正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方益腎利石顆粒的提取工藝

覃新華 陳 娟 李 巖 游 攀 胡傳義

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海 200135；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院泌尿外科，上海 200135

復(fù)方益腎利石湯是上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要用于泌尿系結(jié)石的輔助治療，經(jīng)長(zhǎng)期用藥觀察，復(fù)方益腎利石湯可顯著降低術(shù)后腎損傷、結(jié)石殘留率和并發(fā)癥發(fā)生率[1-3]。全方由金錢(qián)代化草、海金沙、生雞金等藥材組成。本實(shí)驗(yàn)按照現(xiàn)代中藥藥物制劑的需求優(yōu)化提取工藝，使其適合現(xiàn)代生產(chǎn)[4]。采用單因素考察和正交設(shè)計(jì)[5]，以方中有效成分的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)溶劑倍數(shù)、提取時(shí)間及提取次數(shù)進(jìn)行考察，確定最佳提取工藝，為顆粒提取工藝提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105 十萬(wàn)分之一電子天平[（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）]；DK-S26 六孔水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；UV-2102PCS 紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；Agilent1200 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；MWD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技公司）。

1.2 試藥

海金沙、金錢(qián)草、生雞金、石葦、車前子、川斷、杜仲、枳殼、炒蒲黃藥材均購(gòu)于上海萬(wàn)仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司（批號(hào)分別為：200111-1、200103-1、200227-1、200217-1、200211-1、200226-1、200213-1、191218-1、191218-1）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品、蘆丁均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為：39524-08-8、110722-201815、111857-201804、100080）；超純水（廣州屈臣氏飲料食品有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（上海默克化工技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：166579、2019706）。

2 方法與結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版[6]和相關(guān)文獻(xiàn)資料[7-8]，分別制備9 味藥的提取樣品，經(jīng)檢測(cè)，選取總黃酮、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷含量及其轉(zhuǎn)移率作為提取工藝的考察指標(biāo)。

復(fù)方益腎利石顆粒樣品的制備：海金沙30 g、金錢(qián)草30 g、生雞金30 g、石葦15 g、車前子20 g、川斷12 g、杜仲12 g、枳殼15 g、炒蒲黃15 g，加8 倍量水，提取3 次，每次1 h，得提取物，真空干燥、粉粹得浸膏粉。

2.1.1 總黃酮含量測(cè)定 ①溶液的制備，取蘆丁對(duì)照品25 mg 置50 ml 量瓶中，加30%乙醇適量，超聲溶解，放冷，加30%乙醇至刻度，取上述溶液10 ml 置50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得對(duì)照品溶液。取本品1 g（批號(hào)：2020072901）置具塞錐形瓶中，加30%乙醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)。取續(xù)濾液5 ml 置50 ml 量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得供試品溶液。②線性關(guān)系考察[9]，吸取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液制備成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，濃度分別為：0.099、0.198、0.297、0.396、0.495 mg/ml，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制回歸曲線。結(jié)果總黃酮的回歸方程為Y=1.3212X-0.0022（r2=0.9999），表明總黃酮在0.099～0.495 mg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。③精密度試驗(yàn)，取供試品溶液3 ml，于510 nm 波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6 次。結(jié)果吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=0.16%（n=6），提示儀器的精密度良好。④穩(wěn)定性試驗(yàn)，取供試品溶液1 ml 置10 ml 量瓶中，依次在510 nm 波長(zhǎng)下，分別測(cè)定0、0.5、1、1.5、2、3 h 時(shí)間點(diǎn)溶液的吸光度。結(jié)果，總黃酮含量的RSD=0.43%（n=6），提示供試品溶液在3 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。⑤重復(fù)性試驗(yàn)，取同一批號(hào)的樣品6 份（批號(hào)：2020092301），參照①項(xiàng)方式制備供試品溶液。依次在510 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果吸光度的RSD=1.49%（n=6），提示本方法重復(fù)性良好。⑥加樣回收率試驗(yàn)，稱定已知總黃酮含量的同一批號(hào)的供試品溶液6 份（批號(hào)：2020092301），加蘆丁對(duì)照品，參照①項(xiàng)下方式制備供試品溶液。于510 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，總黃酮平均回收率為98.08%（RSD=0.01%，n=6），顯示該方法具有良好的加樣回收率。見(jiàn)表1。

表1 總黃酮含量測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定 色譜條件[10-11]：高效液相儀，Agilent 1200、MWD 檢 測(cè)器、Agilent 1200 工作站；色譜柱，Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相，乙腈-水（20∶80）（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3）；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm。對(duì)照品溶液的制備：取柚皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 ml 含柚皮苷1.0 mg、新橙皮苷0.5 mg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。供試品溶液的制備：取浸膏粉0.2 g 置具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，加熱回流提取1.5 h，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。取續(xù)濾液10 ml 置25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別以對(duì)照品進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線。見(jiàn)表2?？芍鞒煞衷诟髯苑秶鷥?nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。測(cè)定柚皮苷、新橙皮苷峰面積峰RSD 均<3%，顯示儀器的精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液1 份，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為0.16%和0.19%，顯示供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液6 份，精密吸取注入液相色譜儀測(cè)定，得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD 均<2%，顯示該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知柚皮苷、新橙皮苷含量的供試品6 份（批號(hào)：2020092303），分別加入適量對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果測(cè)得柚皮苷的平均加樣回收率為98.33%，RSD 為0.35%，新橙皮苷的平均加樣回收率為99.31%，RSD 為0.17%。見(jiàn)表3～4。

表3 柚皮苷加樣回收率

表4 新橙皮苷加樣回收率

2.2 提取工藝條件的研究

2.2.1 浸泡時(shí)間及藥材吸水率考察 稱取半分處方藥材（共89.5 g），加10 倍量水，浸泡0.5、1、2、3、4、5、6、24 h 后過(guò)濾，稱藥渣重量，測(cè)吸水率[12]。從圖1 可知，藥材浸泡30 min 時(shí)吸水量為1.3 倍，在2 h 后的吸水量趨向于平緩。故從生產(chǎn)的實(shí)際出發(fā)，提取浸泡時(shí)間定為0.5 h。

圖1 吸水率試驗(yàn)

2.2.2 提取次數(shù) 取4 份全處方量藥材，分別加8 倍量水，提取時(shí)間1 h，提取1、2、3、4 次各指標(biāo)有效成分。從圖2 可知，隨提取次數(shù)增加，各指標(biāo)有效成分溶出不斷增加，但提取次數(shù)增加至第4 次，含量增長(zhǎng)速率變緩。參照實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際情況，選擇提取1、2、3 次進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 提取次數(shù)試驗(yàn)

2.2.3 提取時(shí)間 取5 份全處方量藥材，加8 倍量水，分別提取0.5、1、1.5、2、3 h 各指標(biāo)有效成分，提取2 次[13-14]。從圖3 可知，在提取0.5～1 h，三種成分不斷增加，超過(guò)1.5 h 后，含量均呈下降平穩(wěn)趨勢(shì)，故選擇0.5、1.0、1.5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間試驗(yàn)

2.2.4 溶劑倍數(shù) 取4 份全處方量藥材，分別加6、8、10、12 倍量水，提取1 h，提取2 次[15-16]。從圖4 可知，有效成分溶出在4～8 倍加水量，隨水量的增加不斷增加，超過(guò)10 倍水量后，各含量均呈下降趨勢(shì)，故選擇加6、8、10 倍水進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 溶劑倍數(shù)試驗(yàn)

2.2.5 正交試驗(yàn) 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)方益腎利石顆粒的提取工藝，采用三因素三水平設(shè)計(jì)[17-19]，考察空白（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）和溶劑倍數(shù)（D）因素對(duì)各指標(biāo)及得膏率的影響。按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表5～6。本研究應(yīng)用多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化顆粒的提取工藝[20]，利用層次分析法[21]得各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，見(jiàn)表7。綜合評(píng)分=總黃酮總含量得分×0.4452+川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率得分×0.3086+柚皮苷轉(zhuǎn)移率得分×0.1118+新橙皮苷轉(zhuǎn)移率得分×0.1118+干膏得率得分×0.0226。正交設(shè)計(jì)及綜合評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表8～9，通過(guò)綜合評(píng)分的方差分析可知提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞溶劑倍數(shù)＞空白，即B＞C＞D＞A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；通過(guò)綜合評(píng)分的直觀分析可知因素B 中K3＞K2＞K1，提示提取次數(shù)的增加，綜合評(píng)分越高；因素C中K2＞K3＞K1，選擇提取時(shí)間為1 h；因素D 中K3＞K2＞K1，K3 和K2 相差極小，選擇溶劑倍量為8 倍。綜合評(píng)分的最佳組合為B3C2D1，即最佳提取工藝為：8 倍量水，提取3 次，每次1 h。

表5 因素水平設(shè)計(jì)方案

表6 正交試驗(yàn)安排

表7 各成分權(quán)重系數(shù)

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱取處方中9 味藥材，共3 份，按優(yōu)選工藝進(jìn)行提取。結(jié)果浸膏得率均值為22.54%，總黃酮總含量均值為1762.09 mg，川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷轉(zhuǎn)移率均值分別為36.92%、97.71%、78.25%，三批驗(yàn)證樣品的轉(zhuǎn)移率RSD 均＜7.0%，出膏率RSD ＜3.0%，結(jié)果顯示提取工藝穩(wěn)定，可重復(fù)，適用于大生產(chǎn)。

3 討論

本研究充分考慮復(fù)方益腎利石顆粒的安全性、有效性，建立多個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)分法考察提取工藝[22-24]。綜合評(píng)分法是中藥提取工藝多個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)的常用方法，能更好反映復(fù)方中藥的安全性、有效性、整體性及復(fù)雜性[25]。本研究根據(jù)中藥復(fù)方君臣佐使配伍原則，通過(guò)綜合分析予以各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，計(jì)算綜合評(píng)分，避免單一因素對(duì)中藥復(fù)方提取工藝篩選的局限性和片面性，為進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)方益腎利石顆粒提取制備工藝提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表9 綜合評(píng)分方差分析表