劉嘉祺 翟鳳國 高金霞 劉佳維 楊旭東 周福波 李孟全
1.牡丹江醫(yī)學院藥理教研室,黑龍江牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室,黑龍江牡丹江 157011;3.牡丹江醫(yī)學院有機化學教研室,黑龍江牡丹江 157011;4.牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心,黑龍江牡丹江 157011
乳腺癌是導致患者死亡的常見婦科惡性腫瘤[1-2],其發(fā)病機制尚不十分清楚。蛋白磷酸酶1D(protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta,PPM1D)為一種癌基因,在乳腺癌細胞中高表達,發(fā)揮重要作用[3-5]。miR-195 為非編碼RNA 分子[6-7],調控癌癥發(fā)生發(fā)展過程[8-10]。而miR-195 在乳腺癌發(fā)病機制中扮演著什么樣的角色?miR-195 與靶基因的調控作用怎樣?目前相關報道尚少。本實驗觀察人乳腺癌細胞miR-195 和PPM1D 表達,探討miR-195 對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制,旨在為乳腺癌的發(fā)生機制提供新思路。
DMEM 高糖培養(yǎng)基(貨號:11995);胎牛血清(貨號:SV30087);胰蛋白酶消化液(貨號:C0201);蛋白酶抑制劑(貨號:P1005);細胞裂解液(貨號:P0013);中國上海碧云天生物公司;SYBR qPCR Mix,RtqPCR Kit(貨號:FSQ-101);日本東洋紡(上海)生物科技有限公司;X-treme GENE siRNA(貨號:04476093 001),瑞士羅氏公司;DAPI 染色液(貨號:E-IR-R103),中國武漢博士德生物工程有限公司;TUNEL 試劑盒(貨號:11684817910),瑞士羅氏公司。
正常乳腺上皮細胞MCF-10A 和人乳腺癌細胞MCF-7 復蘇,細胞沉淀中加入細胞培養(yǎng)液,轉移至培養(yǎng)瓶,37℃,5% CO2孵箱培養(yǎng)。待細胞生長至70%~80%,適量胰蛋白酶消化細胞,補足培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
MCF-7 瞬時轉染,實驗MCF-7 組;miR-195 mimics組(MCF-7 轉染miR-195 擬似物);miR-195 inhabitor組(MCF-7 轉染miR-195 抑制劑);陰性對照NC 組(MCF-7 轉染無關陰性對照序列negative control,NC)。轉染過程避光進行,36 h 后進行后續(xù)實驗。
將各實驗組細胞接種于96 孔板中,各實驗組設5 個復孔。MTT 溶液(20 μl/孔)培養(yǎng)箱中孵育4 h。隨后加150 μl 二甲基亞砜,室溫搖床振蕩10 min。490 nm 波長下檢測各孔吸光度值。
培養(yǎng)細胞,將滅菌后的玻片鋪于24 孔板中,每孔加入500 μl 細胞懸液。孵育48 h 后處理細胞,參照TUNEL 檢測試劑盒檢測細胞凋亡。
轉染的細胞用刮刀刮下,2500 r/min,4℃離心10 min。棄上清,每份樣品加入RIPA 和蛋白酶抑制劑,冰上超聲破碎。經10%丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉,室溫搖床2~3 h,孵育一抗PPM1D 和β-actin,4℃孵育過夜。洗膜,室溫孵育熒光二抗,再洗膜。總蛋白以β-actin 作內參,紅外熒光掃描系統(tǒng)檢測,odyssey 軟件進行光密度積分值分析。
qRT-PCR 包括總RNA 提取,逆轉錄和實時熒光定量PCR 三部分。逆轉錄反應體系:5×RT buffer 2 μl,RT Enzyme mix 0.5 μl,Primer mix 0.5 μl,Random 引物1 μl,總RNA 0.5 μg,Nuclease-Free Water 將反應體系補至10 μl。PCR反應體系:SYBR 混合體系10 μl,正向引物1 μl,反向引物1 μl,cDNA 1 μl,Nuclease-Free Water 7 μl 補足至20 μl。PCR 擴增條件:95℃預變性5 min,95℃變性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,U6 為內參,ABI Prism?7500 fast 儀器設置40 個循環(huán)。miR-195-5p 正向引物5’-GCGCGTAGCAGCACAGAAA-3’,反向引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’;U6 正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,反向引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。
將HEK293 細胞接種于96 孔板,24 h 后轉染miR-195 mimics 或陰性對照NC 及含miR-195 結合PPM1D 3’UTR 序列或突變序列的質粒,48 h 后通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定熒光素酶活性。
應用GraphPad Prism 6.0 軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析,計量資料采用均數±標準差()表示,組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
qRT-PCR 結果,MCF-7 組miR-195 表達低于MCF-10A 組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖1。
WB 結果,MCF-7 組PPM1D 蛋白表達高于MCF-10A 組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖2。
MTT 結果,miR-195 mimics 組細胞活力明顯低于MCF-7 組,miR-195 inhabitor 組細胞活力高于MCF-7 組,差異有高度統(tǒng)計學意義(P <0.01)。見圖3。TUNEL 結果,miR-195 mimics 組細胞凋亡率明顯高于MCF-7 組,差異有高度統(tǒng)計學意義(P <0.01);miR-195 inhabitor 組細胞凋亡率低于MCF-7 組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖4~5。
圖4 TUNEL 染色圖像顯示綠色為凋亡細胞,為DAPI 染色細胞核(40×)(n=3)
圖5 TUNEL 結果(n=3)
通過TargetScan 等miRNA 靶基因預測網站,預測miR-195 可能調控的靶基因。Has-miR-195-5p 的5’端有能夠與PPM1D mRNA 3’非翻譯區(qū)(untranslated area,UTR)互補區(qū)域,提示miR-195 可能在轉錄后水平靶向調控PPM1D 基因表達。見圖6。
圖6 預測miR-195 與PPM1D 3’UTR 之間結合位點
攜帶含有PPM1D 基因片段miR-195 mimics 組熒光素酶的活性低于MCF-7 組,差異有高度統(tǒng)計學意義(P <0.01);攜帶含有突變PPM1D 基因片段miR-195 mimics 組與MCF-7 組熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。見圖7。
圖7 miR-195 對PPM1D mRNA 3’UTR 調控作用(n=3)
微RNA 與多種癌癥發(fā)病機制密切相關[11-13],其中miR-195 在癌細胞中表達異常[14-19],扮演著關鍵角色。PPM1D 為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶,是一種重要的腫瘤蛋白[20-23],對許多重要的腫瘤抑制途徑具有負調控作用[24-25]。在本實驗中,MCF-7 組miR-195 表達低于MCF-10A 組,而PPM1D 蛋白表達高于MCF-10A 組。MCF-7 轉染miR-195 mimics 后,細胞活力明顯降低,細胞凋亡率顯著增高;轉染miR-195 inhabitor 后,細胞活力明顯增高,細胞凋亡率降低。提示miR-195 對細胞的增殖和凋亡有一定程度影響。本文進一步探究miR-195 對人乳腺癌細胞增殖和凋亡作用機制。通過查詢,PPM1D mRNA 的3’端有miR-195 可結合的序列。雙熒光素酶報告基因實驗顯示,PPM1D 是miR-195 直接作用的靶點。
綜上,MCF-7 中miR-195 與PPM1D 呈負相關,miR-195 可能通過直接靶向PPM1D mRNA 的3’-UTR,調控乳腺癌細胞的增殖與凋亡,這也是其調控機制的一部分,對于乳腺癌發(fā)病過程中所涉及miR-195正向作用或PPM1D 反向作用機制,還有待于進一步研究。