shù)分別是2.29×1010，2.39×1010，2.48×1010CFU/mL。表明：調(diào)節(jié)pH 值可以顯著延長該菌株對數(shù)生長期（P＜0.05），補(bǔ)料對該菌略有增菌作用，然而，經(jīng)過生物統(tǒng)計分析，3 種補(bǔ)料方式對菌株穩(wěn)定期活菌數(shù)均無顯著影響（P＞0.05）。原因可能是該菌株6 h 即可到達(dá)對數(shù)生長末期，屬于生長較快的微生物，培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)也快速被消耗掉，單純補(bǔ)充葡萄糖單一碳源，無法滿足菌株繼續(xù)快速生長的營養(yǎng)需求。因此，綜合考慮菌株培養(yǎng)成本、設(shè)備要求、操作簡便程度以及產(chǎn)率，采用50 L 發(fā)酵罐分批式擴(kuò)大培養(yǎng)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的工藝是可行的，同時也為下一步產(chǎn)業(yè)化菌體培養(yǎng)工藝提供了依據(jù)。

圖6 Lb-s1 rp-1 在50 L 發(fā)酵罐中不同方式下生長曲線Fig.6 Growth curve of Lb-s1 rp-1 under different methods in 50 L fermenter

3 討論與結(jié)論

目前國內(nèi)外弱后酸化保加利亞乳桿菌的選育技術(shù)主要有誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因工程技術(shù)。傳統(tǒng)的誘變育種雖然存在工作量大、耗時長等問題，然而選育的弱后酸化菌株安全性有保證，而且沒有原生質(zhì)體融合技術(shù)的弊端[18]。本實驗室前期通過硫酸新霉素誘變育種法篩選得到弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1，該菌株傳至第8 代仍具有弱后酸化性能，具有遺傳穩(wěn)定性。培養(yǎng)基為乳酸菌提供菌體生長、繁殖、代謝所需要的碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子，試驗室所用的MRS 培養(yǎng)基成本較高，成分較多，配制繁瑣，并不適用于工業(yè)生產(chǎn)，篩選廉價增殖培養(yǎng)基是降低成本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗室從2000年初就開始了對乳酸菌廉價增殖培養(yǎng)基的研究，已經(jīng)針對不同菌株研制出菊芋汁[19]、番茄汁[17]、麥芽汁[20]、冬瓜汁[21]等復(fù)合增菌培養(yǎng)基，目前，本實驗室的這項技術(shù)已非常成熟。然而，國內(nèi)還沒有關(guān)于弱后酸化保加利亞乳桿菌廉價增殖培養(yǎng)基的研究報道，本實驗室對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進(jìn)行了的廉價增菌培養(yǎng)基的篩選工作，得出胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基為最佳增殖培養(yǎng)基。

龐啟亮等[22]研究的可以延緩后酸化的保加利亞乳桿菌H+-ATPase 缺陷型菌株在篩選的最適宜增殖培養(yǎng)基上，活菌數(shù)為1.44×109CFU/mL；姜慶玲等[23]對德氏乳桿菌保加利亞亞種的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后活菌數(shù)達(dá)6.07×109CFU/mL；程艷宇等[24]研究得出保加利亞乳桿菌LB在增殖培養(yǎng)基中，活菌數(shù)可達(dá)1.09×109CFU/mL。本研究得出弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1實驗室搖瓶分批式培養(yǎng)，最高活菌數(shù)達(dá)2.28×1010CFU/mL，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有報道結(jié)果。與弱后酸化選育前相比，菌株穩(wěn)定期活菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05），說明保加利亞乳桿菌Lb-s1 經(jīng)過弱后酸化選育之后，細(xì)胞生長量未發(fā)生顯著改變，因此，本文優(yōu)化的搖瓶分批式培養(yǎng)工藝是可行的，可為下一步研究50 L 全自動發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)工藝奠定基礎(chǔ)。

由于搖瓶培養(yǎng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)的環(huán)境條件有很大不同，因此不能直接使用搖瓶培養(yǎng)工藝進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，需要在搖瓶培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察適宜發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件?？垫嫉萚25]研究得出保加利亞乳桿菌在5 L 發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)的活菌數(shù)最大達(dá)到5.5×108CFU/mL；劉洋[26]對保加利亞乳桿菌進(jìn)行1 L 的放大培養(yǎng)試驗，結(jié)果顯示，活菌數(shù)最高可達(dá)1.8×109CFU/mL；李佳[27]在5 L 全自動發(fā)酵罐中對保加利亞乳桿菌LB5 的高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后活菌數(shù)達(dá)到2.7×109CFU/mL；本研究對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1在50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)試驗中，得到的活菌數(shù)達(dá)1010CFU/mL，遠(yuǎn)高于已報道的研究結(jié)果。綜合考慮菌株培養(yǎng)成本、設(shè)備要求、操作簡便程度以及產(chǎn)率，采用50 L 發(fā)酵罐分批式擴(kuò)大培養(yǎng)弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的工藝是可行的，可為弱后酸化保加利亞乳桿菌高效直投式發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)化提供菌體增殖培養(yǎng)技術(shù)。

綜上所述，本文對自行選育的弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在優(yōu)化的胡蘿卜汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基上，進(jìn)行實驗室搖瓶分批式培養(yǎng)優(yōu)選試驗、50 L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料式擴(kuò)大培養(yǎng)優(yōu)選試驗，在最佳的培養(yǎng)方式下得到較高的活菌數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)弱后酸化保加利亞乳桿菌高效直投式酸奶發(fā)酵劑中提供細(xì)胞廉價增殖培養(yǎng)技術(shù)，也為研究其它弱后酸化益生乳酸菌的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提供參考借鑒。