氮源對嗜熱鏈球菌胞外多糖表型特征的影響

劉 洋，喬少婷，李嘉雯，田佳樂，丹 彤，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特 010018）

多數(shù)乳酸菌（Lactic acid bacteria）是安全的（Generally recognized as safe，GRAS），具有多種潛在的益生功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、乳制品等[1]。乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）屬于大分子物質(zhì)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，不僅為機體提供生命活動的能量[2]，還可作為增稠劑、穩(wěn)定劑等應(yīng)用于發(fā)酵乳制品[3]。據(jù)報道，乳酸菌胞外多糖具有抗氧化[4]、抗腫瘤，降低膽固醇[5]，增強免疫力[6]和改善腸道微生態(tài)環(huán)境等特性[7]。如Lai?o 等[8]研究表明乳酸菌與其所產(chǎn)生的胞外多糖以相互作用的方式可減少腸上皮細(xì)胞的炎癥；Maeda 等[9]發(fā)現(xiàn)開菲爾乳桿菌產(chǎn)生的EPS，可降低血清膽固醇水平，抑制血壓升高。

乳酸菌菌種、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分等因素的變化對胞外多糖的表型有影響[10]。當(dāng)前，關(guān)于培養(yǎng)基中碳源類型對胞外多糖產(chǎn)量影響的報道較多，如陳營等[11]發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源時EPS 的產(chǎn)量相對較高，較低溫度下更適合多糖的合成和積累。Aparna 等[12]發(fā)現(xiàn)在M17 培養(yǎng)基中添加1%蔗糖后，嗜熱鏈球菌1275 胞外多糖的產(chǎn)量明顯提高。劉晶等[13]發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中果糖的添加量為2%時，副干酪乳桿菌VL8 的胞外多糖產(chǎn)量提高了2.6倍。然而，關(guān)于培養(yǎng)基中氮源類型對胞外多糖表型影響的報道較少。本研究以大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨分別替換M17 培養(yǎng)基中復(fù)合氮源，以M17 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，采用凝膠滲透色譜（Gel permeation chromatography，GPC） 測定嗜熱鏈球菌IMAU20561 胞外多糖各組分的分子質(zhì)量，采用紅外光譜（Infrared spectrum，IR）和高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography，HPLC）研究胞外多糖不同組分的理化性質(zhì)，分析培養(yǎng)基中不同氮源對嗜熱鏈球菌胞外多糖產(chǎn)量、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌IMAU20561 （Streptococcus thermophilus），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫（Lactic acid bacteria collection center，LABCC）提供。

大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、β-甘油磷酸二鈉、抗壞血酸鈉、酵母粉、硫酸鎂、95%無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、鹽酸、濃硫酸（均為分析純級），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；M17 液體培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)（青島）有限公司；透析袋8 000～14 000 u，北京Solarbio 公司；氯化鈉、氫氧化鈉，天津市匯杭化工科技有限公司；DEAE-Cellulose 52，Coolaber 公司；Sepharose CL-6B，瑞士Sigma 公司。

1.2 設(shè)備與儀器

超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海坤天試驗儀器有限公司；高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA 公司；DHL-BN型電腦恒流泵、TH-500A 梯度混合器、CBS-B 程控多功能全自動部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；SCIENTZ-10N 型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DL-6M 型高速冷凍離心機，cence 湘儀集團；電子天平，上海浦春計量儀表有限公司；UV-1700 型紫外分光光度計、IR Affinity-1 型傅立葉變換紅外光譜儀，日本SHIMADZU公司；ELEOS System 凝膠色譜儀，美國Wyatt 公司；Agilent1200 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 IMAU20561 胞外多糖的制備及測定

1） 胞外多糖的制備 將-80 ℃保存的IMAU20561 嗜熱鏈球菌于M17 液體培養(yǎng)基活化，以1×10-7CFU 的接種量接于不同氮源培養(yǎng)基中，37 ℃，24 h 培養(yǎng)兩代。將發(fā)酵液以12 000×g 離心25 min，去菌泥，上清液加80%三氯乙酸至終含量為4%，充分?jǐn)嚢瑁? ℃靜置10 h。將靜置后的發(fā)酵液12 000×g 離心25 min，取上清液，加3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置24 h，12 000×g 離心25 min，取沉淀用少量蒸餾水復(fù)溶，在8 000～14 000 u 的透析袋中透析48 h，每6 h 換1 次水，將透析液-20℃冷凍，真冷凍干燥得粗多糖。

2） 胞外多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 于具塞試管中，用蒸餾水補至0.5 mL，使各管含糖量分別為20，40，60，80，100 mg/L。每管加1 mL 6%苯酚溶液，迅速加入5 mL 濃硫酸，30 ℃水浴15 min，在波長490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，回歸方程為：y = 0.0255x + 0.0109（R2=0.9969）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

采用苯酚硫酸法[14]測定胞外多糖含量，于波長490 nm 處測定吸光度。以蒸餾水做空白對照，將所測吸光度值代入回歸方程計算胞外多糖含量。

1.3.2 不同氮源對IMAU20561 胞外多糖結(jié)構(gòu)影響

1.3.2.1 胞外多糖的純化 將凍干后的20 mg/mL 粗多糖以的質(zhì)量濃度于DEAE Sepharose-52纖維柱中進(jìn)行第1 次純化，收集不同EPS 組分并標(biāo)記，將不同組分的EPS 以150 mg/mL 的質(zhì)量濃度于Sepharose CL-6B 凝膠柱中進(jìn)行第2 次純化，收集純化后的EPS 冷凍干燥。

1.3.2.2 各組分胞外多糖的純度及分子質(zhì)量測定 采用凝膠色譜法（Gel permeation chromatography，GPC） 對各組分EPS 分子質(zhì)量、純度進(jìn)行測定。色譜條件：流動相：水+0.02%NaN3，色譜柱：Shodex OHpak 系列SB-806 串803，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量500 μL。采用GPC 軟件計算分子質(zhì)量，根據(jù)峰值的對稱性及出峰時間分析胞外多糖的純度及分子質(zhì)量。

1.3.2.3 各組分多糖的紅外光譜檢測 取適量胞外多糖樣品與一定量的KBr 粉末充分混合研磨、壓片。用傅里葉紅外光譜儀測定，在4 000～400 cm-1波段掃描。

1.3.2.4 各組分的單糖組成 采用高效液相色譜儀檢測各組分的單糖組成。稱取一定量樣品于水解管中，加1 mL 超純水，1 mL 4 mol/L 三氟乙酸（Trifluoroacetate，TFA），充氮，110 ℃水解2 h，冷卻至室溫。取0.1 mL 于4 mL 離心管中，在60 ℃真空干燥箱中干燥2 h，向離心管內(nèi)加入0.05 mL 0.3 mol/L NaOH，0.05 mL PMP 甲醇溶液，充氮，70 ℃水浴60 min，冷卻至室溫，加0.5 mL 0.3 mol/L HCl，0.75 mL 水，1.5 mL 氯仿，充分振蕩搖勻后靜置分層，棄下層液體氯仿。萃取3 次后，取水層，用0.45 μm 過濾膜除去雜質(zhì)，用液相色譜儀分析。色譜條件：色譜柱為SHISEIDO C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.8）與乙腈體積比82∶18，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，波長245 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 IMAU20561 胞外多糖產(chǎn)量

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基M17 作對照，采用苯酚硫酸法測定以大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨為唯一氮源的M17 培養(yǎng)基中嗜熱鏈球菌IMAU20561 胞外多糖的產(chǎn)量（圖2）?？梢钥闯?，基礎(chǔ)培養(yǎng)基M17 的胞外多糖產(chǎn)量為150.8 mg/L，以大豆蛋白胨為唯一氮源時的產(chǎn)量為480.7 mg/L，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基M17 相比提高2 倍多，胰蛋白胨培養(yǎng)基所產(chǎn)的EPS 量為175 mg/L，而酪蛋白胨培養(yǎng)基的EPS 產(chǎn)量最低，僅為28.1 mg/L?？梢?，不同氮源作培養(yǎng)基時嗜熱鏈球菌IMAU20561 胞外多糖產(chǎn)量差異較大，這主要是因氮源是乳酸菌生長過程中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，不同氮源中的營養(yǎng)成分影響胞外多糖合成途徑中相關(guān)酶的活性[15]，從而影響胞外多糖的產(chǎn)量。近年來，關(guān)于氮源對胞外多糖的合成及產(chǎn)量的影響廣受關(guān)注。如Khanh 等[16]發(fā)現(xiàn)酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨等氮源能促進(jìn)植物乳桿菌T10 產(chǎn)胞外多糖。Almalki[17]研究發(fā)現(xiàn)硫酸銨、酪蛋白、脫脂牛奶和燕麥粉等作為乳酸桿菌的氮源時EPS 的產(chǎn)量明顯增加；Fazilet 等[18]研究發(fā)現(xiàn)硝酸鈉和細(xì)菌學(xué)蛋白胨對不同菌株EPS 產(chǎn)量的影響差異較大，特別是無機氮源硝酸鈉會抑制乳酸菌胞外多糖的合成。

圖2 不同氮源時胞外多糖的產(chǎn)量Fig.2 EPS yield under different nitrogen sources

2.2 IMAU20561 胞外多糖的純化分離

2.2.1 胞外多糖DEAE-Cellulose 52 離子柱純化 DEAE-Cellulose 52 純化是利用分離物自身所帶電荷不同，與離子交換劑結(jié)合能力的差異，經(jīng)不同濃度的緩沖液洗脫，達(dá)到純化的目的。嗜熱鏈球菌IMAU20561 在大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨為單一氮源的M17 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，提取的粗EPS 經(jīng)DEAE-Cellulose 52 純化得到的EPS 組分如圖3所示。大豆蛋白胨作唯一氮源時，M17 培養(yǎng)基所得粗EPS 經(jīng)去離子水洗脫收集，冷凍干燥得到3 個組分：EPS 1-1 和EPS 1-2 為中性多糖，EPS 1-3 為酸性多糖或帶有酸性基團的糖復(fù)合物。胰蛋白胨作唯一氮源時M17 培養(yǎng)基提取的粗多糖純化得到3 個組分：EPS 2-1 為不帶電荷的中性多糖，EPS 2-2 和EPS 2-3 為酸性多糖或帶酸性基團的糖復(fù)合物。酪蛋白胨為唯一氮源時M17 培養(yǎng)基提取的粗多糖經(jīng)分離純化得到2 個組分，其中EPS 3-1 為不帶電荷的中性多糖，EPS 3-2 為帶負(fù)電荷的酸性多糖或帶有酸性基團的糖復(fù)合物?；A(chǔ)培養(yǎng)基M17 所得粗多糖經(jīng)離子交換柱純化得到2 個組分，分別為中性多糖EPS 4-1和酸性多糖EPS 4-2。分別收集上述各組分中產(chǎn)量較高的EPS 1-3，EPS 2-3，EPS 3-1，EPS 4-1進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖3 不同氮源粗EPS 經(jīng)DEAE-Cellulose 52 離子交換色譜柱梯度洗脫曲線Fig.3 Stepwise elution curve of crude EPS from different nitrogen sources on DEAE-Cellulose 52 chromatography column

2.2.2 胞外多糖Sepharose CL-6B 凝膠柱層析純化 收集到的EPS 1-3，EPS 2-3，EPS 3-1，EPS 4-1 經(jīng)Sepharose CL-6B 純化，結(jié)果如圖4所示。所得各組分均為單一峰，峰值對稱，相對分子質(zhì)量都較為均一。

圖4 胞外多糖經(jīng)Sepharose CL-6B 色譜柱的洗脫曲線Fig.4 Elution curves of EPS on Sepharose CL-6B chromatography column

2.3 IMAU20561 各組分胞外多糖分子質(zhì)量

各組分胞外多糖分子量的測定結(jié)果由圖5所示。多糖組分EPS 1-3，EPS 2-3，EPS3-1，EPS4-1經(jīng)凝膠色譜儀的雙檢測器檢測后均為單一對稱峰，4 種組分均為單一多糖與凝膠過濾色譜法所得結(jié)果一致。

圖5 胞外多糖的GPC 圖譜Fig.5 GPC chromatogram of EPS

各EPS 組分的分子質(zhì)量見表2，4 種組分的EPS 多分散系數(shù)（PDI，Mw/Mn）均小于3，表明分子質(zhì)量分布的范圍都較均一[19]。多糖的分子質(zhì)量與胞外多糖水溶液的黏度呈正相關(guān)關(guān)系[20]。本試驗中EPS 3-1 的分子質(zhì)量遠(yuǎn)高于其它3 種多糖組分，說明酪蛋白胨作為唯一氮源時產(chǎn)生的多糖可增加乳制品中的黏度，可作為增稠劑、穩(wěn)定劑等應(yīng)用于乳制品生產(chǎn)中[21]。

表2 胞外多糖的分子特征Table 2 The molecular characteristic of EPS

2.4 IMAU20561 各組分多糖的單糖檢測結(jié)果

2.4.1 各組分多糖的紅外光譜檢測結(jié)果 用紅外光譜可以識別吡喃糖、呋喃糖，確定糖苷鍵的類型、糖的構(gòu)型及EPS 鏈上羥基取代的信息，是鑒別多糖結(jié)構(gòu)的重要方法。由圖6可知，在3 600～3 200 cm-1范圍內(nèi)，EPS 1-3、EPS 2-3、EPS 3-1和EPS 4-1 都有一個寬而強的吸收峰，是由-OH鍵伸縮振動引起的；在2 930 cm-1附近的吸收峰為C-H 伸縮振動峰，是典型的多糖特征峰[22]；在1 700～1550cm-1范圍內(nèi)，吸收峰為1632.65，1646.97 cm-1和1 643.39 cm-1，是羧基的對稱或非對稱伸縮振動[23]；在1 500～950 cm-1范圍為碳水化合物的指紋區(qū)域，在1 410～1 200 cm-1范圍的吸收峰為C-H 的變角振動[2]；1 026～1 049 cm-1和920～927 cm-1范圍為吡喃糖環(huán)的對稱或非對稱伸縮振動吸收峰[24]；在840～920 cm-1范圍有多個吸收峰表示樣品同時存在α 和β 構(gòu)型[23]?？梢?，不同氮源培養(yǎng)基中獲得的胞外多糖在構(gòu)型上相似度較高，官能團差異較小。酸性多糖EPS 1-3 與EPS 2-3 都含有羥基、亞甲基等官能團。水洗純化的多糖組分EPS 3-1 與EPS 4-1 主要官能團組成相似，EPS 1-3 在1 640 cm-1附近沒有明顯峰值，不能判斷是否含有羧基，在多糖指紋區(qū)沒有明顯差異，差異性較小。

圖6 胞外多糖的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum of EPS

2.4.2 各組分的單糖組成 不同氮源的M17 培養(yǎng)基中嗜熱鏈球菌IMAU20561 胞外多糖各組分的HPLC 分析結(jié)果見圖8。圖7為標(biāo)準(zhǔn)品單糖的出峰時間：①甘露糖（Man）（RT=13.375 min）；②核糖 （Rib）（RT=17.121 min）；③鼠李糖（Rha）（RT=17.872 min）；④葡萄糖醛酸（GlcA）（RT=20.974 min）；⑤半乳糖醛酸 （GalA）（RT=24.226 min）；⑥葡萄糖（Glc）（RT=27.432 min）；⑦半乳糖（Gal）（RT=31.296 min）；⑧木糖（Xyl）（RT=32.538 min）；⑨阿拉伯糖（Ara）（RT=34.144 min）；⑩）巖藻糖（Fuc）（RT=38.673 min）。

圖7 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatogram of monosaccharide reference

圖8 各組分的單糖組成分析圖Fig.8 Analysis of monosaccharide composition of EPS

比對純化的各組分胞外多糖的單糖組成與單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，根據(jù)出峰順序及保留時間得出各組分之間的單糖種類及含量有一定的差異。EPS 1-3 和EPS 2-3 為酸性多糖，EPS 1-3 主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成，物質(zhì)的量的比為1∶1.24∶0.68。EPS 2-3 主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖3 種單糖組成，占總物質(zhì)的量的85.58%，物質(zhì)的量的比為1.84∶0.15∶1，這 與DEAE-Cellulose 52 離子柱純化結(jié)果較一致。EPS 3-1 和EPS 4-1 主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，物質(zhì)的量的比分別為1∶8.36∶0.15 和1∶3.68∶0.14。這兩種中性多糖組分的物質(zhì)的量的比和單糖的種類差異較小，還需進(jìn)一步確定是否為同類型多糖。

3 結(jié)論

乳酸菌是公認(rèn)的食品級安全微生物，其在乳制品發(fā)酵過程中會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物胞外多糖，而胞外多糖具有獨特的流變學(xué)特性和分子結(jié)構(gòu)，可作為增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等在乳制品生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。本試驗以分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的嗜熱鏈球菌IMAU20561 為對象，研究不同氮源對胞外多糖表型特征的影響，得到如下結(jié)論：

1） 由不同氮源的M17 培養(yǎng)基獲得的胞外多糖的產(chǎn)量不同，當(dāng)大豆蛋白胨為唯一氮源時，胞外多糖產(chǎn)量最高，達(dá)480.7 mg/L。

2） 由不同氮源的M17 培養(yǎng)基所得胞外多糖分子質(zhì)量也有顯著差異，以酪蛋白胨為唯一氮源的M17 培養(yǎng)基所得EPS 分子質(zhì)量最大，其次為基礎(chǔ)培養(yǎng)基M17、大豆蛋白胨培養(yǎng)基和胰蛋白胨培養(yǎng)基。

3） 有不同氮源的M17 培養(yǎng)基生產(chǎn)的胞外多糖結(jié)構(gòu)有顯著差異，各單糖組成的百分比有所不同。