激活蛋白-1對機械通氣性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應、細胞凋亡和MMP-9/TIMP-1平衡的影響

趙利芳，楊建功，文先杰，王培山，孟瑞霞，王開娟，代 秀

1)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院)麻醉與圍術期醫(yī)學科 河南新鄉(xiāng) 453000 2)佛山市第二人民醫(yī)院麻醉科 廣東佛山 528099

機械通氣已成為救治各類危重癥呼吸困難患者的主要手段，在改善通氣困難的同時，也可能誘導或者加重肺損傷，即機械通氣性肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)，如何預防或者減輕VILI已成為臨床研究的重點。研究[1]發(fā)現(xiàn)，氣道和肺組織炎癥反應紊亂是VILI發(fā)生和發(fā)展的重要病理機制。激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)作為細胞內(nèi)一類重要的轉錄激活因子,通過與靶基因結合并調(diào)控靶基因的功能表達，對體內(nèi)外多種刺激(如細胞因子、機械壓力、細菌和病毒感染等)做出反應，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程。研究[2]發(fā)現(xiàn)，香葉基二磷酸合酶1基因敲除可以通過調(diào)節(jié)Toll樣受體2/AP-1信號通路改善VILI。此外，細胞外基質(zhì)成分改變和細胞膜通透性增加也是VILI重要的病理改變，多種酶原的激活在降解細胞膜結構、增強炎癥反應、重塑氣道結構和功能等方面發(fā)揮重要作用[3]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一類研究較深入的蛋白水解酶，主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白和明膠，在維持細胞局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[4]。我們推測AP-1和MMP-9可能參與了VILI的發(fā)生過程，并且存在內(nèi)在聯(lián)系,因此本研究探討了AP-1對VILI小鼠炎癥反應、細胞凋亡和MMP-9/組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)平衡的影響機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2～3個月齡健康昆明小鼠30只，雌雄不限，體重27～33 g，購自上海實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(滬)2019-1563。分籠飼養(yǎng)，溫度(23.5±1.5) ℃，相對濕度(35±3)%，晝夜各12 h，自由進食和飲水，適應環(huán)境1周后進行后續(xù)實驗。所有操作均符合動物倫理學要求。

1.2 動物分組與處理采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為假手術組、模型組和干預組3組，每組10只。實驗前小鼠禁食12 h，自由飲水。3組小鼠均腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉2 mL/kg麻醉，順利完成氣管插管，股靜脈建立液體通道，10 mL/(kg·h)滴注生理鹽水至實驗結束。假手術組行氣管切開保留自主呼吸；模型組和干預組連接動物專用呼吸機(北京六一生物科技有限公司)行機械通氣6 h，設置呼吸潮氣量為40 mL/kg，吸呼比1∶2，頻率70次/min，吸入氧體積分數(shù)21%；干預組連接呼吸機后立即腹腔注射AP-1單克隆抗體(20 μg，江蘇碧云天科技有限公司)，假手術組與模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3 檢測指標

1.3.1血漿白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腹主動脈血血氧分壓(PaO2)的檢測 ①通氣6 h后采用股動脈放血法處死小鼠，肝素抗凝采集動脈血，3 000 r/min離心5 min取上清血漿，-80 ℃保存集中送檢。ELISA法檢測血漿IL-6和TNF-α水平，試劑購自美國Sigma公司，根據(jù)說明書操作。②處死前用血氣針穿刺腹主動脈取抗凝血1 mL，采用動物專用血氣分析儀檢測PaO2。

1.3.2肺濕干重比值(W/D)、肺損傷評分及細胞凋亡指數(shù)測定 ①處死小鼠后迅速取右肺上葉，分別測量濕重和干重，計算W/D。②取右肺中葉置于40 g/L多聚甲醛PBS溶液中固定48 h，制備石蠟切片，厚度約4 μm，進行HE染色。在100倍光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學改變；進行肺損傷評分，從肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細胞浸潤和肺泡內(nèi)充血4個方面進行半定量評分，每項賦值0～4分，總分16分，分值越高表示損傷越嚴重。③取右肺下葉肺組織，根據(jù)TUNEL細胞凋亡試劑盒(美國Sigma公司)說明操作。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核呈黃色至棕色。在400倍視野下挑選5個完整不重疊的肺泡區(qū)域計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，細胞凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3.3肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白表達的測定 采用Western blot法檢測，所用試劑均購自美國Sigma公司。取左肺組織依次加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑后充分勻漿，2 000 r/min離心10 min,采用蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度和純度。取50 μg蛋白樣本和等量標本進行上樣、SDS-PAGE電泳，然后帶電轉移至PVDF膜。加入兔抗鼠AP-1、MMP-9、TIMP-1和GAPDH抗體(稀釋度為1∶1 000)過夜孵育，洗滌后加入羊抗兔抗體(稀釋度為1∶500)室溫下?lián)u床孵育1 h，ECL顯色。使用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理。3組間所有指標的比較均采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組血漿IL-6和TNF-α水平的比較見表1。與假手術組比較，模型組和干預組血漿IL-6和TNF-α水平升高；與模型組比較，干預組血漿IL-6和TNF-α水平下降。

表1 3組血漿IL-6和TNF-α水平的比較 ng/L

2.2 3組小鼠肺組織病理學改變、腹主動脈血PaO2、肺W/D、肺損傷評分和凋亡指數(shù)的比較肺組織HE染色結果見圖1。假手術組未見明顯肺損傷，肺泡間隔結構正常，僅有少量炎性細胞浸潤；模型組可見肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)滲出水腫，肺間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔內(nèi)有血性滲出物，肺泡結構紊亂；干預組較模型組肺泡結構破壞減輕，肺泡間隔稍增寬，炎性細胞浸潤減少。

與假手術組比較，模型組和干預組腹主動脈血PaO2降低，肺W/D、肺損傷評分、肺組織中細胞凋亡指數(shù)升高；與模型組比較，干預組腹主動脈血PaO2升高，肺W/D、肺損傷評分、肺組織中細胞凋亡指數(shù)降低。見圖2、表2。

A：假手術組；B：模型組；C：干預組

A：假手術組；B：模型組；C：干預組

表2 3組小鼠腹主動脈血PaO2、肺W/D、肺損傷評分、細胞凋亡指數(shù)的比較

1 mmHg=0.133 kPa;*：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

2.3 3組小鼠肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白相對表達量的比較見圖3和表3。與假手術組比較，模型組和干預組AP-1和MMP-9相對表達量增加，TIMP-1相對表達量降低；與模型組比較，干預組AP-1和MMP-9相對表達量降低，TIMP-1相對表達量增加。

圖3 3組小鼠肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白的表達

表3 3組小鼠肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白相對表達量的比較

3 討論

本研究復制了VILI小鼠模型，HE染色發(fā)現(xiàn)模型小鼠肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)滲出水腫，肺間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔內(nèi)血性滲出物，肺泡結構紊亂，與人體VILI病理改變[5]基本一致。VILI的發(fā)生機制較為復雜，可能與通氣刺激、氣道高反應、氧化應激、炎癥和免疫反應等密切相關[6]。但是，目前仍然無法確定VILI的有效干預靶點。既往研究[7]發(fā)現(xiàn)，機械通氣作為應激源誘導氣道和肺組織產(chǎn)生多種炎癥因子和細胞黏附分子，進而損傷肺泡和間質(zhì)，導致VILI。AP-1作為機體對應激反應較靈敏的效應分子，在各種急性肺損傷包括VILI中可大量表達，進而發(fā)揮生物學功能[8]。

循環(huán)動脈血和靜脈血是臨床最易獲得的樣本，檢測動脈血炎癥因子表達更易在臨床中推廣應用。有研究[9]認為，肺泡灌洗液中炎癥因子表達意義更大，肺泡灌洗液中炎癥因子水平與循環(huán)動脈血濃度也有較好的一致性。IL-6和TNF-α是主要的促炎因子，是誘發(fā)瀑布樣炎癥反應紊亂的核心分子，能夠招募更多的炎癥細胞如白細胞、中性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞向病變部位聚集，釋放更多的炎癥因子(如IL-1β、IL-8)和細胞因子(如血管內(nèi)皮細胞黏附分子)，不斷向肺泡和間質(zhì)浸潤，加重肺水腫和肺出血[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預組血漿IL-6和TNF-α水平較模型組明顯下降。干預組腹主動脈血PaO2比模型組明顯升高，肺W/D降低，肺組織病理學改變減輕，肺損傷評分降低。VILI以嚴重缺氧和通氣改善不佳為主要臨床表現(xiàn)，嚴重者可導致急性呼吸窘迫綜合征和呼吸衰竭[12]。檢測動脈血PaO2是臨床診斷VILI的重要依據(jù)。肺W/D增加提示肺組織水腫、滲出、出血嚴重，繼而發(fā)生纖維化，導致肺功能障礙[13]。

細胞凋亡是VILI發(fā)生和發(fā)展的重要病理改變，研究[14]表明，α1-抗胰蛋白酶能夠通過抑制炎癥反應和細胞凋亡來改善小鼠VILI。黃天豐等[15]研究發(fā)現(xiàn)，VILI的發(fā)生與IL-17A加重炎癥反應和誘導細胞凋亡有關。AP-1主要由原癌基因jun和fos編碼的蛋白組成，是調(diào)節(jié)細胞生存和死亡途徑的關鍵轉錄因子，作為基因轉錄的分子開關對細胞內(nèi)外多種應激源做出反應，調(diào)節(jié)效應基因的表達[16]；作為細胞內(nèi)多條信號通路的交會點，調(diào)節(jié)細胞因子、生長因子、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶等活性，參與多種細胞生物學行為，如增殖、炎癥、分化、凋亡、轉化等，影響多種生理病理過程[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，AP-1調(diào)節(jié)細胞凋亡具有雙重作用,在不同細胞中可促進或抑制細胞凋亡。AP-1活性受到細胞內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，如絲裂原活化蛋白激酶和PI3K/AKT通路[19]。AP-1在VILI發(fā)生中的具體作用還尚未得到統(tǒng)一認識。本研究發(fā)現(xiàn)，干預組肺組織中細胞凋亡指數(shù)比模型組降低，AP-1和MMP-9表達減少，TIMP-1表達增加。MMP-9/TIMP-1可能是AP-1的一個重要下游靶點；抑制AP-1活性，可以降低MMP-9表達，上調(diào)TIMP-1表達。MMP-9與TIMP-1通常處于動態(tài)平衡中，協(xié)同維持細胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，當MMP-9活性增強，TIMP-1活性受到抑制，氣道和肺間質(zhì)中Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白和明膠成分被降解，細胞通透性增加，細胞基質(zhì)沉積，肺泡結構破壞，功能障礙[20-21]。

綜上所述，AP-1單克隆抗體外源性作用于AP-1配體，能夠高效降低VILI小鼠肺組織來源的AP-1表達，繼而發(fā)揮減輕機械通氣刺激誘導的炎癥反應，減輕缺氧和肺損傷，抑制肺組織細胞凋亡，調(diào)整MMP-9/TIMP-1平衡；外源性干預AP-1可改善VILI程度，有望提供臨床干預新靶點。當然，除了肺組織外，其他臟器組織也可能存在AP-1配體，如何更加針對性篩選肺組織來源的AP-1配體，尋找高效的抗體作用靶點，是下一步研究的重點。