IgA腎病患者外周血microRNA-223、NLRP3水平與腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)性*

朱付英，李瑾，閻其均，周曉莉

（1.重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶401420；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶400016）

IgA 腎?。↖gA nephropathy, IgAN）是臨床原發(fā)性腎小球腎炎最常見的類型之一，一般表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)IgA 沉積，并常伴有其他免疫球蛋白沉積，20%～40%患者在發(fā)病10年后發(fā)展為慢性腎衰竭， 進(jìn)入終末期腎?。╡nd-stage renal disease,ESRD）[1-2]。腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis,RIF）是IgAN 等大部分慢性腎臟病發(fā)展到ESRD 的病理學(xué)基礎(chǔ)及共同途徑之一，病理特征為腎小管萎縮、細(xì)胞外基質(zhì)增多、細(xì)胞凋亡等，因而RIF 程度是影響IgAN 進(jìn)展及預(yù)后的重要因素[3-4]。NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3, NLRP3）炎性體由凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein, ASC）、NLRP3 和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶前體組成。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，其在腎臟炎癥進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[5]。MicroRNA（miRNA）是由18～23 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，可與靶基因3′-UTR 區(qū)配對(duì)結(jié)合，抑制或降低靶基因表達(dá)，從而參與機(jī)體的生理調(diào)控[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-223 可靶向下調(diào)NLRP3 水平以緩解炎癥反應(yīng)[8]。IgAN 患者外周血microRNA-223（miR-223）、NLRP3 與RIF 的相關(guān)性未見報(bào)道，因此本研究通過測定IgAN 患者、健康者及非IgAN 者的外周血miR-223、NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量及RIF 指標(biāo)，來分析miR-223、NLRP3 mRNA 與RIF 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年1月在重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)腎組織病理檢查確診為原發(fā)性IgAN 患者164 例作為研究對(duì)象。其中，男性90 例，女性74 例；年齡22～64 歲，平均（34.27±8.17）歲。根據(jù)腎小管萎縮或RIF 面積將患者分為3 組[9]：①腎小管萎縮或RIF 面積≤25%患者70 例作為RIF T0 組；②腎小管萎縮或RIF 面積> 25%～50%患者54 例作為RIF T1 組；③腎小管萎縮或RIF 面積> 50%患者40 例 作為RIF T2 組。

另取本院健康體檢志愿者95 例作為對(duì)照A 組，其中男性52 例，女性43 例；年齡24～67 歲，平均（36.10±9.22）歲；體檢顯示肝腎功能、尿常規(guī)正常，無糖尿病及心腦血管、高血壓病史。

另取同期本院非IgAN 患者80 例作為對(duì)照B 組，其中男性38 例，女性42 例；年齡23～65 歲，平均（35.26±8.07）歲；其中局灶階段增生/硬化14 例、膜性腎病37 例、輕度系膜增生13 例、微小病變性腎病16 例；排除近期使用過糖皮質(zhì)激素、甾體類消炎藥，以及合并病毒性肝炎、惡性腫瘤及甲狀腺疾病者。

本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬簽訂知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①病例資料完整，年齡>18 歲；②腎活檢前未使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、調(diào)脂藥等；③腎活檢電鏡、免疫熒光、光鏡資料完整，且活檢腎小球數(shù)目> 10 個(gè)；④排除紫癜性腎炎、乙肝病毒、高血壓腎損害、甲狀腺病及狼瘡腎炎等繼發(fā)性IgAN；⑤患者近期無慢性炎癥反應(yīng)。

1.3 主要試劑和儀器

miR-233、NLRP3 及內(nèi)參U6、GAPDH 引物由美國金唯智公司合成，Trizol 試劑、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）試劑盒由武漢純度生物科技有限公司提供，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein, MCP-1）、轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor-α,TGF-α）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6, IL-6）、缺氧誘導(dǎo)因子α（hypoxia inducible factor-α, HIF-α）等酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒均由南京森貝伽生物科技有限公司提供。

WD-320 型全自動(dòng)生化分析儀由武漢醫(yī)盾醫(yī)療器械有限公司提供，ProFlex?PCR 系統(tǒng)由美國賽飛世爾科技公司提供。

1.4 觀察指標(biāo)

收集各組年齡、性別、既往史、發(fā)病情況、用藥史、舒張壓（diastolic blood pressure, DBP）、收縮壓（systolic blood pressure, SBP）、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure,MAP）。

測定各組血總蛋白（total protein, TP）、血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、白蛋白（Albumin, Alb）、尿酸（uric acid, UA）、胱抑素C（cystatin C, CysC）、24 h 尿蛋白。腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate, GFR）結(jié)果采用CKDEPI 公式[10]。

1.5 qRT-PCR測定各組外周血miR-223、NLRP3 mRNA

收集各組空腹靜脈外周血10 mL，在4℃條件下放置0.5 h，3 000 r/min 離心10 min，取血清置于-80℃冰箱冷凍保存。采用Trizol 試劑提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系：0.4 μL M-MLV，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，0.3 μL RNA 酶抑制劑，2 μL 10×緩沖液，補(bǔ)加超純水至20 μL。qRT-PCR 反應(yīng)體系：正反向引物各1 μL，PCR 緩沖液12.5 μL，150 ng cDNA 1.0 μL，Tag 酶0.5 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s、，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。采用2-??CT法對(duì)miR-223、NLRP3 mRNA 進(jìn)行定量分析。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 ELISA測定各組外周血RIF指標(biāo)

采用ELISA 測定各組外周血RIF 指標(biāo)，包括TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α，各指標(biāo)檢測均按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法；相關(guān)性分析用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較

對(duì)照A 組、對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組的性別、年齡比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)或單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組MAP、Hb、TP、Alb、UA、24 h 尿蛋白、CysC、GFR 水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：與對(duì)照A 組比較，對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組患者Hb、TP、Alb、GFR 水平依次降低（P<0.05），而MAP、UA、CysC 水平依次升高（P<0.05），RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組24 h 尿蛋白依次升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組臨床資料比較 例（%）

2.2 各組外周血miR-223、NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照A 組、對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組miR-223、NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：與對(duì)照A 組比較，對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組患者miR-223 相 對(duì)表達(dá)量依次降低（P<0.05），NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量依次升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組外周血miR-223、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組外周血miR-223、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對(duì)照A 組比較，P<0.05；②與對(duì)照B 組比較，P<0.05；③與RIF T0組比較，P<0.05；④與RIF T1組比較，P<0.05。

NLRP3 mRNA 1.17±0.16 1.26±0.18①1.45±0.19①②1.68±0.21①②③1.83±0.22①②③④131.345 0.000組別對(duì)照A組對(duì)照B組RIF T0組RIF T1組RIF T2組F 值P 值n 95 80 70 54 40 miR-223 1.07±0.12 0.92±0.11①0.83±0.09①②0.70±0.08①②③0.61±0.07①②③④205.770 0.000

2.3 各組外周血TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α水平比較

對(duì)照A 組、對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：與對(duì)照A 組比較，對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組患者TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平依次升高（P<0.05）。見表4。

表4 各組外周血TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α水平比較 （±s）

表4 各組外周血TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α水平比較 （±s）

注：①與對(duì)照A組比較，P<0.05；②與對(duì)照B組比較，P<0.05；③與RIF T0組比較，P<0.05；④與RIF T1組比較，P<0.05。

組別對(duì)照A組對(duì)照B組RIF T0組RIF T1組RIF T2組F 值P 值n 95 80 70 54 40 HIF-α/（μg/L）10.62±9.31 23.47±5.73①46.24±11.47①②71.98±18.26①②③142.67±36.56①②③④530.832 0.000 TGF-β1/（ng/L）176.84±40.23 287.38±51.61①417.70±120.26①②590.87±125.46①②③794.76±242.85①②③④259.040 0.000 MCP-1/（ng/L）25.58±10.16 36.38±11.98①43.76±13.94①②52.76±15.49①②③63.08±17.13①②③④73.732 0.000 TGF-α/（ng/L）18.84±5.16 25.58±8.62①32.66±15.04①②57.21±17.05①②③102.48±25.84①②③④299.784 0.000 IL-6/（ng/L）14.06±4.25 20.18±4.62①63.71±17.12①②94.58±16.37①②③125.42±20.16①②③④841.591 0.000

2.4 IgAN患者外周血miR-223、NLRP3 mRNA與RIF指標(biāo)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IgAN 患者TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 與miR-223呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），而與NLRP3 mRNA 呈正相關(guān)（P<0.05）。見表5。

表5 IgAN患者外周血miR-223、NLRP3與RIF指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

RIF 患者腎細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡，導(dǎo)致大量炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)沉積在腎間質(zhì)，從而破壞腎臟，誘導(dǎo)大量纖維細(xì)胞聚集，表現(xiàn)為腎小球和腎血管周圍血管硬化、變薄等癥狀[11-12]。RIF 與IgAN患者腎臟功能、預(yù)后與Oxford 分型相關(guān)，是導(dǎo)致IgAN 等腎臟疾病預(yù)后不良的主要原因[13]。CysC、UA 是反映腎功能的臨床指標(biāo)，是經(jīng)腎臟排出的蛋白和嘌呤的代謝物，是臨床上反映腎損傷的常規(guī)生化因子。CysC 是低分子蛋白，可自由通過腎小球，然后經(jīng)腎曲小管重吸收后分解代謝；腎臟是代謝清除CysC 的唯一器官，腎功能異常可導(dǎo)致血清CysC 水平上調(diào)，因此測定血清CysC 水平可以檢測腎功能[14]。本研究納入IgAN 患者、非IgAN 患者和健康志愿者進(jìn)行研究，結(jié)果表明各組受試者的年齡、性別無差異，而外周血Hb、TP、Alb、GFR水平在IgAN 患者中隨RIF 程度加重而依次降低，UA、CysC 及24 h 尿蛋白隨之依次升高，說明IgAN患者腎功能受損與RIF 程度相關(guān)。

NLRP3 炎性體可被內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式及外源性病原相關(guān)分子模式激活，但其激活的具體機(jī)制尚未明確[15]。NLRP3 炎性體能夠與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-1 等形成復(fù)合物，以活化Caspase-1，從而發(fā)揮調(diào)控作用。有研究還發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠模型中，腎小球細(xì)胞可激活NLRP3，誘導(dǎo)糖尿病及腎小球損傷[16]。此外，高尿酸血可活化NLRP3，上調(diào)近端小管炎癥介質(zhì)水平，加重糖尿病腎病病情[17]。miR-223 作為一種非編碼小分子RNA，在血小板、內(nèi)皮細(xì)胞及血漿中廣泛存在。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，其參與多種疾病的病理生理進(jìn)程，如肝癌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[18-19]。有研究表明，miR-223 可抑制NLRP3 表達(dá)，從而下調(diào)IL-1β、IL-18 水平，以減輕小鼠急性放射性肺組織炎癥反應(yīng)[20]。miR-223 還可與NLRP3 的3′UTR 區(qū)配對(duì)結(jié)合，以調(diào)控IL-1β 等炎癥介質(zhì)表達(dá)，從而調(diào)控腸道炎癥[21]。全基因掃描結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)NLRP3 屬于miR-223 作用靶點(diǎn)之一[19]。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照A 組比較，對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組患者miR-223 相對(duì)表達(dá)量依次降低，NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量依次升高，說明miR-223 可能通過調(diào)控NLRP3 表達(dá)進(jìn)而影響IgAN 患者RIF 的發(fā)生、發(fā)展。TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 等指標(biāo)是臨床常用來評(píng)價(jià)RIF進(jìn)程的生物因子。有研究發(fā)現(xiàn)，IgAN 患者血清丙二醛與上述因子呈正相關(guān)，而與谷胱甘肽過氧化物酶、氧化物歧化酶、過氧化氫酶呈負(fù)相關(guān)，提示血清氧化應(yīng)激指標(biāo)與RIF 程度相關(guān)，其可能參與RIF 的發(fā)生、發(fā)展過程[22]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照A 組比較，對(duì)照B 組、RIF T0 組、RIF T1 組、RIF T2 組 患者TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平依次升高，同樣說明IgAN 患者RIF 會(huì)導(dǎo)致TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 水平升高。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IgAN患者miR-223與TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α 呈負(fù)相關(guān)，NLRP3 mRNA 與TGF-β1、MCP-1、TGF-α、IL-6、HIF-α呈正相關(guān)，說明miR-223、NLRP3與RIF指標(biāo)具一定相關(guān)性，推測兩者可能共同參與RIF 的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，IgAN 患者外周血miR-223 低表達(dá)，NLRP3 mRNA 高表達(dá)，兩者均與RIF 有相關(guān)性，可能參與RIF 的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。但本研究仍存在不足之處，納入研究對(duì)象較少，結(jié)果可能存在偏倚，且對(duì)非IgAN 患者RIF 情況未明確分析，后期實(shí)驗(yàn)將在大樣本基礎(chǔ)上剔除混雜因素，深入研究miR-223、NLRP3 在IgAN 中的具體作用機(jī)制。