Hsa_circ_0005019在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

孫振強(qiáng)，黨 欽，邵 博，趙陸洋，陳 壯，張 浩，袁維堂

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

結(jié)直腸癌是全球第4位致死性癌癥，每年有近90萬(wàn)患者死亡，患者確診時(shí)往往已處于晚期[1-2]。由于術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌患者的5 a生存率較低[3]。目前結(jié)直腸癌治療方法包括手術(shù)、術(shù)后輔助化療、放療、免疫治療和生物靶向治療等[2]，但由于治療效果不佳，患者生活質(zhì)量及預(yù)后均不理想[4]。因此，積極尋找結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，對(duì)提高其早期診斷率和改善預(yù)后具有重要意義。

最近，環(huán)狀RNA成為癌癥研究的熱點(diǎn)，涉及腫瘤細(xì)胞增殖[5]、轉(zhuǎn)移[6]、血管生成[7]、腫瘤干細(xì)胞干性[8]和耐藥性[9]等。研究[10]表明，親本基因的表達(dá)與相應(yīng)的環(huán)狀RNA的表達(dá)處于動(dòng)態(tài)平衡中，兩者作用相反。在腫瘤的發(fā)展中，Zbtb7a基因的環(huán)狀RNA與其線性mRNA有相反的作用[11]。通過(guò)circBase數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA hsa_circ_0005019在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，而其親本基因CHSY1能夠促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[12]、腎透明細(xì)胞癌[13]及結(jié)直腸癌[14]的進(jìn)展。本研究探索了hsa_circ_0005019在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用及對(duì)患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，以期發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)的選取和預(yù)后評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。66對(duì)結(jié)直腸癌原發(fā)灶組織(多位點(diǎn)取樣)和匹配的距原發(fā)灶3 cm以上的癌旁正常腸黏膜組織均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016年11月至2020年12月的手術(shù)切除標(biāo)本。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)術(shù)前化療、放療或靶向治療；不合并其他類型腫瘤；無(wú)自身免疫性疾病。66例中男36例，女30例，年齡22～82歲，其中≥60歲者34例。病理學(xué)分級(jí)：Ⅰ、Ⅱ級(jí)42例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)24例；TNM 分期[基于NCCN(2019)指南]：Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期25例；腫瘤類型：非黏液腺癌48例，黏液腺癌18例；浸潤(rùn)深度：浸潤(rùn)至肌層18例，漿膜層48例。術(shù)中獲得的標(biāo)本立即液氮速凍，-80 ℃保存?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，本方案經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)為2019-KY-423。

1.2 HCT116細(xì)胞培養(yǎng)及分組HCT116細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(Gibco公司)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下孵育。hsa_circ_0005019特異性小干擾RNA(siRNA)及對(duì)照siRNA由銳博生物公司(中國(guó)廣州)設(shè)計(jì)并合成。6孔板內(nèi)每孔約接種3×105個(gè)HCT116細(xì)胞,24 h細(xì)胞貼壁后分為2組，用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher公司)分別轉(zhuǎn)染hsa_circ_0005019 siRNA(siRNA組)和對(duì)照siRNA(陰性對(duì)照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用RNAiso Plus試劑(TaKaRa公司)提取細(xì)胞中總RNA，評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量和完整性后使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用基因組DNA(gDNA)提取試劑盒(TIANGEN公司)提取細(xì)胞中的gDNA。hsa_circ_0005019上游引物序列5’-GCACGACCACTACTTGGACA-3’，下游引物序列5’-CACCATTCTCCGAAGCACCT-3’；GAPDH上游引物序列5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；hsa_circ_0005019反向引物上游引物序列5’-GAAG GTGTGTCCGGAGGTTT-3’，下游引物序列5’-TGTC CAAGTAGTGGTCGTGC-3’。使用預(yù)混熒光染料(翌圣公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL)：熒光染料10 μL，無(wú)酶水(TaKaRa公司) 6 μL，模板cDNA或gDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃退火30 s；最后60 ℃ 1 min，95℃ 1 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0005019的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。制備30 g/L的瓊脂糖凝膠，電泳產(chǎn)物于凝膠成像儀(Tanon公司)中曝光，觀察正、反向引物在cDNA和gDNA中的擴(kuò)增情況。

1.3 沉默hsa_circ_0005019對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響使用CCK-8試劑盒(Dojindo公司)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力。取HCT116細(xì)胞接種于96孔板，每孔約接種1.5×103個(gè)細(xì)胞，按1.2中分組分別轉(zhuǎn)染hsa_circ_0005019 siRNA和對(duì)照siRNA，每組5個(gè)復(fù)孔。收集培養(yǎng)12、24、48和72 h的細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃下孵育2 h，測(cè)定450 nm處的吸光度(參比波長(zhǎng)為570 nm)，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

使用Transwell小室(膜孔徑8 μm，Corning公司)評(píng)估HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力。取HCT116細(xì)胞，按1.2中分組分別轉(zhuǎn)染hsa_circ_0005019 siRNA和對(duì)照siRNA。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集、消化HCT116細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL，將100 μL細(xì)胞懸液加入上室，預(yù)先將含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(600 μL)加入下室。在不含有基質(zhì)膠的情況下進(jìn)行遷移試驗(yàn)，并使用DMEM培養(yǎng)基稀釋5倍后的基質(zhì)膠(Corning公司)(100 μL/孔于小室中孵育1 h)進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育72 h后，吸去上室和下室殘留培養(yǎng)基，加入600 μL 40 g/L 的多聚甲醛固定至少30 min，1 g/L 的草酸銨結(jié)晶紫染色液(Solarbio公司)染色30 min。用PBS洗滌3次后，用無(wú)菌棉簽輕輕擦拭小室孔膜，晾干。用型號(hào)為Olympus FV1000的共聚焦顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 結(jié)直腸癌和配對(duì)癌旁正常組織中hsa_circ_0005019表達(dá)水平的檢測(cè)采用Trizol試劑提取結(jié)直腸癌組織和配對(duì)癌旁正常腸黏膜組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，測(cè)定組織中hsa_circ_0005019的表達(dá)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。方法步驟同1.3。

1.5 hsa_circ_0005019表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響選擇結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0005019表達(dá)水平的均值作為截?cái)嘀担瑢?6例患者分為低表達(dá)組(<均值)和高表達(dá)組(≥均值)，繪制2組患者的K-M生存曲線?？偵嫫?OS)定義為從腹腔鏡下結(jié)直腸癌根治術(shù)后開(kāi)始至死亡或隨訪結(jié)束時(shí)間。根據(jù)中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)《結(jié)直腸癌診療指南(2020版)》中的隨訪表Ⅰ級(jí)推薦規(guī)范進(jìn)行門(mén)診復(fù)查或電話隨訪等。隨訪截止日期是2020年12月31日。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較siRNA組和陰性對(duì)照組HCT116細(xì)胞中hsa_circ_0005019表達(dá)水平，增殖、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)的差異，采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較結(jié)直腸癌和配對(duì)癌旁正常腸黏膜組織中hsa_circ_0005019表達(dá)水平的差異。將性別、年齡、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期、腫瘤類型、浸潤(rùn)深度作為調(diào)整變量，hsa_circ_0005019表達(dá)(0=低表達(dá)，1=高表達(dá))作為自變量納入Cox回歸模型，分析hsa_circ_0005019表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后(0=生存，1=死亡)的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 陰性對(duì)照組和siRNA組細(xì)胞hsa_circ_0005019表達(dá)水平的比較siRNA組hsa_circ_0005019的相對(duì)表達(dá)量為(0.528±0.021)，低于陰性對(duì)照組(1.000±0.034)(t=23.190，P<0.001)。

2.2 陰性對(duì)照組和siRNA組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的比較細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。轉(zhuǎn)染12、24、48和72 h后，siRNA組細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于陰性對(duì)照組，侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)多于陰性對(duì)照組。見(jiàn)表1。

圖1 2組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

表1 陰性對(duì)照組和siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較

2.3 結(jié)直腸癌和配對(duì)癌旁正常腸黏膜組織中hsa_circ_0005019表達(dá)水平的比較結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0005019的相對(duì)表達(dá)量為(0.759±0.063)，低于癌旁正常組織(1.000±0.082)(t配對(duì)=7.504，P<0.001)。此外，我們發(fā)現(xiàn)利用hsa_circ_0005019的反向引物在HCT116細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增出了目的基因片段，而未觀察到該反向引物在gDNA中成功擴(kuò)增出相應(yīng)片段(圖2)。

圖2 hsa_circ_0005019正、反向引物的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 hsa_circ_0005019的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響66例患者中失訪12例(高表達(dá)組4例，低表達(dá)組8例)。生存分析結(jié)果(圖3)顯示，高、低表達(dá)組生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.296，P=0.038)，高表達(dá)組預(yù)后更好。Cox回歸分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0005019表達(dá)水平是結(jié)直腸癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因素(HR=0.104，95%CI：0.013～0.854，P=0.035)。

圖3 高、低表達(dá)組生存曲線的比較

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，癥狀多樣且發(fā)病年齡趨于年輕化[15]。結(jié)直腸癌患者就診時(shí)常伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[16]，因此，迫切需要探索新的靶向治療藥物。

越來(lái)越多的研究[17-19]指出，環(huán)狀RNA分子在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出至關(guān)重要的作用。據(jù)報(bào)道[17]，環(huán)狀RNA CIRS-7是影響結(jié)直腸癌患者總生存期和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。也有報(bào)道[18]環(huán)狀RNA GLIS2可激活結(jié)直腸癌細(xì)胞中的NF-κB通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎趨化因子，通過(guò)募集白細(xì)胞觸發(fā)腫瘤相關(guān)炎癥。環(huán)狀RNA 001971可通過(guò)發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA的作用，解除miR-29c-3p對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的抑制作用，從而加速結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成[7]。環(huán)狀RNA ITGA7通過(guò)抑制Ras信號(hào)通路和促進(jìn)ITGA7的轉(zhuǎn)錄，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[19]。Li等[20]的研究表明血液中hsa_circ_0001900、hsa_circ_0001178和hsa_circ_0005927含量的聯(lián)合應(yīng)用比癌胚抗原能更可靠地區(qū)分結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌患者。

我們前期利用生物信息學(xué)方法在circBase數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)狀RNA hsa_circ_0005019，其生物學(xué)功能目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示， hsa_circ_0005019在結(jié)直腸癌細(xì)胞中作為抑癌基因發(fā)揮作用，敲低其表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)。此外，與癌旁正常腸黏膜組織比較，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0005019呈低表達(dá)；生存分析結(jié)果顯示hsa_circ_0005019高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者預(yù)后更好；Cox回歸分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0005019表達(dá)水平是結(jié)直腸癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。以上結(jié)果均表明hsa_circ_0005019是一種新的抑癌因子，有望成為新的結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，環(huán)狀RNA hsa_circ_0005019在結(jié)直腸癌的增生及轉(zhuǎn)移中扮演著抑癌角色，高表達(dá)者預(yù)后更好。hsa_circ_0005019在結(jié)直腸癌中的抑癌作用為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的線索，hsa_circ_0005019有望成為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)和用于預(yù)后評(píng)估。