苦參素通過MAPK信號通路對EAE小鼠巨噬細胞M1/M2極化的影響

趙曉玉，朱 琳，史香芬，劉 楠，楚堯娟，張 婉，張英杰，杜書章

鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部 鄭州 450052

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性自身免疫炎性疾病，主要以髓鞘脫失、進行性神經(jīng)功能紊亂為特征。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠模型是目前研究MS的理想模型，其發(fā)病過程、病理表現(xiàn)與MS基本一致[1]。目前，激素沖擊、免疫抑制等方法對MS具有明確療效，但因骨質(zhì)疏松、癲癇等不良反應而限制了臨床應用[2]。因此，尋找安全有效的MS治療藥物成為研究重點。既往研究[3]發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞的激活及極化在EAE進展過程中發(fā)揮重要作用，脊髓、脾臟等靶器官中促炎分子隨M1型巨噬細胞的增多而增多，抗炎分子隨M2型巨噬細胞增多而增多，提示尋找調(diào)控巨噬細胞的激活及活化的藥物，有望成為EAE治療的關鍵?？鄥⑺厥菑亩箍浦参镏刑崛〉囊环N活性生物堿，具有確切的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[4]，推測其對EAE可能有效。本研究觀察了苦參素對EAE小鼠脊髓組織巨噬細胞激活及M1/M2極化的影響，并探討其對p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信號通路的影響，為臨床MS的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白33-35(MOG33-35，上海萬生昊天生物技術有限公司)，完全弗氏佐劑(CFA，美國Sigma公司)，減毒百日咳毒素(北京博蕾德科技發(fā)展有限公司)，苦參素注射液[江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號150422304，規(guī)格2 mL∶0.6 g(以氧化苦參堿計)]，醋酸潑尼松(PA)片(浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33021207，規(guī)格5 mg)，p38MAPK特異性激動劑茴香霉素(Anisomycin，美國Sigma公司)，大鼠抗小鼠CD11b、兔抗小鼠CD86、兔抗小鼠CD206抗體(武漢益普生物科技有限公司)，兔抗小鼠p38MAPK、兔抗小鼠磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)及辣根過氧化物酶標記的IgG(美國Abcam公司)，F(xiàn)ITC或CY3標記的IgG(美國Jackson公司)。DAPI顯色試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，Trizol試劑盒(日本TaKaRa公司)，qRT-PCR試劑盒、脊髓髓鞘染色LFB溶液(北京全式金生物技術有限公司)。ERM3100石蠟切片機(上海京工實業(yè)有限公司)，Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)，CheniDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物分組、造模及給藥50只SPF級雌性C57BL/6小鼠，6周齡，體重18～22 g，購自河南省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2017-0001，飼養(yǎng)于鄭州大學藥物研究院[使用許可證號SYXK(豫)2018-0004]，動物實驗操作符合3R原則。將50只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組：對照組、EAE組、PA組、苦參素組、激動劑組，各10只，除對照組外，其余各組采用MOG33-35誘導法建立EAE模型：3 g/L的MOG33-35(凍干粉融于生理鹽水)與等體積CFA混勻，制備抗原乳劑。小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，于脊柱中線兩側，分4點皮下注射總量200 μL的抗原乳劑，注射當日及48 h后分別腹腔注射200 ng減毒百日咳毒素進行免疫增強。第26天神經(jīng)功能評分>0.5分則為發(fā)病，建模成功。取建模成功小鼠(EAE組10只、苦參素組10只、PA組9只、激動劑組9只)用于后續(xù)實驗。于發(fā)病日開始干預，苦參素組腹腔注射200 mg/kg苦參素注射液，EAE組和對照組腹腔注射10 mL/kg生理鹽水，激動劑組腹腔注射200 mg/kg苦參素注射液+2 mg/kg Anisomycin，PA組灌胃6 mg/kg的PA溶液(溶解于5 mg/L羧甲基纖維素鈉溶液)，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.3 神經(jīng)功能評分各組小鼠均于干預后第0、1、3、5、7、9、11、13天進行神經(jīng)功能評估，采用國際通用5分制評分：無臨床癥狀為0分；尾部無張力，輕度步態(tài)笨拙為1分；一側后肢無力，反正反射正常為2分；雙側后肢無力，翻正反射異常，但刺激后尚可移動為3分；四肢癱瘓為4分；瀕死或死亡為5分。

1.4 組織取材神經(jīng)功能評估結束后，每組取4只，腹腔注射水合氯醛麻醉，心臟灌注40 mg/L多聚甲醛，立即取出脊髓腰段組織放入40 mg/L多聚甲醛中固定，用于HE、LFB和免疫熒光染色；每組從剩余鼠中取4只小鼠麻醉后，心臟灌注1×PBS，取脊髓腰段組織立即放置于-80 ℃，用于qRT-PCR和Western blot檢測。

1.5 脊髓組織炎性細胞浸潤評分及髓鞘脫失評分取已固定的脊髓標本，常規(guī)脫水、透明及石蠟包埋，制成厚度為5 μm的連續(xù)切片。①每只小鼠取5張切片，經(jīng)脫蠟、水化后，行常規(guī)HE染色，最后中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察拍照。炎性細胞浸潤評分[5]：少量分散的炎性細胞分布為1分；血管四周呈現(xiàn)炎性細胞浸潤為2分；灰質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)不完全炎性細胞浸潤或血管“袖套樣”浸潤為3分。②每只小鼠取5張脊髓組織切片，常規(guī)脫蠟、乙醇醇化，浸入LFB染液中，58 ℃孵育24 h，冷卻至室溫，體積分數(shù)95%乙醇洗滌5 min，蒸餾水洗滌2 min， 0.5 mg/L碳酸鋰10 s，體積分數(shù)70%乙醇分化至灰質(zhì)白質(zhì)清晰可辨，蒸餾水洗滌5 min，脫水、透明后，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察拍照。髓鞘脫失評分[5]：無髓鞘脫失為0分；1～3個小范圍髓鞘脫失為1分；1～2個大范圍髓鞘脫失為2分；大范圍髓鞘脫失且累及20%白質(zhì)區(qū)域為3分。

1.6 脊髓組織中M1型、M2型巨噬細胞免疫熒光染色每只小鼠取5張脊髓組織切片，常規(guī)脫蠟、抗原修復，PBS洗滌5 min×3次，體積分數(shù)3% H2O2孵育15 min，再次洗滌，每張切片滴加山羊血清50 μL，常溫封閉20 min，甩干血清勿洗，滴加50 μL大鼠抗小鼠CD11b、兔抗小鼠CD86、兔抗小鼠CD206(均1∶200稀釋)，4 ℃過夜，PBS洗滌5 min×3次，滴加50 μL FITC或CY3標記的IgG(1∶200稀釋)，37 ℃孵育2 h，再次洗滌，加入抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下拍照。免疫熒光雙染：滴加一抗染色后立即加入二抗染色，其余步驟同前，DAPI復染1 min后洗滌，抗熒光猝滅劑封片。M1型巨噬細胞CD11b+CD86+、M2型巨噬細胞CD11b+CD206+。于200倍鏡下選取3個不重復視野，熒光顯微鏡下拍照，用ImagePro Plus 6.0軟件識別M1或M2型巨噬細胞，計算M1或M2型巨噬細胞比例，即Merge黃綠色占DAPI藍染細胞百分比。

1.7 脊髓組織中M1相關iNOS、TNF-α及M2相關精氨酸酶-1(Arg-1)、IL-10 mRNA的檢測取-80 ℃保存的脊髓組織，按照Trizol試劑盒說明書步驟提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，以cDNA為模板進行PCR，反應體系為：SYBR Premix Ex Taq 6.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4.1 μL，總反應體系為12 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；擴增42個循環(huán)(94 ℃變性20 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 mRNA的相對表達量。引物序列見表1，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 引物序列

1.8 脊髓組織中p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的檢測取-80 ℃保存的脊髓組織，加入液氮研磨，4 ℃預冷細胞裂解液裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清，測定總蛋白含量。取60 μg待測蛋白與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，再次離心，取上清，行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗小鼠p38MAPK、p-p38MAPK(均1∶500稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜，加入1∶2 000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記的IgG)，常溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液于暗室中曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析。應用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較干預后除對照組外其他各組神經(jīng)功能評分；應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組小鼠脊髓炎性細胞浸潤評分、髓鞘脫失評分，M1型、M2型巨噬細胞比例，iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 mRNA及p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的相對表達量。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能評分的比較結果見圖1。對照組干預期間神經(jīng)功能評分均為0分。EAE組、PA組、苦參素組及激動劑組干預后神經(jīng)功能評分先升高后降低，第9天達到峰值；PA組、苦參素組及激動劑組神經(jīng)功能評分均低于EAE組，且PA組<苦參素組<激動劑組(F組間=29.271，F(xiàn)時間=62.190，F(xiàn)交互=44.386，P均<0.001)。

圖1 各組小鼠干預后神經(jīng)功能評分的比較

2.2 各組小鼠脊髓組織炎性細胞浸潤評分及髓鞘脫失評分的比較結果見圖2和表2。對照組脊髓組織炎性細胞浸潤評分及髓鞘脫失評分均為0分。PA組、苦參素組及激動劑組脊髓組織炎性細胞浸潤評分及髓鞘脫失評分均低于EAE組，且PA組<苦參素組<激動劑組。

A：對照組；B：EAE組；C：PA組；D：苦參素組；E：激動劑組；1：HE染色；2：LFB染色

表2 各組小鼠脊髓組織炎性細胞浸潤評分及髓鞘脫失評分的比較

2.3 各組小鼠脊髓組織M1型、M2型巨噬細胞比例的比較結果見圖3和表3。與對照組比較，EAE組、PA組、苦參素組及激動劑組脊髓組織M1型、M2型巨噬細胞比例均升高。PA組、苦參素組及激動劑組M1型巨噬細胞比例均低于EAE組，且PA組<苦參素組<激動劑組；PA組、苦參素組及激動劑組M2型巨噬細胞比例均高于EAE組，且PA組>苦參素組>激動劑組。

圖3 脊髓組織M1型(A)、M2型(B)巨噬細胞免疫熒光染色結果(×400)

表3 各組小鼠脊髓組織中M1型、M2型巨噬細胞比例的比較 %

2.4 各組小鼠脊髓組織中iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 mRNA相對表達量的比較結果見表4。與對照組比較，EAE組、PA組、苦參素組及激動劑組iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 mRNA相對表達量均升高；與EAE組比較，PA組、苦參素組及激動劑組iNOS、TNF-α mRNA相對表達量均降低，且PA組<苦參素組<激動劑組。與EAE組比較，PA組、苦參素組及激動劑組Arg-1、IL-10 mRNA相對表達量均升高，且PA組>苦參素組>激動劑組。

表4 各組小鼠脊髓組織中iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 mRNA相對表達量比較

2.5 各組小鼠脊髓組織中p-p38MAPK/p38MAPK的比較結果見圖4和表5。與對照組比較，EAE組、PA組、苦參素組及激動劑組脊髓組織中p-p38MAPK/p38MAPK均升高。與EAE組比較，PA組、苦參素組及激動劑組p-p38MAPK/p38MAPK均降低，且PA組<苦參素組<激動劑組。

圖4 各組小鼠脊髓組織中p-p38MAPK、p38MAPK蛋白Western blot檢測結果

表5 各組小鼠脊髓組織中p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達及p-p38MAPK/p38MAPK的比較

3 討論

MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘類常見疾病[6]。目前，臨床尚缺乏MS理想治療藥物，臨床常見的激活沖擊或免疫抑制方法可顯著緩解MS癥狀，但對降低MS復發(fā)率效果仍不理想，且易引發(fā)不良反應[7]。MS發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明，已有研究[8]證實，巨噬細胞在EAE疾病進展過程中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用。巨噬細胞可分化為致炎M1型和抗炎M2型兩種細胞，巨噬細胞M1/M2型失衡參與MS疾病進展。因此，抑制巨噬細胞向M1型極化對緩解病情有重要作用。

本研究結果顯示，給予苦參素干預后，EAE小鼠神經(jīng)功能評分、脊髓組織炎性細胞浸潤評分、髓鞘脫失評分均降低，提示苦參素可有效改善EAE小鼠神經(jīng)功能，抑制脊髓組織炎癥反應及髓鞘脫失?？鄥⑺睾罅垦趸鄥A及少量氧化槐果堿，臨床已廣泛用于治療感染及腫瘤，且尚未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應，安全性較好。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，苦參素可減輕EAE小鼠脊髓組織氧化應激，增強線粒體自噬，從而保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本研究中經(jīng)苦參素干預后，EAE小鼠脊髓組織中M1型巨噬細胞比例及iNOS、TNF-α mRNA相對表達量降低，M2型巨噬細胞比例及Arg-1、IL-10 mRNA相對表達量增加，提示苦參素可誘導脊髓組織巨噬細胞向M2型極化。在EAE發(fā)病早期階段，外周巨噬細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，巨噬細胞以M1型為主，誘導促炎因子釋放，從而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，疾病后期M2型巨噬細胞占主導地位，誘導抗炎因子釋放，修復受損組織[10-11]。因此，誘導巨噬細胞向M2型極化可作為MS的防治策略。

p38MAPK是MAPK家族重要成員之一，屬細胞內(nèi)中樞信號轉(zhuǎn)導通路，參與調(diào)控多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。有研究[12]表明通過誘導EAE小鼠脊髓組織巨噬細胞向M2型極化，可減輕EAE炎癥程度。另有報道[13]顯示，p38MAPK信號通路的激活可誘導小鼠巨噬細胞向M1型極化，從而導致慢性炎癥的惡性循環(huán)。由此可知p38MAPK信號通路在EAE病變過程過程中起重要作用。本研究結果顯示，經(jīng)苦參素干預后EAE小鼠脊髓組織中p-p38MAPK/p38MAPK降低，提示苦參素可能通過抑制p38MAPK蛋白磷酸化，調(diào)控巨噬細胞M1/M2極化；進一步應用p38MAPK激動劑干預后，小鼠脊髓組織炎癥及髓鞘脫失較苦參素干預時加重，且巨噬細胞向M2型極化較苦參素組減弱，說明激活p38MAPK信號通路可削減苦參素的治療作用，進一步支持苦參素可能是通過抑制p38MAPK磷酸化參與誘導巨噬細胞向M2型極化；此外，激動劑組p38MAPK磷酸化水平高于苦參素組但仍低于EAE組，說明單獨p38MAPK磷酸化并不能完全消除苦參素的作用，側面提示苦參素可能存在多個靶標，但本研究并未進一步深入研究，需另行設計實驗證實該推論。

綜上所述，苦參素可有效改善EAE小鼠神經(jīng)功能，抑制脊髓組織炎癥及髓鞘脫失，誘導巨噬細胞向M2型極化，其作用機制可能與抑制p38MAPK磷酸化有關。在今后的研究中，應進一步探討苦參素是否存在其他信號通路調(diào)控巨噬細胞M1/M2極化，為苦參素用于臨床MS的防治提供更為充分的理論依據(jù)。