打頂方式對(duì)雪茄煙煙葉氮素積累及品質(zhì)的影響

張思唯 李金奧,2 劉博遠(yuǎn) 蔣雨辰 鐘 秋 雷云康 張明月 趙銘欽

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/河南省香精香料與調(diào)香工程技術(shù)研究中心，450002，河南鄭州；2紅云紅河集團(tuán)昆明卷煙廠，650000，云南昆明；3四川省煙草公司德陽(yáng)市公司，618400，四川德陽(yáng)）

雪茄煙作為一種特殊的卷煙產(chǎn)品，具有勁頭大、香氣濃郁和吃味醇厚等特點(diǎn)。由于其抽吸方式與烤煙不同，所以對(duì)人體危害較小，近幾年發(fā)展較快[1]。而隨著雪茄煙銷售規(guī)模的增大，國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)雪茄煙原料質(zhì)量不足，嚴(yán)重制約了雪茄煙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。四川什邡是我國(guó)雪茄煙的主產(chǎn)地之一，其生態(tài)條件與國(guó)外優(yōu)質(zhì)雪茄煙產(chǎn)區(qū)較為接近，但由于發(fā)展起步較晚，尚未形成成熟完備的雪茄煙栽培技術(shù)規(guī)程。在日常栽培管理中，當(dāng)?shù)亟?jīng)常采用扣心和現(xiàn)蕾打頂?shù)拇蝽敺绞?，?dǎo)致當(dāng)?shù)匮┣褵熑~片偏大，氮素積累過(guò)多，蛋白質(zhì)和煙堿含量升高，煙葉吸食品質(zhì)變差。雪茄煙屬于高氮類型的煙草，含氮化合物的合成和轉(zhuǎn)化對(duì)其質(zhì)量和產(chǎn)量有明顯影響[2]，而煙株打頂是煙草栽培中一項(xiàng)重要的技術(shù)措施，可及時(shí)調(diào)整煙株的養(yǎng)分供應(yīng)，使光合產(chǎn)物向煙葉內(nèi)部集中分配，促進(jìn)煙葉內(nèi)部干物質(zhì)積累，增加煙葉有效葉面積[3]，影響煙葉中總氮、蛋白質(zhì)和煙堿等主要化學(xué)成分的合成與積累[4]。

氮代謝是煙草生長(zhǎng)發(fā)育中的關(guān)鍵代謝之一，其代謝強(qiáng)度和協(xié)調(diào)程度會(huì)對(duì)煙葉品質(zhì)形成起到重要的調(diào)節(jié)作用，并最終影響煙葉質(zhì)量。許威等[5]研究表明，打頂會(huì)使煙株充分吸收氮素，用于合成煙堿，導(dǎo)致其煙堿合成能力增強(qiáng)。趙光偉等[6]研究表明，隨著打頂時(shí)間的推遲，煙葉內(nèi)糖含量變化呈先上升后下降趨勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)煙葉打頂技術(shù)的研究主要集中在其對(duì)化學(xué)成分和產(chǎn)量的影響，對(duì)打頂后煙葉內(nèi)部氮素積累規(guī)律和相關(guān)酶活性影響的研究幾乎沒(méi)有。因此，本試驗(yàn)以四川什邡煙區(qū)的德雪3號(hào)為試驗(yàn)材料，研究了不同打頂方式對(duì)雪茄煙煙葉打頂后氮代謝關(guān)鍵酶活性、煙堿含量、化學(xué)成分以及感官品質(zhì)的影響，探討打頂引發(fā)的煙株內(nèi)部氮素積累機(jī)制，探究什邡煙區(qū)最適宜的打頂方式，為該地區(qū)優(yōu)質(zhì)雪茄煙煙葉生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及材料

試驗(yàn)于2020年在四川省什邡市師古鎮(zhèn)大泉坑村雪茄煙生產(chǎn)基地（104°09′ E，31°18′ N）進(jìn)行，供試品種為德雪3號(hào)。試驗(yàn)地土壤為水稻土，土壤pH 5.8～7.0、有機(jī)質(zhì)3.01g/kg、速效磷38.10mg/kg、速效氮120mg/kg、速效鉀89mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

煙苗于 2020年 4月 30日移栽，行株距為120cm×40cm，施氮量為180kg/hm2（煙草專用復(fù)合肥，N:P2O5:K2O＝1:0.5:3），共設(shè)3個(gè)處理，選取田間長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株，分別于現(xiàn)蕾期、初花期和盛花期打頂，分別記為T(mén)1、T2和T3處理，打頂時(shí)間分別為6月9日、6月12日和6月16日。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。各處理分別在打頂后0、5、10、15和20d取中部葉位（自下而上10～12葉位）葉片20片，一部分于液氮罐保存，用于測(cè)定氮代謝關(guān)鍵酶活性，一部分去除主脈后于105℃烘箱殺青15min，65℃烘干至恒重，將其磨碎過(guò)60目篩，用于測(cè)定煙堿、總氮、蛋白質(zhì)及常規(guī)化學(xué)成分含量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 氮代謝相關(guān)酶活性 采用蘇州科銘生物試劑盒，利用紫外分光光度法檢測(cè)硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）的活性。

1.3.2 化學(xué)成分及氨基酸含量 按照流動(dòng)分析儀法[7]測(cè)定總糖、總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量。采用蘇州科銘生物試劑盒，利用紫外分光光度法檢測(cè)氨基酸含量。

1.3.3 煙葉感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 將各處理調(diào)制后的中部葉卷成單料雪茄煙，請(qǐng)?jiān)u吸專家根據(jù)YC/T 138-1998的方法進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 24.0進(jìn)行差異顯著性分析，利用 GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

NR是植物將體內(nèi)的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，對(duì)植物氮代謝起關(guān)鍵作用。由圖 1a可以看出，雪茄煙NR活性隨著打頂后天數(shù)的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，打頂當(dāng)天T1處理酶活性顯著高于T2和T3處理，各處理均在打頂后5d時(shí)達(dá)到峰值，這表明雪茄煙在打頂后由于根系吸收氮素能力增強(qiáng)，氮代謝能力增強(qiáng)。打頂后5d時(shí)T2處理顯著高于T3處理，之后各處理雪茄煙葉酶活性逐漸下降，在打頂后20d酶活性降到最低，且T2處理顯著低于T1處理，表明雪茄煙在成熟期氮代謝逐漸減弱，煙株由氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化，利于煙葉后期生長(zhǎng)發(fā)育。

GS是氨同化的關(guān)鍵酶，是植物氮素同化中重要的酶之一。由圖1b可以看出，雪茄煙GS活性隨著打頂后天數(shù)的增加呈先下降再上升再下降趨勢(shì)，T1處理在打頂剛開(kāi)始時(shí)酶活性最高，且顯著高于T2和T3處理，隨后劇烈下降，可能是由于過(guò)早打頂導(dǎo)致，之后各處理GS活性緩慢下降，且T1處理一直高于T2和T3處理，在打頂后15d時(shí)，GS活性緩慢上升，各處理間差異不顯著，在打頂后20d時(shí)，各處理酶活性整體下降，可能因?yàn)闊熑~進(jìn)入成熟衰老期，導(dǎo)致酶活性整體下降。

GOGAT與GS共同構(gòu)成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。由圖 1c可以看出，不同處理煙葉的GOGAT活性隨著打頂后天數(shù)的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，與NR活性變化趨勢(shì)一致，表明煙株在打頂初期氮代謝旺盛，隨著打頂后天數(shù)的增加，氮代謝減弱，碳積累增強(qiáng)。煙株在打頂當(dāng)天T1處理GOGAT活性顯著高于T3處理，與T2處理差異不顯著，在打頂后5d時(shí)，T2處理GOGAT活性最高，且與T1和T3處理差異顯著，之后T1處理酶活性一直處于較高水平，T2和 T3處理酶活性較低，可能由于T2和T3處理打頂較晚，煙株較T1處理田間密度小，導(dǎo)致煙葉光合作用增強(qiáng)，氮素積累更多向碳素積累轉(zhuǎn)化。

圖1 不同處理對(duì)雪茄煙葉NR、GS和GOGAT活性的影響Fig.1 The effects of different treatments on the activities of NR, GS, and GOGAT in cigar tobacco leaves

2.2 不同處理對(duì)雪茄煙煙葉總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)和煙堿含量的影響

由圖 2a可以看出，雪茄煙在打頂后各處理總氮含量均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，在打頂0～5d時(shí)，T1處理煙葉總氮含量一直顯著高于T2和T3處理，打頂后15～20d，各處理間無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)槿~片干物質(zhì)積累造成煙葉稀釋效應(yīng)，導(dǎo)致煙葉總氮含量下降。

由圖 2b可以看出，雪茄煙打頂后氨基酸含量變化趨勢(shì)與NR活性變化一致，呈先上升再逐漸下降趨勢(shì)。打頂后5d煙葉氨基酸含量最高，表現(xiàn)為T(mén)2＞T1＞T3，T2與T3處理間差異顯著，與T1處理差異不顯著。之后隨打頂后天數(shù)增加，煙葉逐漸成熟，導(dǎo)致氨基酸含量逐漸下降。在打頂后10～20d，T1處理氨基酸含量始終顯著高于T2和T3處理，T2和T3處理間差異不顯著。

由圖 2c可以看出，蛋白質(zhì)含量在打頂后隨著煙葉生長(zhǎng)天數(shù)增加呈緩慢下降趨勢(shì)，打頂后 0～5d時(shí)，T2處理降幅最大，為9.17%，之后隨著打頂后天數(shù)的增加逐漸趨于平緩，其中T2處理一直顯著高于T1和T3處理。在打頂后20d時(shí)，煙葉蛋白質(zhì)含量降到最低，蛋白質(zhì)含量為 T1＞T2＞T3，分別為16.03%、15.78%和14.81%，T1和T2處理間無(wú)顯著差異，但顯著高于T3處理。

由圖 2d可以看出，雪茄煙煙堿含量隨打頂后天數(shù)的增加而逐漸增加，在打頂后0～5d，T1處理漲幅最大，為44.9%，其次為T(mén)3和T2處理，分別為36.4%和24.3%，這是因?yàn)檩^早打頂和較晚打頂都會(huì)導(dǎo)致雪茄煙煙堿急劇增加。打頂后10d時(shí)，T2和T3處理顯著高于T1處理，打頂后20d時(shí)，T3處理煙堿積累量最多，達(dá)3.39%，T2處理次之，T1處理最低，且T1處理顯著低于T2和T3處理，T2和T3處理間差異不顯著，這可能是因?yàn)檩^早打頂導(dǎo)致雪茄煙氮素積累不足，從而煙堿積累較少。打頂過(guò)晚氮素由根部向頂部運(yùn)輸，從而導(dǎo)致煙堿積累量上升。

圖2 不同處理對(duì)雪茄煙葉總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)和煙堿含量的影響Fig.2 The effects of different treatments on the contents of total nitrogen, amino acid,protein and nicotine in cigar tobacco leaves

2.3 不同處理對(duì)調(diào)制后雪茄煙煙葉化學(xué)成分含量的影響

由表1可知，隨著打頂時(shí)間的推遲，調(diào)制后雪茄煙的總糖含量呈逐漸下降趨勢(shì)，且T1和T2處理顯著高于T3處理，煙堿含量隨打頂時(shí)間的推遲呈先上升后下降變化趨勢(shì)，T2與 T1處理間差異顯著。蛋白質(zhì)含量隨打頂時(shí)間的推遲逐漸下降。韓富根[8]指出，煙草的鉀氯比大于4的情況下，燃燒性較好，本研究中T2處理鉀氯比高于T1和 T3處理。氮堿比在接近1的情況下煙葉質(zhì)量較好，若氮堿比增大，煙葉顏色變淺，香味減少[8]，T2處理最接近1，且與T1處理差異顯著。綜合來(lái)看，T2處理的化學(xué)成分最協(xié)調(diào)。

表1 不同處理對(duì)雪茄煙常規(guī)化學(xué)成分的影響Table 1 Effects of different treatments on the conventional chemical composition of cigar tobacco

2.4 不同處理對(duì)雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響

由表2可知，雪茄煙葉的香氣質(zhì)、香氣量、勁頭、濃度、余味、甜度和灰色等指標(biāo)分值都隨著打頂時(shí)間的推遲呈先上升后下降的趨勢(shì)，刺激性、雜氣和燃燒性等指標(biāo)分值逐漸降低，T2處理的總分最高，說(shuō)明T2處理感官品質(zhì)相對(duì)其他處理較好，總體香氣質(zhì)好，香氣量足，燃燒性好，其次是T3處理感官品質(zhì)較好。

表2 不同處理對(duì)雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響Table 2 Effects of different treatments on the sensory quality of cigar leaves

3 討論

3.1 打頂方式對(duì)煙葉氮代謝酶活性的影響

在煙株的生長(zhǎng)過(guò)程中，氮代謝的動(dòng)態(tài)變化對(duì)煙葉品質(zhì)影響較大，通過(guò)打頂可以調(diào)節(jié)煙株的生長(zhǎng)中心，調(diào)整養(yǎng)分供應(yīng)，調(diào)整煙葉的株高、節(jié)距和留葉數(shù)，進(jìn)而改變煙田內(nèi)的溫度和光照強(qiáng)度，從而影響煙葉的碳氮代謝強(qiáng)度，影響煙葉內(nèi)部的氮素積累。在煙株的生長(zhǎng)前期，氮代謝旺盛有利于為優(yōu)質(zhì)煙葉的形成提供豐厚的物質(zhì)基礎(chǔ)，NR和GS是煙葉氮代謝的關(guān)鍵酶，在煙株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起主要調(diào)節(jié)作用[9]，增強(qiáng)其活性可促進(jìn)煙株內(nèi)部氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化[10]，也有利于根系對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收與利用[11]。在本文研究中，NR與GOGAT活性變化趨勢(shì)一致，均呈先上升后下降的趨勢(shì)，打頂后先上升是由于煙葉在打頂后根系吸收氮素能力增強(qiáng)，氮代謝能力增強(qiáng)，出現(xiàn)下降趨勢(shì)是由于煙葉進(jìn)入成熟衰老期后，整體酶活性減弱，其中T2處理在打頂初期NR和GOGAT活性較低，在打頂后5d時(shí)上升到最高，可能是適當(dāng)延長(zhǎng)打頂時(shí)間可提高煙葉代謝能力，使煙葉酶活性上升，之后逐漸下降，且酶活性低于其他處理，說(shuō)明T2處理的煙葉淀粉積累代謝增強(qiáng)，煙葉較其他處理品質(zhì)提高。這與張嘉雯等[12]在植煙密度對(duì)雪茄煙葉碳氮代謝的影響上研究一致。GS活性在打頂后呈先下降后上升再下降趨勢(shì)，這與曾孝敏[13]在施氮量對(duì)烤煙碳氮代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶及代謝產(chǎn)物的影響上研究規(guī)律不同，前期GS活性下降可能與煙葉在打頂后NH4+增多，促使GS將其合成為谷氨酸（Gln），但Gln濃度增加會(huì)抑制GS活性。T2處理酶活性一直處于較低水平，說(shuō)明過(guò)早或過(guò)晚打頂可使煙株對(duì) NH4+同化能力增強(qiáng)，GS活性增強(qiáng)。

3.2 打頂方式對(duì)煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中總氮、氨基酸、蛋白質(zhì)和煙堿含量的影響

總氮和蛋白質(zhì)是煙葉在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中維持機(jī)體生命活力的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。在本研究中，煙葉的總氮和蛋白質(zhì)含量呈直線下降趨勢(shì)，可能是由于合成的一部分碳水化合物和煙葉內(nèi)部氮素結(jié)合使得供給煙株的營(yíng)養(yǎng)暴增，煙株生長(zhǎng)的骨架物質(zhì)充足，因此由于碳水化合物的增加，煙葉含氮化物含量就相對(duì)減少[14]。其中T2和T3處理總氮含量相對(duì)較低，說(shuō)明適當(dāng)推遲打頂可以降低葉片的氮素濃度，對(duì)煙葉的成熟有一定促進(jìn)作用。T2處理蛋白質(zhì)含量一直顯著高于T3處理，說(shuō)明過(guò)晚打頂不利于煙葉內(nèi)部蛋白質(zhì)合成。

游離氨基酸含量對(duì)研究植物在不同條件下及不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對(duì)氮素的吸收、運(yùn)輸、同化及營(yíng)養(yǎng)狀況等具有重要意義[15]，在本研究中不同打頂方式下，氨基酸含量變化與氮代謝主要酶NR活性變化趨勢(shì)一致，主要因?yàn)镹R可促進(jìn)煙株內(nèi)游離氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化，經(jīng)T2處理，煙葉氨基酸含量由剛開(kāi)始較高水平降低到較低水平，這是由于較晚打頂?shù)臒熤暝跓熖镏械拿芏缺仍绱蝽數(shù)臒熤昝芏刃?，煙株?jié)距增大，因此導(dǎo)致煙葉光合速率增強(qiáng)，光合產(chǎn)物增多。

煙堿經(jīng)煙株根系合成后又重新運(yùn)輸?shù)饺~片中去。在本研究中，煙葉在打頂處理后，煙堿含量呈緩慢上升趨勢(shì)，這可能是由于煙株經(jīng)過(guò)打頂后，頂端庫(kù)對(duì)養(yǎng)分的需求被消除，煙株根系由原來(lái)的源變?yōu)閹?kù)，大量光合產(chǎn)物會(huì)通過(guò)韌皮部傳遞給煙株根系，促進(jìn)根系的二次生長(zhǎng)，大量根系將合成的煙堿輸送給煙葉。這與張丹等[16]在打頂時(shí)期對(duì)烤煙根系活力及煙堿積累規(guī)律的影響研究一致。其中T3和T2處理煙堿含量一直明顯高于T1處理，T1處理煙堿合成量一直較低，可能是由于打頂后煙株過(guò)早吸收土壤中的氮素，轉(zhuǎn)化為供給煙株生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致煙堿在葉片中沒(méi)有得到有效積累[17]。

3.3 打頂方式對(duì)煙葉調(diào)制后化學(xué)成分的影響

不同的打頂方式在影響煙葉氮代謝進(jìn)程的同時(shí)也會(huì)影響煙葉中的化學(xué)成分[12]。調(diào)制后煙葉的糖含量對(duì)雪茄煙的香吃味具有重要影響，糖堿比較適宜，煙氣醇和，有利于提高煙葉的內(nèi)在品質(zhì)[18]。綜合分析印尼和中國(guó)海南等地的煙葉化學(xué)成分含量可知，優(yōu)質(zhì)雪茄煙中部葉的總糖含量約 2%、總氮含量4%～6%、煙堿含量1%～2%、鉀含量≥2%、鉀氯比≥4[19]。煙葉中淀粉含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致煙葉燃燒產(chǎn)生雜氣，使抽吸時(shí)香吃味變差。蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，煙氣強(qiáng)度較大，香吃味變差，具有刺激性及辛辣味。煙葉的鉀氯比維持在≥4、氮堿比維持在1左右的條件下煙葉品質(zhì)較好[8]。本試驗(yàn)研究表明，T1處理總糖和還原糖含量最高，但明顯低于優(yōu)質(zhì)煙葉糖含量，這主要因?yàn)榱乐茣r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，在晾制過(guò)程中糖經(jīng)過(guò)煙葉的呼吸作用被消耗[18]，T2處理煙堿含量較T1和T3處理高，這與伍發(fā)明等[20]在打頂期對(duì)湖北恩施煙區(qū)雪茄煙品種產(chǎn)質(zhì)量的影響研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵跓熤杲?jīng)T1處理前期，當(dāng)?shù)赜晁^多，導(dǎo)致煙株莖葉生長(zhǎng)旺盛，煙葉細(xì)胞間隙較大，組織疏松，使調(diào)制后煙堿含量相對(duì)較低。T2處理的鉀氯比最高，說(shuō)明煙葉的燃燒性最好；氮堿比最接近1，說(shuō)明煙葉的香味較多，刺激性較小，吃味醇和，這與董維杰等[21]的研究結(jié)果一致。

3.4 打頂方式對(duì)調(diào)制后煙葉感官質(zhì)量的影響

煙葉的感官質(zhì)量是評(píng)價(jià)優(yōu)質(zhì)雪茄煙的關(guān)鍵因素，本研究中不同處理煙葉的香氣質(zhì)、香氣量、勁頭、濃度、余味、甜度和灰色等指標(biāo)分值都隨著打頂時(shí)間的推遲呈先上升后下降的趨勢(shì)，可能是現(xiàn)蕾期打頂煙株?duì)I養(yǎng)供應(yīng)充足，葉片發(fā)育較大，較初花期和盛花期打頂煙田內(nèi)密度較大，煙葉呼吸作用減慢，感官質(zhì)量下降。

4 結(jié)論

不同打頂方式對(duì)雪茄煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性、煙堿、氨基酸及相關(guān)化學(xué)成分含量都有顯著影響，初花期打頂?shù)臒熑~氮代謝酶活性由剛開(kāi)始較高到煙葉成熟后期下降到最低，說(shuō)明煙葉在成熟后期氮代謝穩(wěn)定向碳代謝轉(zhuǎn)化，煙堿含量在打頂后逐漸上升，初花期和盛花期打頂煙堿積累量較多，同時(shí)初花期打頂?shù)臒熑~在晾制后的化學(xué)成分也較其他處理協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量評(píng)價(jià)較好，因此雪茄煙在四川省什邡市種植時(shí)應(yīng)以初花期打頂為宜，盛花期次之。