基于LASSO 的多重線性回歸在預測血管性癡呆大鼠學習記憶能力中的應用

王一帆 許 慧 雷貴月 黃 歆 田寅魁 孟娜娜 朱坤杰

齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江齊齊哈爾 161000

血管性癡呆（vascular dementia，VD）根據(jù)病因分類，包括隱匿性、缺血性、出血性、腦血管病合并阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）等，具有病因復雜、異質(zhì)性強等特點[1]。我國60 歲及以上AD 患病率約為3.99%，其中VD 患病率約為0.85%，僅次于AD[2]，一旦測出基本上是隱匿性VD 晚期，對家庭和社會都會造成巨大負擔。臨床上主要使用簡易精神狀態(tài)檢查（mini-mental state examination，MMSE）和臨床特征進行診斷。MMSE 主要是用于檢測AD，而AD 和VD 在神經(jīng)精神特征上存在很大重疊[3-4]，所以對VD 的檢測準確率不高，故尋找一個簡便易于操作的方法尤為重要。本研究以Morris 水迷宮潛伏期指標為標準，結(jié)合癡呆程度相關(guān)的血液生化特征性指標，構(gòu)建早期預測VD 的數(shù)學模型，旨在為實驗性VD 動物模型的早期診斷及干預提供參考。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

1.1.1 主要儀器與試劑

Morris 水迷宮系統(tǒng)（上海移數(shù)信息科技有限公司）；移液槍（德國Eppendorf 公司）；真空采血管（瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）；5%水合氯醛（廣州沛瑜生物科技有限公司）；75%乙醇（廣州沛瑜生物科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物

SD 大鼠40 只，鼠齡3～5 個月，雄性，體重（175±25）g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[SCXK（遼）2015-0001]。飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學院動物實驗室[SYXK（黑）2016-001]。飼養(yǎng)期間自由飲水，飼喂普通維持飼料（沈陽茂華生物科技有限公司）。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，溫度控制在22～25℃。所有操作均符合實驗倫理學要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠VD 模型分組與復制

將40 只大鼠通過隨機數(shù)字表法分為模型組、假手術(shù)組，每組20 只。采用黃文革等[5]改良的方法復制VD 模型。采用隨機數(shù)字表法每組各選5 只，用作預測模型驗證，其余各15 只用作預測模型建立。

1.2.2 學習記憶能力指標檢測

大鼠造模12 周后參考周嬌嬌等[6]Morris 水迷宮動物學習記憶水平的檢測方法，觀察其行為學差別，通過潛伏期反映大鼠學習記憶能力[7]。當兩組潛伏期比較差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05），提示造模成功[8-9]。

1.2.3 血液生化指標檢測

在動物行為學實驗后，采用腹主動脈采血法對兩組大鼠進行血液采集。用5%水合氯醛（0.35 ml/100 g）對大鼠進行腹腔麻醉后，仰臥位固定，在腹正中線位置“V”字型剪開腹部皮膚，暴露內(nèi)臟，腹壁脊柱兩側(cè)找尋腹主動脈。用真空采血管收集4 ml 血液，采集結(jié)束后立即前往齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院送檢，檢測得到大鼠42 項血液生化指標。

1.2.4 數(shù)學模型建立

1.2.4.1 預測模型初建立及多重共線性檢測 以大鼠血生化指標為解釋變量，潛伏期為因變量，建立多重線性回歸模型并進行多重共線性檢驗[10]。

假設有n 個自變量，那么本研究的模型為：

其中hθ（x）為潛伏期，xn為各血生化指標，θ0為常數(shù)，θn為各自變量系數(shù)。

將第m 個自變量作為因變量，對剩下的n-1 個自變量回歸得到擬合優(yōu)度R21-n/m，那么第m 個自變量的方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）為：

當VIFm的值越大時，說明第m 個自變量和其他變量的相關(guān)性越大。本研究定義回歸模型的VIF 值為：

當VIF>10 時，即回歸方程存在多重共線性。

1.2.4.2 LASSO 回歸 為避免在變量過多時采用普通最小二乘估計帶來的過擬合和多重共線性問題，本研究將進行LASSO 回歸，識別出模型中不重要的變量，將其回歸系數(shù)壓縮為0，達到使模型簡化及變得可估計的目的。

LASSO 的損失函數(shù)J（θ）為：

1.2.4.3 多重線性回歸模型建立 將LASSO 回歸篩選后的指標進行最終多重線性回歸，得出大鼠預測模型。

1.2.4.4 多重線性回歸模型檢驗 將驗證預測模型的10 只大鼠，采取上述實驗步驟得到相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，代入預測模型，得出潛伏期，與實際潛伏期進行誤差分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 及MATLAB 2020 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，計量資料不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示。計數(shù)資料采用例數(shù)表示。多重線性回歸分析，以VIF>10 作為指標篩選先決條件。通過LASSO 回歸對血生化指標進行篩選。將顯著變量納入多重線性回歸并構(gòu)建預測模型。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮學習記憶能力檢測

模型組潛伏期（24.415±4.528）s 長于假手術(shù)組潛伏期（18.977±4.593）s，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.265，P=0.003）。

2.2 血液生化指標檢測

通過血生化檢測，本研究得到了42 項血液生化指標，具體詳見表1。

表1 兩組大鼠血液生化指標數(shù)據(jù)結(jié)果[n=15，M（P25，P75）]

2.3 VD 大鼠血液生化特征性指標與潛伏期間數(shù)學模型的建立

2.3.1 預測模型初建立及多重共線性檢測

將上述42 項指標數(shù)據(jù)進行回歸，計算VIF，存在26 項VIF>10 的指標。見表2。

表2 共線性診斷

2.3.2 LASSO 回歸

采用LASSO 回歸對數(shù)據(jù)進行篩選，得到交叉驗證的LASSO 擬合MSE（圖1）及LASSO 擬合系數(shù)軌跡圖（圖2）。根據(jù)圖1 最低點確定懲罰值為38.4406，即此時損失函數(shù)取得最小值，對應的即為最優(yōu)lambda值。根據(jù)圖2 可得到與最優(yōu)lambda 值相交的變量即為模型最終所納入的變量為總蛋白（total protein，TP）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、載脂蛋白A（apolipoprotein A，apo-A）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、CO2、膽堿酯酶（cholines-terase，CHE）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）。

圖1 LASSO 回歸擬合MSE

圖2 擬合系數(shù)軌跡圖

2.3.3 多重線性回歸模型建立

依據(jù)LASSO 回歸篩選出的10 項血液生化指標，與能反映大鼠癡呆程度的潛伏期進行回歸分析，構(gòu)建VD 大鼠的多重線性回歸預測模型。

其中各指標VIF 值均<10，模型相關(guān)系數(shù)R=0.852，擬合優(yōu)度R2=0.725，回歸模型統(tǒng)計量值F=5.016，顯著性P=0.001。

2.3.4 多重線性回歸預測模型結(jié)果評價

將上述根據(jù)隨機數(shù)字表法選取的5 只模型組（1～5）和5 只假手術(shù)組（6～10）的大鼠進行預測模型分析，計算誤差率，結(jié)果均＜5%。見表3。

表3 多重線性回歸預測模型判別及實際潛伏期結(jié)果

3 討論

VD 是指由腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征[12]。雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎可致海馬區(qū)供血不足，表現(xiàn)為學習記憶和曠場分析能力顯著下降[13]。通過Morris 水迷宮檢測大鼠學習記憶能力，目前采用最多的指標是潛伏期[14-16]。本研究中模型組潛伏期長于對照組，與王緒平等[17]研究一致。

目前VD 中醫(yī)診斷不夠全面，西醫(yī)主要通過規(guī)避致病危險因素來預防VD 發(fā)生，尚沒有明確關(guān)于VD的預防藥物[18]。若建立數(shù)學預測模型，進行VD 早期診斷和干預，對其防治具有重要意義。本研究通過LASSO回歸將不顯著變量系數(shù)縮減為零，保留顯著變量，減少多重共線性的影響，篩選VD 大鼠血液生化指標作為預測因子，發(fā)現(xiàn)TP、TBA、TBil、TC、apo-A、HDL-C、TG、CO2、CHE、IgM 均與VD 大鼠學習記憶能力密切相關(guān)，這與既往報道相符。劉晶靚[19]研究表明低頻電刺激術(shù)治療腦卒中患者，血清中與學習記憶能力呈正相關(guān)的TP 顯著升高。華鍵等[20]研究表明HDL-C 水平的升高可防止腦血管疾病病情加重。劉戀等[21]研究表明血漿TC 水平下降使腦血管淀粉樣蛋白積累，加劇認知損傷。張麗等[22]研究表明老年缺血性腦卒中患者血清TBil 明顯低于參照組。此外，血清TG 的升高與老年心血管疾病病情加重密切相關(guān)[23-24]。侍洪斌[25]研究顯示血清IgM 與TG 呈正相關(guān)，因此推測TG、IgM可作為診斷早期VD 的血清學指標。Zou 等[26]研究發(fā)現(xiàn)癡呆患者血漿中CHE 活性顯著降低，其學習記憶能力下降。這些都提示上述指標對VD 的早期診斷有指導意義。本研究依據(jù)LASSO 回歸篩選出的10 項血液生化指標與潛伏期進行回歸分析，構(gòu)建VD 大鼠預測模型。模型擬合優(yōu)度較高，提示上述血液生化檢測指標與學習記憶水平檢測指標高度擬合，誤差率＜5%提示該模型具有良好的預測效能。

綜上，本研究所建立的VD 預測模型，既可判斷VD 動物模型復制成功與否，又因檢測方便快捷，可用臨床患者癡呆風險評分代替潛伏期，構(gòu)建其與特征性血液生化指標之間的數(shù)學模型，有望為臨床VD 患者早期預測及干預提供參考。本研究在正式開展前已進行預實驗，對實驗結(jié)果進行了預判，同時正式實驗初期對大鼠進行了初篩，本研究模型預測出的潛伏期與實際潛伏期存在一致性。因此本研究在未來將開展更大的樣本實驗，專注于臨床VD 患者血液生化指標的檢測及其疾病進展的研究。