扶正散結(jié)方輔助治療對晚期非小細胞肺癌患者免疫功能及microRNA-335-5p水平的影響*

劉峰林，馬琳，宋然，黃焰

（徐州市中醫(yī)院1.腫瘤科，2.呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州221000）

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)于男性，其發(fā)病率、致死率在男性腫瘤中居于首位[1]。肺癌按組織病理學(xué)分類又分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma, NSCLC），其中NSCLC 在肺癌中占比> 80%[2]。NSCLC 早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已發(fā)展至中晚期，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，無法接受手術(shù)根治。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，超過2/3 的NSCLC 患者無法接受手術(shù)根治[3]。對于此類患者臨床多以放射治療、化學(xué)治療（以下簡稱化療）作為主要治療手段，但化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常機體造成較大損傷，且毒性反應(yīng)較多。近年來，中醫(yī)藥在抗腫瘤研究方面取得較好成績，尤其在減毒增效、抑制腫瘤生長等方面，可一定程度彌補放化療的不足[4]。以往有研究指出，扶正散結(jié)方、扶正減毒湯、扶正抑瘤湯等用于肺癌的輔助治療可有效提高臨床療效[5-6]。但多以早中期肺癌患者作為研究對象，對晚期NSCLC患者的研究鮮少開展。基于此，本研究將218 例晚期NSCLC 患者隨機分組進行干預(yù)，以此探討扶正散結(jié)方治療晚期NSCLC 對免疫功能及miRNA-335-5p 水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月—2020年9月就診于徐州市中醫(yī)院的218 例晚期NSCLC 患者。根據(jù)不同治療方法將患者分為對照組和研究組，均為109 例。對照組男性72 例，女性37 例；年齡45～67 歲，平均（54.35±5.23）歲；病理類型：腺癌55 例，鱗癌25 例，腺鱗癌27 例，其他2 例；平均卡氏評分（48.74±4.18）分。研究組男性74 例，女性35 例；年齡44～67歲，平均（54.07±5.16）歲；病理類型：腺癌57 例，鱗癌26 例，腺鱗癌25 例，其他1 例；平均卡氏評分（48.83±4.11）分。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中國晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識（2016年版）》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像學(xué)、組織學(xué)檢查確診。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2011 版《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[8]，癥見乏力神疲，面色無華，胸痛胸悶，少痰或痰稀而黏，咳嗽，氣短喘促，盜汗，舌淡紅且苔少而干，脈象細弱無力，則可診斷為氣陰兩虛型肺癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：①卡氏評分> 40 分，且預(yù)計生存期> 3 個月；②患者≤75 歲；③TNM 分期Ⅲb～Ⅳ期；④自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他重要器官（肝、肺等）惡性腫瘤者；②合并免疫系統(tǒng)疾病者；③治療前已接受放化療治療者；④治療依從性較差者；⑤合并嚴(yán)重感染者。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），可對比。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

對照組采用TC 化療方案：化療第1 天靜脈滴注紫杉醇（山西振東制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20058655）+生理鹽水，劑量75 mg/m2；注射用卡鉑（辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20059009）加入500 mL 葡萄糖溶液中，靜脈滴注；應(yīng)用西咪替丁、非那根、地塞米松滴注紫杉醇前預(yù)處理；化療21 d 為1 個周期，共3 個周期。研究組在對照組基礎(chǔ)上采用扶正散結(jié)方輔助治療，藥方：黃芪、薏苡仁各30 g，炒白術(shù)、八月扎、浙貝母、山慈菇各15 g，石見穿、石上柏各20 g，法半夏12 g，陳皮、杏仁、防風(fēng)各10 g；水煎取250 mL，1 劑/d，早晚分服，21 d 為1 個周期，共3 個周期。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 療效 參考RECIST 1.1 版標(biāo)準(zhǔn)[9]并結(jié)合腫瘤標(biāo)志物水平對兩組近期（治療2 個周期后）臨床療效進行評估。治療后未見新病灶，且原有病灶消失，腫瘤標(biāo)志物恢復(fù)正常，且持續(xù)4 周以上，則為完全緩解（CR）；治療后未見新病灶，且原有病灶最大徑之和減少> 50%，腫瘤標(biāo)志物恢復(fù)正常，且持續(xù)> 4 周，則為部分緩解（PR）；原有病灶最大徑之和減少≤50%，或增加≤20%，腫瘤標(biāo)志物水平變化不明顯，則為疾病穩(wěn)定（SD）；未達上述標(biāo)準(zhǔn)，則為疾病進展（PD）。疾病控制率（DCR）=（CR+PR+SD）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.3.2 血清學(xué)指標(biāo) 于治療前、治療2 個周期后采集兩組肘正中靜脈血5 mL，離心處理后取上層血清置于-80℃冷凍保存待測。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定，腫瘤特異性生長因子（TSGF）采用分光光度比色法測定。

1.3.3 腫瘤標(biāo)志物 血清采集處理方法同上，癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、人細胞角蛋白21-1 片段（CYFRA21-1）水平均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定。miR-335-5p 表達水平通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測定，收集新鮮癌組織及癌旁組織，置入-80℃冰箱冷凍保存，采用總RNA 提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）將RNA從組織中提取出來，以RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補DNA，以此為模板行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。miR-335-5p 正向引物：5′-GGTCAAGAGCAA TAACGAA-3′，反向引物：5′-AGCAGGAAAGCAGC AATA-3′，分別為24 和25 bp；內(nèi)參基因U6正向引物：5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′，反 向 引物：3′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-5′，分別為22 和23 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性14 s，62℃退火62 s，72℃延伸12 s，共40 個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-335-5p 相對表達水平。

1.3.4 免疫功能 血清采集處理方法同上，采用Cytek Northern Lights 全光譜流式細胞儀（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）測定T 淋巴細胞亞群水平。

1.3.5 毒副作用 采用WHO 抗癌藥急性及亞急性毒性反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)進行評估，分為Ⅰ～Ⅳ級。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t值檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；等級資料以等級表示，比較用秩和檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較

兩組DCR 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.163，P=0.041），研究組高于對照組。見表1。

表1 兩組療效比較 [n=109，例（%）]

2.2 兩組治療前后血清學(xué)指標(biāo)比較

兩組治療前TSGF、VEGF、TGF-β 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后TSGF、VEGF、TGF-β 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），研究組低于對照組。見表2。

表2 兩組治療前后血清學(xué)指標(biāo)比較 （n=109，±s）

表2 兩組治療前后血清學(xué)指標(biāo)比較 （n=109，±s）

組別對照組TSGF/（u/mL）治療前78.46±8.16治療后66.16±6.91 VEGF/（ng/L）治療前160.17±27.19治療后144.29±23.60 TGF-β/（pg/mL）治療前69.48±8.73治療后51.25±6.81研究組t 值P 值79.08±8.30 0.556 0.579 63.54±6.27 2.932 0.004 158.64±26.55 0.420 0.675 133.67±22.81 3.378 0.001 70.22±8.83 0.622 0.535 47.65±6.18 4.087 0.000

2.3 兩組治療前后腫瘤標(biāo)志物水平比較

兩組治療前CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-335-5p 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-335-5p水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），研究組CEA、CA125、CYFRA21-1 水平低于對照組，miR-335-5p 水平高于對照組。見表3。

表3 兩組治療前后腫瘤標(biāo)志物水平比較 （n=109，±s）

表3 兩組治療前后腫瘤標(biāo)志物水平比較 （n=109，±s）

組別對照組CEA/（ng/mL）治療前125.71±12.57治療后103.48±11.29 CA125/（u/mL）治療前270.14±22.41治療后171.28±18.97 CYFRA21-1/（ng/mL）治療前18.37±3.82治療后9.05±3.02 miR-335-5p治療前0.83±0.30治療后0.73±0.22研究組t 值P 值126.24±12.41 0.313 0.755 97.20±11.16 4.130 0.000 268.33±23.09 0.587 0.558 152.18±15.90 8.056 0.000 18.19±3.93 0.343 0.732 7.15±2.88 4.753 0.000 0.80±0.29 0.751 0.453 0.92±0.36 4.702 0.000

2.4 兩組治療前后免疫功能水平比較

兩組治療前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），研究組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比對照組高，CD8+比對照組低。見表4。

表4 兩組治療前后免疫功能水平比較 （n=109，±s）

表4 兩組治療前后免疫功能水平比較 （n=109，±s）

組別對照組CD3+/%治療前56.34±3.35治療后52.76±3.25 CD4+/%治療前35.87±2.45治療后33.14±2.17 CD8+/%治療前28.94±1.86治療后31.23±2.23 CD4+/CD8+治療前1.24±0.38治療后1.20±0.36研究組t 值P 值55.94±3.42 0.872 0.384 60.29±4.11 15.004 0.000 36.10±2.49 0.687 0.493 38.36±2.79 15.419 0.000 28.67±1.80 1.089 0.277 26.14±1.56 19.527 0.000 1.25±0.40 0.189 0.850 1.41±0.59 3.172 0.002

2.5 兩組毒副作用比較

兩組骨髓抑制、腎功能損傷、肝功能損傷情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），研究組優(yōu)于對照組。見表5。

表5 兩組毒副作用比較 （n=109，例）

3 討論

中醫(yī)將肺癌歸屬于“肺積”、“咳嗽”、“息賁”等范疇，是一種局部屬實、全身屬虛、本虛標(biāo)實的疾病，病因在于正虛邪聚，陰陽失衡致使正氣虧損，邪毒乘虛而入致使肺腑失調(diào)，痰熱久蘊，瘀結(jié)于肺[10]。正氣虧虛、肺脾腎同虛是其病灶轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的源頭，治療應(yīng)以“扶正消積”、“益氣養(yǎng)陰”為主要原則[11]。扶正散結(jié)方具有益氣養(yǎng)陰、活血散瘀、軟堅散結(jié)之功效，基本符合NSCLC 的治療原則，可能在治療中取得較好的療效。

本研究結(jié)果顯示，研究組DCR 高于對照組，研究組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均比對照組高，CD8+比對照組低，且研究組骨髓抑制、腎功能損傷、肝功能損傷情況優(yōu)于對照組，提示扶正散結(jié)方應(yīng)用于晚期NSCLC 的輔助治療可有效提高治療效果，改善免疫功能，減少化療毒副作用。究其原因在于，扶正散結(jié)方具有益氣養(yǎng)陰、軟堅散結(jié)之功效，方中黃芪歸脾、肺經(jīng)，有固表補氣之功效，可治氣虛乏力、自汗等癥；現(xiàn)代藥理學(xué)證實，黃芪可對自然殺傷細胞、體細胞釋放免疫活性物質(zhì)，增強體液免疫功能，進而發(fā)揮一定抗腫瘤作用[12]。薏苡仁歸脾、肺經(jīng)，有健脾除痹、解毒散結(jié)之功效，可治肺癰、癌腫；現(xiàn)代動物實驗表明薏苡仁中不飽和脂肪酸（亞油酸）可發(fā)揮抗癌作用，促使腫瘤細胞變性，還有些成分可使細胞核分裂停止于中期，促使腫瘤細胞凋亡；薏苡仁蛋白中多種成分有益于人體，薏苡仁油脂可有效緩解肌肉痙攣，舒張支氣管，從而對呼吸功能起到一定改善作用[13]。炒白術(shù)有燥濕利水、止汗之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)證實，白術(shù)對癌細胞具有一定細胞毒作用，可抑制腫瘤細胞增殖，并抑制其對組織的侵襲，發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。八月扎有利濕、解毒、止痛之功效；浙貝母有清熱化痰、散結(jié)解毒之功效，可治咳嗽、肺癰喉痹、瘡瘍腫毒等；山慈菇可清熱解毒、消癰散結(jié)，多用于治療癰腫疔毒、瘰疬痰核，《滇南本草》中記載：消陰分之痰，止咳嗽；石見穿化學(xué)成分三萜成分、全草含甾醇、氨基酸，可治噎膈、痰喘、癰腫；石上柏則有抗癌、清熱、解毒之功效，常用于咽喉腫痛、肺熱咳嗽；法半夏歸肺、胃、脾經(jīng)，有化痰燥濕之功效，可治痰多咳喘、痰飲眩悸、風(fēng)痰眩暈；陳皮歸肺、脾經(jīng)，有理氣燥濕、健脾化痰之功效，主治痰多咳嗽；杏仁歸肺經(jīng)，有降氣平喘止咳之功效；防風(fēng)有驅(qū)風(fēng)、發(fā)汗、祛痰的功效[15-16]。全方兼顧肺脾腎，攻補兼?zhèn)?、寓攻于補，共奏扶正攻邪之功。

有研究表明，腫瘤血管生成是腫瘤細胞生長的重要前提之一，是1 個受多因素影響的復(fù)雜過程，VEGF 是促血管生成物質(zhì)，VEGF/血管內(nèi)皮生長因子受體-2 是腫瘤血管生成的信號傳導(dǎo)途徑中重要的一環(huán)[17]。TSGF 是來源于惡性腫瘤細胞的可溶性肽類物質(zhì)，相關(guān)研究證實，其水平與腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險呈正相關(guān)[18]。TGF-β 在腫瘤微環(huán)境免疫抑制網(wǎng)絡(luò)中處于重要一環(huán)，與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后具有密切關(guān)聯(lián)。腫瘤細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞均可分泌大量TGF-β，TGF-β 可活化微環(huán)境中纖維細胞，激活基質(zhì)上皮細胞和免疫細胞，誘導(dǎo)VEGF 等多種細胞因子表達，改變腫瘤微環(huán)境，加速腫瘤血管形成，促使腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。本研究結(jié)果顯示，研究組治療后血清TSGF、VEGF、TGF-β 水平低于對照組，提示扶正散結(jié)方應(yīng)用于晚期NSCLC 的輔助治療可改善腫瘤微環(huán)境，抑制VEGF/VEGFR-2 信號通路，抑制腫瘤血管生長，可能與扶正散結(jié)方的抗腫瘤、提高免疫功能等因素有關(guān)，具體機制仍需進一步研究論證。

腫瘤標(biāo)志物是癌變過程中由腫瘤細胞產(chǎn)生的活性物質(zhì)，與腫瘤的發(fā)生、進展關(guān)系密切，同時可準(zhǔn)確反映患者病情發(fā)展情況，是評估腫瘤療效、預(yù)后的重要指標(biāo)[20]。miRNA 在肺癌等多種腫瘤中呈異常表達，可對腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生較大影響，檢測腫瘤組織中的miRNA 表達水平不僅有助于早期腫瘤診斷，對腫瘤治療的預(yù)后也具有重要意義。以往多項研究指出，miR-335-5p 在胃癌、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤組織中呈低表達[21-22]。TANG 等[23]研究也指出，miR-335-5p 在NSCLC 中呈低表達，且miR-335-5p 的過低表達可下調(diào)ROCK1 表達，進而對NSCLC 腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制。以上研究均提示miR-335-5p 可能是NSCLC 的抑癌因子，腫瘤的進展與其表達下調(diào)密切相關(guān)，具體機制可能是腫瘤微環(huán)境下由免疫細胞分泌的TGF-β 等細胞因子增加，與腫瘤表面的受體相結(jié)合，進而激活腫瘤細胞內(nèi)下游信號通路，抑制miR-335-5p 的表達[24]。本研究結(jié)果顯示，研究組治療后血清CEA、CA125、CYFRA21-1 水平均低于對照組，miR-335-5p 表達水平高于對照組，提示扶正散結(jié)方應(yīng)用于晚期NSCLC 的輔助治療可有效改善預(yù)后。

綜上所述，扶正散結(jié)方應(yīng)用于晚期NSCLC 的輔助治療可提高近期療效，減少化療毒性反應(yīng)，改善腫瘤微環(huán)境，增強miR-335-5p 表達，提高免疫功能，改善預(yù)后。