G-四鏈體探針在病毒基因檢測和成像中的應(yīng)用進展

張家恒，雷春陽，聶 舟

（化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，生物大分子化學生物學湖南重點實驗室，湖南大學 化學化工學院，湖南 長沙 410082）

病毒依賴宿主細胞完成其生命周期，是地球上數(shù)量最豐富的生物實體，影響著包括動物、植物、寄生蟲、真菌和細菌在內(nèi)的所有生物［1］。病毒感染引發(fā)的傳染病通常在廣泛的地理區(qū)域突然傳播而導(dǎo)致大面積暴發(fā)，嚴重影響著人類健康、國民經(jīng)濟以及社會的整體福祉［2］。除急性疾病外，病毒感染至少導(dǎo)致15%～20%的癌癥，并與神經(jīng)系統(tǒng)和其他慢性疾病相關(guān)［3］，因此開發(fā)檢測病毒的工具對防治病毒感染和預(yù)防病毒疾病具有重要意義。大多數(shù)病毒主要由病毒基因組（RNA 或DNA）、結(jié)構(gòu)蛋白（如衣殼）以及脂質(zhì)膜（包膜病毒）組成，病毒通過表面受體或蛋白質(zhì)附著在宿主細胞上，進入細胞后病毒基因組被剝?nèi)グげ⑨尫诺郊毎|(zhì)中，在相應(yīng)的位置通過不同的策略復(fù)制、轉(zhuǎn)錄并合成新的基因組以及蛋白質(zhì)，進而組裝成新的病毒顆粒并釋放到細胞外（圖1）［4］。病毒基因組在病毒的生命周期中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并為病毒的檢測提供了有效靶點，發(fā)展基因組的檢測方法對于了解病毒的機制以及實現(xiàn)病毒的示蹤至關(guān)重要。

圖1 病毒生命周期的示意圖［4］Fig.1 Cartoon representation of virus life cycle［4］

G-四鏈體（G4）是由富含鳥嘌呤的核酸折疊形成的一種穩(wěn)定的核酸二級結(jié)構(gòu)。其中，4個鳥嘌呤通過Hoogsteen氫鍵作用形成G-quartet平面結(jié)構(gòu)，兩個以上的G-quartet通過π-π堆疊構(gòu)建穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)［5］?；蚪M中存在大量的G4潛在位點，因此其生物功能得到了廣泛關(guān)注［6］。近年隨著G4相關(guān)結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)，G4結(jié)構(gòu)的生物功能得到進一步挖掘，其被認為參與多種生物功能的調(diào)節(jié)，在重要的細胞生理過程中起到關(guān)鍵作用（圖2）［7-8］。此外，G4結(jié)構(gòu)本身的特點以及功能性也得到越來越多的關(guān)注，基于G4的核酸納米結(jié)構(gòu)以及生物傳感方法也得到了快速發(fā)展［9］，被廣泛用于目標物的識別以及信號轉(zhuǎn)換放大。

圖2 G-四鏈體的生物調(diào)節(jié)功能［8］Fig.2 Biological regulation function of G-quadruplexes［8］

鑒于G4 在生理過程中至關(guān)重要的作用，以及G4 結(jié)構(gòu)中特殊的G 平面為其與有機探針的結(jié)合提供了有效的平臺，G4 特異性探針得到迅速發(fā)展。G4 探針一般以苯并噻唑類、花青類、方酸類、蛋白生色團類、萘二酰亞胺類以及卟啉類等結(jié)構(gòu)骨架為基礎(chǔ)［10］，進行適當?shù)男揎椧詽M足不同的需求。不同探針所具有的獨有性質(zhì)以及優(yōu)勢，被廣泛用于G4生物傳感方法的構(gòu)建以及G4結(jié)構(gòu)的檢測和細胞成像［11］。此外，G4被認為是癌癥等多種疾病的潛在治療靶點，大量G4配體通過與生物體內(nèi)G4相互作用，展現(xiàn)出優(yōu)異的治療活性，有望成為相關(guān)疾病的有效藥物［12-16］。

G4探針構(gòu)建的生物傳感方法實現(xiàn)了對多種病毒基因序列的免標記檢測，在病毒相關(guān)疾病的診斷和臨床分析領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。此外，研究證明G4存在于在一些病毒基因組中，參與基因調(diào)控以及病毒關(guān)鍵過程，成為病毒基因中的潛在成像靶點，為病毒的可視化提供了新的思路。因此，本文綜述了基于G4 探針的生物傳感方法在病毒基因檢測中的研究進展，并總結(jié)了G4 結(jié)構(gòu)在多種病毒中的生理作用以及G4 探針在病毒基因組成像中的應(yīng)用，最后對病毒檢測存在的問題及發(fā)展趨勢進行了總結(jié)和展望。

1 基于G4探針的生物傳感方法用于病毒基因的檢測

1.1 基于熒光信號的G4生物傳感方法

G4熒光探針與G4結(jié)合后熒光將會出現(xiàn)明顯的變化，因此G4/探針復(fù)合物作為信號輸出的生物傳感方法已被用于多種病毒基因的檢測。郭良洽課題組［17］利用等溫雜交鏈式反應(yīng)（HCR）構(gòu)建了一種G4熒光生物傳感方法，實現(xiàn)了HIV DNA 的免標記無酶熒光檢測。作者將G4 結(jié)構(gòu)整合到兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，目標物HIV DNA 存在時，大量G4 沿著DNA 納米線通過HCR 自組裝而成，以G4 染料N-甲基卟啉二丙酸IX（NMM）作為熒光響應(yīng)元件，完成對HIV DNA 的檢測，檢出限低至0.5 nmol/L。該方法在病毒診斷和臨床分析領(lǐng)域顯示出巨大潛力。2020年，蔡昌群課題組［18］以染料硫黃素T（ThT）為檢測信號源，建立了一種簡便快速的HIV DNA 熒光檢測方法。該策略使用發(fā)夾DNA 序列（H1）和兩條輔助鏈，目標DNA 與H1雜交形成G4結(jié)構(gòu)，輔助探針與未折疊的H1雜交形成穩(wěn)定的DNA雙鏈，導(dǎo)致目標物發(fā)生位移，參與另一個反應(yīng)循環(huán)進而產(chǎn)生大量G4結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ThT的熒光信號明顯增強，線性范圍為0.1～50.0 nmol/L，檢出限為13 pmol/L。

鼻咽癌與孢疹病毒（EBV）感染有關(guān)，EBV 潛伏膜蛋白1（LMP1）是可能參與上皮轉(zhuǎn)化的候選病毒基因，LMP1的基因缺失與鼻咽癌之間存在潛在關(guān)聯(lián)。因此開發(fā)靈敏、高效檢測LMP1基因缺失的方法至關(guān)重要。Ma課題組［19］篩選了7個發(fā)光銥（Ⅲ）配合物，探究其與分裂型G4的結(jié)合能力，并建立了一種檢測LMP1基因缺失的無標記發(fā)光開關(guān)方法。兩個短的寡核苷酸P1和P2含有互補區(qū)域，可用于識別靶標基因缺失位點旁邊的DNA序列，另一端含有富G序列，距離拉近時形成分裂的G4。野生型DNA（LMP1基因無缺失）存在時，兩個寡核苷酸不能形成分裂G4；突變型DNA（del-LMP1，缺失30 nt 的基因）存在時，較短的靶序列使兩個G4形成序列接近，形成分裂G4進而使熒光信號增強，實現(xiàn)對LMP1基因缺失的靈敏檢測。該基因缺失檢測方法將有望成為生物化學和生物醫(yī)學研究中的新型診斷工具，并應(yīng)用于鼻咽癌疾病的檢測。2021 年，該課題組基于聚合酶鏈反應(yīng)，選擇性識別G4 的銥（Ⅲ）配合物發(fā)光探針，開發(fā)了一種超靈敏檢測乙型肝炎病毒（HBV）DNA 的無標記熒光傳感方法［20］。該方法采用含有氧乙二醇醚的兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物進行PCR 擴增，在兩端產(chǎn)生多個帶有游離G4 序列的特異性PCR 產(chǎn)物，與銥（Ⅲ）配合物結(jié)合后增強熒光強度，實現(xiàn)HBV 基因的靈敏檢測。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)正常和患者血清樣本中HBV DNA的檢測，在生物分析方面展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。

蔡昌群課題組［21］利用Mg（Ⅱ）依賴的DNAzyme和G4開發(fā)了一種免標記檢測H5N1 DNA的傳感方法。無分析物時分裂的DNAzymes 與底物雜交，形成無活性的DNAzyme。加入目標物后，裂解的DNA 酶的每條鏈末端與分析物結(jié)合，激活DNAzyme的活性裂解底物鏈并釋放G4，進而激活ThT的熒光。除了單一目標物的檢測，多目標的同時檢測也備受關(guān)注，該課題組基于G4和DNA模板銀納米簇（AgNCs），制備了一種快速、無標記、多功能同時檢測多個目標的熒光工具［22］。作者將兩端均設(shè)計為識別區(qū)域，只加入病毒亞型H5N1 基因或microRNA-141 時，釋放G4 與ThT 結(jié)合，產(chǎn)生特異性熒光響應(yīng)；只加入流感病毒亞型H1N1 基因或microRNA-21 時，兩個分裂的AgNC 靠近產(chǎn)生納米簇二聚體進而增強熒光強度；多靶點加入時，G4 和AgNCs 均產(chǎn)生熒光信號。該策略實現(xiàn)了對病毒DNA 和microRNA 的單一以及雙重檢測，為不同靶點檢測提供了一個多功能的平臺。

1.2 基于過氧化物酶的G4生物傳感方法

G4 平面能與Hemin 發(fā)生π-π 堆疊作用穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，并增強Hemin 的類過氧化物酶活性［23］。Hemin/G4 DNAzyme 能夠模擬HRP 對一些無色底物（如ABTS 和四甲基聯(lián)苯胺）進行氧化，產(chǎn)生顏色變化，另外也能產(chǎn)生電化學、化學發(fā)光以及熒光信號。因此，Hemin/G4 DNA zyme 的優(yōu)異催化性能為G4生物傳感方法的構(gòu)建提供了新的思路以及強有力的工具。

Connelly 等［24］設(shè)計了一種可提供視覺輸出信號的分裂G4 探針（圖3A）。其中，兩條DNA 鏈雜交到目標物的對接位置，在Hemin輔因子存在下形成G4結(jié)構(gòu)，催化過氧化氫將ABTS2-氧化為有色氧化產(chǎn)物ABTS-·，進而實現(xiàn)顏色的變化，從而成功檢測甲型流感病毒基因組（H1N1 亞型）片段。Wang 等［25］基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的模板聚合活性，結(jié)合Mg2+依賴的DNAzyme 和Hemin/G4 DNA zyme 的級聯(lián)擴增，報道了一種簡單、快速、靈敏的黃瓜綠斑駁花葉病毒的視覺檢測方法。如圖3B 所示，T1/P1的雜交dsDNA 被限制性內(nèi)切酶AcⅡ切成兩部分，在TdT 和dCTP 存在下，4 條ssDNA 片段生成完整的Mg2+依賴的DNAzyme酶序列，將HP裂解為兩部分，釋放出HP莖段G4序列。Mg2+依賴的DNAzyme的回收酶序列啟動另一輪雜交/裂解/分離反應(yīng)，釋放出更多的G4，結(jié)合Hemin 能夠催化H2O2氧化ABTS2-，導(dǎo)致溶液變成綠色，從而為病毒檢測和植物保護提供了快速高效的平臺。

圖3 基于分裂G4用于甲型流感病毒基因組片段（H1N1）的視覺檢測［24］（A），以及黃瓜綠斑駁花葉病毒視覺檢測的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）輔助擴增策略示意圖［25］（B）Fig.3 Visual detection of a fragment of the Influenza A virus genome（subtype H1N1）based on the split G-quadruplex［24］（A），schematic illustration of terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-assisted amplification strategy for visual detection of cucumber green mottle mosaic virus［25］（B）

2 基于G4探針的病毒基因組成像研究

2.1 病毒基因組中的G4結(jié)構(gòu)成為潛在的成像靶點

大量研究表明病毒基因組中部分富G序列能夠形成穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)，在病毒的生理周期中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用［26］。人類免疫缺陷病毒（HIV）是人類獲得性免疫缺陷綜合征的病原［27］，分子生物學分析表明HIV-1 病毒序列存在高度保守的G4 結(jié)構(gòu)，G4 特異性配體BRACO-1 能夠結(jié)合HIV-1 基因組中G4結(jié)構(gòu)而抑制病毒的轉(zhuǎn)錄及逆轉(zhuǎn)錄過程［28］。全基因組生物信息學分析顯示皰疹病毒基因組含有大量的潛在G4 結(jié)構(gòu)［29-30］；G4 配體PDS 能夠增強EBV 病毒（皰疹病毒的一種亞型）基因組中G4 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，抑制負責免疫逃逸的關(guān)鍵蛋白EBNA1 的合成。周翔課題組［31］的研究表明丙肝病毒（HCV）RNA 基因組中具有高度保守的正平行G4 結(jié)構(gòu)；G4 配體TMPyP4 特異性結(jié)合G4 并有效穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，進而降低RNA復(fù)制，抑制相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄。此外，乙肝病毒的preS2/S基因啟動區(qū)域也存在潛在的G4序列［32］。

2020 年，SARS-CoV-2 引起的冠狀病毒肺炎疫情席卷了全球200 多個國家，對世界公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了嚴重影響。生物信息學研究表明SARS-CoV-2 的開放閱讀框區(qū)域內(nèi)存在25 條潛在的G4 折疊序列［33］。曲曉剛課題組［34］采用多種生物物理及分子生物學技術(shù)手段，對其中四條潛在G4 序列（RG-1、RG-2、RG-3 和RG-4）進行深入研究，首次證明RG-1 序列在活細胞中能夠折疊為穩(wěn)定的平行G4 結(jié)構(gòu)。G4特異性配體PDP能夠促進RG-1 G4結(jié)構(gòu)的形成，降低SARS-CoV-2核衣殼磷酸化蛋白在體外和體內(nèi)的表達水平。

綜上所述，G4 結(jié)構(gòu)存在于多種病毒的基因組中，并參與病毒的關(guān)鍵生理過程；小分子G4 配體已成為探索病毒生命周期復(fù)雜機制的重要工具。因此，病毒基因組中G4 結(jié)構(gòu)是潛在的病毒生物成像靶點，發(fā)展G4結(jié)構(gòu)特異性熒光分子探針有望為活細胞中病毒基因組的可視化成像分析提供支撐。

2.2 G4探針用于病毒基因組的成像

丙型肝炎病毒（HCV）是一種具有代表性的單鏈RNA 病毒，已感染全球1.7 億多人，HCV 感染將導(dǎo)致肝炎、肝硬化以及肝癌等［35］。病毒的整個生命周期依賴于宿主細胞，因此對活細胞中的病毒RNA 進行檢測和成像不僅對了解病毒RNA 翻譯、復(fù)制和定位的時空動態(tài)至關(guān)重要，也對監(jiān)測病毒感染的進展和應(yīng)用治療的療效具有重要意義［36］。2019 年，本課題組基于熒光探針開發(fā)了一種免標記的病毒RNA 點亮系統(tǒng)用于活細胞內(nèi)HCV 的可視化（圖4A）［37］。相關(guān)文獻報道HCV RNA 基因組中具有保守的G4 結(jié)構(gòu)，選取HCV 2a 亞型感染病人中基因組+259 到+288 位點之間的序列作為研究對象并且命名為CG2a，該序列能夠穩(wěn)定形成正平行G4。以商業(yè)染料ThT 為基礎(chǔ)設(shè)計了新型G4 特異性染料ThTNE，G4 通過π-π 堆疊與該探針結(jié)合并且限制N，N-二乙基苯胺以及苯并噻唑之間的旋轉(zhuǎn)，進而抑制ThT-NE 的扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程使其熒光大幅增強。ThT-NE 與CG2a 結(jié)合后熒光增強1 693 倍，然而CG2a 突變序列以及其他類型構(gòu)象的核酸結(jié)構(gòu)均不能激活其熒光，表明ThT-NE 能特異性識別CG2 的G4 結(jié)構(gòu)。

細胞實驗證明ThT-NE能夠特異性結(jié)合HCV RNA 中的G4進而實現(xiàn)活細胞中HCV 全長基因組的可視化，并且具有快速響應(yīng)、高信背比以及優(yōu)異的選擇性。相對于商業(yè)探針ThT，ThT-NE 具有更高的脂水分配系數(shù)，有助于其更快進入細胞，更適用于細胞成像。該點亮方案具有免化學標記和基因修飾的優(yōu)勢，能夠監(jiān)測病毒RNA 基因組亞細胞分布（圖4B），對分析HCV 感染以及丙肝病毒生命周期具有重要意義。此外，ThT-NE被用于監(jiān)測實驗室制備的病毒顆粒（圖4C）以及臨床分離的HCV病人血清的真實感染過程（圖4D）。高濃度的ThT-NE 長時間孵育可有效抑制病毒RNA 水平以及Core 和NS3 蛋白的表達量，展現(xiàn)出抗病毒潛力。這種新型點亮方案將G4 特異性探針擴展到活細胞中與疾病相關(guān)的G4可視化，無需對病毒進行修飾或標記，也無需對宿主細胞進行固定、裂解或加工，從而為進一步理解G4結(jié)構(gòu)在病毒中的功能提供了新型工具。

圖4 利用G4特異性探針ThT-NE構(gòu)建的點亮系統(tǒng)用于HCV RNA成像的示意圖（A）及用于監(jiān)測細胞中HCV 基因的亞細胞器分布（B）；ThT-NE用于HCV病毒感染細胞的監(jiān)測（C）及HCV病人血清感染細胞的監(jiān)測（D）［37］Fig. 4 Principle of the HCV RNA light-up system using the G-Quadruplex probe ThT-NE（A），subcellular distribution of HCV RNA in living cells using ThT-NE（B），detection of virus infection by the laboratory prepared HCV virus（C）and the native virus in blood sera from HCV patients（D）using ThT-NE［37］

3 總結(jié)與展望

基于G4 結(jié)構(gòu)本身的特點以及功能性，如識別功能、熒光激活以及催化活性等，G4 探針構(gòu)建的生物傳感方法被用于病毒基因的檢測，為病毒相關(guān)疾病的早期診斷提供了不可或缺的工具。然而，現(xiàn)有的方法較少應(yīng)用于真正病毒感染模型或?qū)嶋H樣品，探究這些方法在病毒感染細胞或者病例中的檢測效果，或者開發(fā)能夠用于細胞內(nèi)或活體內(nèi)病毒基因組的成像工具，將會極大擴展G4染料構(gòu)建的生物傳感方法在病毒檢測中的應(yīng)用，為病毒的監(jiān)測提供更多的有效平臺。

G4存在于大量病毒基因組中，在病毒生命周期中起重要的調(diào)節(jié)作用，為開發(fā)探究病毒生命過程的可視化工具以及抗病毒活性的新型藥物提供了新的思路。細胞內(nèi)G4的可視化為探究其相關(guān)生物功能提供了極大的幫助，G4 抗體或者G4 染料通過成像病毒基因組中G4 實現(xiàn)了對細胞中病毒的實時可視化，可對病毒的感染以及生命周期進行監(jiān)測［37］。然而，大多數(shù)配體以及染料僅能識別G4或者特定拓撲結(jié)構(gòu)的G4，不能選擇性結(jié)合病毒基因組中特定序列的G4，因此篩選出特異性識別特定病毒G4 的染料仍然是亟待解決的重要問題。除了G4結(jié)構(gòu)中均有的G4平面，不同病毒G4中的不同Loop環(huán)以及溝槽為特異性染料的設(shè)計提供了結(jié)合位點，利用分子的側(cè)鏈結(jié)合Loop 或者溝槽將有助于識別不同序列的病毒G4［38］?；诮Y(jié)構(gòu)的虛擬篩選和優(yōu)化已經(jīng)得到了特異性結(jié)合PU22 的熒光探針，該策略為篩選得到病毒G4 序列的特異性探針提供了新思路［39］。目前用于病毒基因組成像的G4 探針較少，開發(fā)更多用于不同病原體的新型G4 探針將會為病理學研究和臨床診斷提供方便易操作的有效工具。此外，現(xiàn)有的G4 探針大多聚焦在細胞中的成像，發(fā)展適用于活體中病毒G4 的近紅外成像探針將擴展G4 探針在該領(lǐng)域更廣闊的應(yīng)用前景。