基于分子邏輯門的DNA檢測(cè)技術(shù)

蒙麗君，許凱歌，張　笛，晉曉勇（寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏天然藥物工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川750021）

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基于分子邏輯門的DNA檢測(cè)技術(shù)

蒙麗君，許凱歌，張笛，晉曉勇*
（寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏天然藥物工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川750021）

摘要：DNA有精確的分子識(shí)別能力以及強(qiáng)大的信號(hào)存儲(chǔ)能力。利用DNA分子的生物學(xué)特性來(lái)構(gòu)建分子級(jí)別的邏輯門并實(shí)現(xiàn)邏輯運(yùn)算是近年來(lái)計(jì)算機(jī)科學(xué)和分子生物學(xué)交叉產(chǎn)生的新興領(lǐng)域，引起了相關(guān)研究者的高度關(guān)注。該文介紹了近年來(lái)利用DNA分子的結(jié)構(gòu)特性、堿基配對(duì)原則、DNAzyme以及核酸適配體等特殊結(jié)構(gòu)或者性質(zhì)來(lái)構(gòu)建DNA分子邏輯門的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：分子邏輯門；DNA；DNAzyme；核酸適配體；綜述

0　引言

自1946年世界上第一臺(tái)計(jì)算機(jī)誕生以來(lái)，計(jì)算機(jī)為人類帶來(lái)了極大的便利，人類的生活方式也得到了很大的改變，可以說(shuō)計(jì)算機(jī)的誕生是人類歷史上的一個(gè)里程碑式的突破。由于集成電路技術(shù)的飛速發(fā)展，電子計(jì)算機(jī)本身的發(fā)展也是驚人的，其運(yùn)算速度較其原始模型已提高了約10億倍，最快運(yùn)算速度差不多每秒千萬(wàn)億次以上。然而，隨著人們對(duì)世界的認(rèn)識(shí)不斷加深，新的高新技術(shù)研究對(duì)計(jì)算機(jī)的性能不斷提出更高的要求，傳統(tǒng)電子計(jì)算機(jī)在信息儲(chǔ)存和處理方面有了一定的局限性。自1994年，Adleman［1］首次使用DNA計(jì)算機(jī)解決了著名的NP-complete計(jì)算機(jī)難題—哈密頓（Hamiltonian）路徑問(wèn)題以后，人們已經(jīng)就開始了諸如生物計(jì)算機(jī)、量子計(jì)算機(jī)等新一代的計(jì)算方法。其中DNA計(jì)算機(jī)的誕生和發(fā)展尤其引起了廣泛的關(guān)注［2-3］，而構(gòu)建分子邏輯門是設(shè)計(jì)分子計(jì)算機(jī)的先決條件。

在傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)中，微處理器應(yīng)用基本邏輯門（與、或、非等）構(gòu)建能夠執(zhí)行布爾數(shù)學(xué)邏輯的電子電路。與此類似，在分子運(yùn)算中一個(gè)主要的目標(biāo)就是設(shè)計(jì)可尋址的分子邏輯門。自1993年，De Silva等［4］首次報(bào)道了一種基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的分子邏輯門以及2000年Baytekin等［5］首次報(bào)道DNA分子邏輯門以來(lái)，在光學(xué)、電學(xué)等方面使用各種各樣的材料如核酸、酶以及其它小分子來(lái)構(gòu)建的分子（DNA）邏輯門不斷涌現(xiàn)，基于分子邏輯門技術(shù)的研究正如火如荼的飛速發(fā)展。分子邏輯門經(jīng)歷了不到20年的發(fā)展，取得了豐碩的成果。從理論計(jì)算到實(shí)驗(yàn)?zāi)M，核酸邏輯門的快速發(fā)展顯示出核酸分子在生物計(jì)算機(jī)上的巨大優(yōu)勢(shì)。下面將對(duì)基于幾種DNA分子邏輯門的構(gòu)建做一個(gè)簡(jiǎn)單的總結(jié)。

1　邏輯門及分子邏輯門

邏輯門是構(gòu)建邏輯運(yùn)算器的基礎(chǔ)，也是計(jì)算機(jī)集成電路上的基本組件，它是實(shí)現(xiàn)邏輯操作和運(yùn)算最簡(jiǎn)單的基本單元。傳統(tǒng)的邏輯門器件是由晶體管組成的，代表兩種輸入信號(hào)的高電平、低電平在分別通過(guò)這些晶體管的時(shí)候會(huì)因?yàn)檫@些晶體管的不同組合而產(chǎn)生高電平、低電平的信號(hào)。而高、低電平則用來(lái)分別代表邏輯輸出值，“真”值的輸出相當(dāng)于二進(jìn)制當(dāng)中的“1”，“假”值的輸出相當(dāng)于二進(jìn)制當(dāng)中的“0”，從而實(shí)現(xiàn)邏輯上的運(yùn)算。事實(shí)上，基于晶體管或者電子管的二進(jìn)制邏輯規(guī)則也可以應(yīng)用于分子開關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)換。分子邏輯門則是類比于數(shù)字電路中的邏輯門而給出的概念，分子邏輯門的輸入與輸出對(duì)象是在分子或超分子水平上實(shí)施的兩個(gè)或兩個(gè)以上的復(fù)雜操作，輸出信號(hào)就是操作所得到相應(yīng)的邏輯信號(hào)，使這個(gè)信號(hào)適用于“1”和“0”二進(jìn)制布爾邏輯運(yùn)算，從而實(shí)現(xiàn)基于分子水平的數(shù)學(xué)運(yùn)算。因此，分子邏輯門與傳統(tǒng)意義上的邏輯門操作對(duì)象雖然不同（一個(gè)是分子，一個(gè)是電器元件），但其功能是完全一樣的。

分子邏輯門大體上可分為兩種，一種是單輸入邏輯門（如“YES”門和“NOT”門），另一種是多輸入邏輯門（如“AND”門、“OR”門、“NAND”門、“XOR”門等）。最早的邏輯門是運(yùn)用于邏輯運(yùn)算中的，邏輯運(yùn)算是根據(jù)一個(gè)真值所描述的一系列規(guī)則進(jìn)行運(yùn)算，而真值表是指對(duì)應(yīng)于給定的輸入邏輯門得出相應(yīng)輸出值的列表。基本的邏輯門有三個(gè)，即AND（與）、NOT（非）及OR（或）門。AND門是當(dāng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的輸入信號(hào)同時(shí)為真值時(shí)輸出為真值，只要有一個(gè)輸入為假值，輸出均為假值。對(duì)于雙輸入即只有（1，1）輸入時(shí)，輸出值才能為“1”，其它三種輸入組合，即（0，0）﹑（1，0）﹑（0，1）輸入時(shí)，對(duì)應(yīng)的輸出值均為“0”；NOT門是將輸入信號(hào)“1”轉(zhuǎn)變?yōu)檩敵鲂盘?hào)“0”，反之亦成立它在邏輯門中占有很大的比重。OR門合并了2個(gè)輸入信號(hào)，當(dāng)任意一個(gè)輸入為“1”時(shí)，即（1，0）﹑（0，1）﹑（1，1）輸入時(shí)，輸出值為“1”，當(dāng)2個(gè)輸入都為“0”時(shí)，即（0，0）輸入時(shí)，輸出值為“0”。而AND門、OR門與NOT門組合，便成其對(duì)應(yīng)的反門：NAND（與非門）、NOR（或非門），另外，XOR（異或）門以及其與NOT組合生成對(duì)應(yīng)的反門XNOR（同或門），NOT與AND兩種邏輯功能結(jié)合衍生為INHIBIT（禁止）門［6］，INHIBIT與 NOT組合生成對(duì)應(yīng)的反門IMPLICATION［7］（也稱作NINH門），這幾種邏輯門是所有16種邏輯門中最常見(jiàn)的。表1是幾種常用的雙輸入邏輯門對(duì)應(yīng)的真值表和表示符號(hào)，參見(jiàn)文獻(xiàn) ［8］。其它邏輯門的相關(guān)信息可見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。朱衛(wèi)華［10］也在分子邏輯門一文中簡(jiǎn)單的介紹了分子邏輯門的基本概念，并詳細(xì)的介紹了以簡(jiǎn)單的化學(xué)物質(zhì)作為輸入，有無(wú)熒光發(fā)出作為輸出，設(shè)計(jì)了“是（YES）”邏輯門和“非（NOT）”分子邏輯門。Raymo［11］也對(duì)分子邏輯門的種類及分子開關(guān)做了相關(guān)介紹。 Joachim等［12］還專門介紹了不同分子邏輯門的設(shè)計(jì)，這對(duì)后來(lái)的研究者在做分子邏輯門有關(guān)工作中有很大的幫助。

表1　幾種常用的布爾邏輯門對(duì)應(yīng)的真值表Tab.1　The truth table of Boolean logic gates

早在1993年，研究者們就已經(jīng)提出合成分子的邏輯門，同年，De Silva等［4］首次提出了分子邏輯門，他們是以H+、Na+分別作為輸入，以熒光作為輸出，基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）過(guò)程，依據(jù)不同的輸入，不同有機(jī)分子產(chǎn)生的光致熒光變化的不同來(lái)構(gòu)建單輸入的YES、NOT邏輯門或雙輸入的AND、OR門。此后，也構(gòu)建了其他類型的分子邏輯門，如XOR門和IMPLICATION［7］門，NOR門和INHIBIT［6］邏輯門等。這一方向的研究涌現(xiàn)了一批卓有成效的科學(xué)家，做出了許多重要的工作［13-14］。

Silva等［15］在2006年介紹了簡(jiǎn)單分子邏輯門從原始的基本邏輯操作發(fā)展到單輸入，雙輸入及三輸入的過(guò)程。宗國(guó)強(qiáng)等［16-17］先后報(bào)道了L-精氨酸蒽衍生物（化合物1）與三磷酸腺苷（ATP）的分子識(shí)別作用并構(gòu)建了一個(gè)雙輸入的NAND邏輯門，此后又利用化合物1與陽(yáng)離子（Cu2+）形成穩(wěn)定的配合物，會(huì)引起較大程度的熒光猝滅，從而根據(jù)化合物1的雙控?zé)晒忾_關(guān)性質(zhì)，構(gòu)建了基于雙熒光開關(guān)的NOR和OR分子邏輯門，通過(guò)OH-/H+和Cu2+/乙二胺四乙酸（EDTA）均能對(duì)化合物1的熒光強(qiáng)度進(jìn)行可逆性調(diào)控。在此基礎(chǔ)上，以化合物1水溶液作為起始狀態(tài)，以O(shè)H-和Cu2+為兩化學(xué)輸入，構(gòu)建了一個(gè)NOR型分子邏輯門；以1-Cu2+水溶液體系作為起始狀態(tài)，以H+和EDTA為兩化學(xué)輸入，構(gòu)建了一個(gè)OR型分子邏輯門。張關(guān)心等［18］基于分子邏輯門的概念以及其現(xiàn)狀做了簡(jiǎn)單的介紹。選用幾種邏輯門代表化合物（具有弱熒光），在其溶液中分別加入不同的物質(zhì)，會(huì)引起熒光強(qiáng)度的變化，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化模擬了不同的邏輯門。首先在一種由2個(gè)受體單元和一個(gè)熒光蒽基團(tuán)構(gòu)成的化合物中加入H+和Na+，并分別與2個(gè)受體同時(shí)作用，使其分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程被抑制表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)，對(duì)應(yīng)了一個(gè)雙輸入單輸出的AND邏輯門。根據(jù)此原理（熒光的變化）又分別模擬了AND門，NOT門，OR門，NOT門，XOR門和INHIBIT門。

2　DNA分子邏輯門

DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。每個(gè)核苷酸由一個(gè)脫氧核糖（戊糖）、一個(gè)磷酸和一個(gè)含氮堿基共三部分組成，不同的核苷酸區(qū)別在于堿基，共有兩類堿基：嘌呤類包括腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G），嘧啶類包括胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。核苷酸之間靠磷酸二酯鍵連接，即一個(gè)核苷酸的脫氧核糖的5'位碳原子上的磷酸基與相鄰的核苷酸的第3'位碳原子上的羥基結(jié)合，形成共價(jià)鍵，且該鍵是有方向性的。兩條DNA單鏈靠堿基對(duì)之間的氫鍵能夠反向結(jié)合在一起形成雙鏈，配對(duì)原則是：一條鏈的A（或T）與另一條鏈的T（或A）配對(duì)，中間含2個(gè)氫鍵；一條鏈的C（或G）與另一條鏈的G（或C）配對(duì)，中間含3個(gè)氫鍵。這也是DNA可用于構(gòu)建邏輯門的基礎(chǔ)之一。

按照工作原理劃分，DNA分子邏輯門主要有以下幾種類型：基于DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建邏輯門，基于堿基配對(duì)的DNA邏輯門，基于DNAzyme催化的邏輯門，基于適配子親和作用的邏輯門等等。這幾類DNA邏輯門在DNA計(jì)算中起著重要作用，也是目前DNA邏輯門研究的重點(diǎn)所在。

2.1基于DNA結(jié)構(gòu)變化的邏輯門

Elbaz等［19］利用DNA鑷子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了可重置的邏輯門。是通過(guò)pH誘導(dǎo)的DNA鑷子開放和關(guān)閉結(jié)構(gòu)變化而設(shè)計(jì)的邏輯門。通過(guò)改變酸性（pH=5.2）與中性（（pH=7.2）之間不斷循環(huán)，鑷子可以在開放與關(guān)閉之間互相轉(zhuǎn)換。由于pH的變化其實(shí)是H+，OH-濃度之間的相對(duì)變化，因此，以H+，OH-作為輸入信號(hào)，熒光強(qiáng)度作為輸出信號(hào)，便實(shí)現(xiàn)了SET-RESET邏輯門運(yùn)算。Liu等［20］還利用光控和pH變化，以富C結(jié)構(gòu)的核苷酸鏈構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的邏輯器件，實(shí)現(xiàn)了NAND邏輯功能。Huang等［21］構(gòu)建了基于編碼的DNA調(diào)控AgNCs的熒光，利用AgNCs作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器將DNA輸入轉(zhuǎn)化為熒光輸出信號(hào)，構(gòu)建了一系列的DNA邏輯（AND，OR，INHIBIT，XOR，NOR，XNOR，NAND）。Li等［22］設(shè)計(jì)了一個(gè)特殊的環(huán)狀的DNA，基于DNA鏈位移而構(gòu)建了一個(gè)三輸入的邏輯門。Hao等［23］研制了一系列基于三維DNA納米結(jié)構(gòu)的新型“DNA邏輯門”。這些邏輯門不僅能夠?qū)Σ煌妮斎胄盘?hào)產(chǎn)生響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的分子運(yùn)算，而且可以主動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物分子成像。特定的DNA序列可以自組裝成結(jié)構(gòu)規(guī)整的四面體結(jié)構(gòu)，在這些規(guī)整的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)中整合特定的DNA識(shí)別序列（如核酸適配體等），可以在輸入特定信號(hào)（如H+，ATP，Hg2+等分子和離子）時(shí)使DNA四面體結(jié)構(gòu)的構(gòu)型發(fā)生變化。在這種結(jié)構(gòu)中的特定位置修飾上能量轉(zhuǎn)移熒光分子，可以產(chǎn)生熒光的輸出信號(hào)?；谶@種設(shè)計(jì)，不僅可以實(shí)現(xiàn)“YES”，“NO”等邏輯判斷，并可以構(gòu)建出基本的邏輯門（AND，OR，INH，XOR）。這些邏輯門可以集成起來(lái)，還可以實(shí)現(xiàn)更為復(fù)雜的分子運(yùn)算（如半加法器）。此外，研究表明這種三維DNA納米結(jié)構(gòu)具有高的細(xì)胞穿透性、生物相容性及穩(wěn)定性［24］，因此這種三維DNA結(jié)構(gòu)的邏輯門可以進(jìn)入到活細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的一些化學(xué)分子（如ATP）產(chǎn)生特定的邏輯響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)的分子成像。這種基于三維DNA納米結(jié)構(gòu)的邏輯門為實(shí)現(xiàn)智能載藥系統(tǒng)提供了新的可能。

由于Ag+和Hg2+都是金屬離子，它們的廢棄物會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，并對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的健康威脅，因此快速而有效地檢測(cè)這些金屬離子是非常重要的。人們發(fā)現(xiàn)Ag+則可以與胞嘧啶（C）橋聯(lián)，而Hg2+可以與胸腺嘧啶堿基（T）形成橋聯(lián)。這些性質(zhì)可以幫忙人們?cè)O(shè)計(jì)出新的方法來(lái)檢測(cè)Ag+與Hg2+。Carell等［25］根據(jù)是否存在Hg2+和Ag+，從而造成某些堿基序列的錯(cuò)配，設(shè)計(jì)了“YES”“AND”以及“OR”三個(gè)邏輯門。Dingyi等［26］以及Willner等［27］也設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)Ag+和Hg2+的邏輯門。Guo等［28］也建立了一種熒光DNA IMPLICATION邏輯門，用于檢測(cè)Ag+和半胱氨酸與三苯甲烷染料或者G-四聯(lián)體的復(fù)合物。Li等［29］以及Zhang等［30］研究了富C和富T結(jié)構(gòu)的核苷酸，重點(diǎn)分析了Hg2+和Ag+作為輸入信號(hào)，基于 T-T，C-C錯(cuò)配建立了雙輸入邏輯門（OR，AND，NAND，XOR，NOR，INHIBIT）。

石墨烯的問(wèn)世引起了全世界的研究熱潮。它非同尋常的導(dǎo)電性能以及其電催化活性等一系列優(yōu)點(diǎn)，它有望在現(xiàn)代電子科技領(lǐng)域引發(fā)一輪革命。Liu等［31］就報(bào)道了利用不同熒光素標(biāo)記的ssDNA可吸附在氧化石墨烯（GO）表面，發(fā)生熒光猝滅，而當(dāng)加入目標(biāo)DNA時(shí)，通過(guò)和目標(biāo)DNA雜交，形成的dsDNA從GO表面解吸，產(chǎn)生熒光，依據(jù)此原理，他們?cè)O(shè)計(jì)了“AND”和“OR”邏輯門。而Tang等［32］通過(guò)控制GO和DNA的濃度，使得dsDNA也吸附在GO表面（DNA雙螺旋局部發(fā)生了變形），從而使用GO-dsDNA作為載體平臺(tái)報(bào)道了一種概念上新的“AND”邏輯門。此后Xie等［33］也借助GO的這種特性，選擇了富含C堿基的ss-DNA1鏈（末端標(biāo)記有熒光素）和ss-DNA2，當(dāng)不存在Ag+時(shí)，ssDNA吸附在GO上，熒光猝滅，而當(dāng)存在Ag+時(shí)，Ag+可與C形成C-Ag+-C結(jié)構(gòu)，從而熒光增強(qiáng)，而Cys又可以打開C-Ag+-C結(jié)構(gòu)，熒光猝滅，因此以Ag+和Cys為輸入，熒光強(qiáng)度作為輸出，構(gòu)建了INHIBIT邏輯門。

2.2基于DNA堿基配對(duì)原則的邏輯門

基于DNA堿基配對(duì)的邏輯門是一類很常見(jiàn)，也很重要的邏輯門。Baytekin和Akkaya在2000年首次報(bào)道［5］，他們選用能和 DNA中的A-T堿基對(duì)發(fā)生作用的一種熒光染料（DAPI），使其發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移；他們根據(jù)A與T堿基配對(duì)時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生變化這一原理，以熒光染料作為邏輯元件，A和T堿基作為輸入，熒光信號(hào)作為輸出，構(gòu)建了NAND和TRANSFER邏輯門。此后，各種此類邏輯門不斷涌現(xiàn)［28，34-37］。

2003年，Ghadiri等［34］通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA分子構(gòu)建分子邏輯門的方法構(gòu)建了AND，NAND 和INHIBIT三種光學(xué)邏輯門。AND門是以一個(gè)3'端標(biāo)記有熒光素的DNA片斷1作為基本元件，DNA 2（與DNA1完全互補(bǔ)配對(duì)）為輸入1，輸入2是一種熒光染料（與DNA雙鏈的小溝結(jié)合）。利用DNA分子之間的配對(duì)作用以及多熒光分子之間的Foster共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，激發(fā)熒光素發(fā)出熒光，從而構(gòu)建邏輯門操作。NAND是與門與非門的結(jié)合，在電子邏輯門中，AND門的輸出被送到一個(gè)反轉(zhuǎn)器，使所有的0輸出變成1，1輸出變成0。而且為了展示這種DNA邏輯門可以用來(lái)排布成邏輯電路，Ghadiri等將AND和NAND結(jié)合起來(lái)設(shè)計(jì)了INHIBIT門，即產(chǎn)生一個(gè)邏輯門的輸出傳遞到下一個(gè)邏輯門作為輸入。

除了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)和堿基配對(duì)可以用于DNA邏輯門的構(gòu)建以外，特定的核酸結(jié)構(gòu)也是非常有用的構(gòu)造元件。核酶（Ribozyme）和核酸配體（Aptamer）是現(xiàn)在受到廣泛關(guān)注的核酸結(jié)構(gòu)。

2.3基于DNAzyme的邏輯門

DNA核酶很特殊，具有錘頭狀結(jié)構(gòu)，一方面它本身屬于DNA，另一方面，它又具有酶的功能，可以水解DNA?；贒NA分子的嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，可以設(shè)計(jì)出針對(duì)不同輸入產(chǎn)生邏輯響應(yīng)不同的結(jié)構(gòu)，因此這些核酸類酶可以用來(lái)構(gòu)建DNA邏輯門。

當(dāng)核酸類酶結(jié)合特定的寡核苷酸時(shí)，它們的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，激活其酶的活性，切割修飾熒光染料的底物。由于熒光染料易檢測(cè)而且可在很低的濃度下檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，所以被很多研究者所青睞，切割反應(yīng)是否發(fā)生就可以利用熒光強(qiáng)度的大小來(lái)判斷。

Stojanovic［38］是利用核酶構(gòu)造分子邏輯門的先驅(qū)之一。2002年他利用催化DNA裂解的不同DNAzyme作為邏輯元件，首次報(bào)道了一類基于DNAzyme的邏輯門，構(gòu)建了多種基本的邏輯門，即單輸入的 YES、NOT門和雙輸入的 AND、INHIBIT、XOR門。此后，更多類型的DNAzyme被用來(lái)構(gòu)建各種DNA邏輯門［39-43］。Zhang等［43］就報(bào)道了一種金屬離子依賴的DNAzymes作為功能化的核酸構(gòu)建了一系列的DNA邏輯門，雜交的兩種離子依賴的DNAzymes基質(zhì)會(huì)阻止HRP模仿的DNAzymes自組裝到hemin/G-四連體結(jié)構(gòu)，當(dāng)存在Pb2+或Cu2+，激活各自分離的DNAzymes，再當(dāng)加入hemin時(shí)，會(huì)形成hemin/G-四連體-HRP-模仿DNAzymes，會(huì)催化TMB形成有顏色的TMB+，就能肉眼觀察到顏色的變化并檢測(cè)到其吸光度值的增大，輸出1，根據(jù)此原理，構(gòu)建了OR、AND、INHIBIT邏輯門。Zhu等［44］建立了一個(gè)新的基于DNAzyme的非標(biāo)記的MCB，和基于G-四聯(lián)體的形成與離解而構(gòu)建了一系列非標(biāo)記的比色 DNA邏輯門（NOT，NOR，IMPLICATION，AND，OR，INHIBIT）。Chen［45］報(bào)道了一系列的有關(guān)酶放大的邏輯門（OR，AND，NOR，NAND）同時(shí)檢測(cè)小分子和蛋白質(zhì)，基于靶誘導(dǎo)自組裝分裂適配子片段或者靶誘導(dǎo)完整適配子構(gòu)象變化。對(duì)于OR和AND邏輯運(yùn)算，分裂的適配體片段作為分子識(shí)別部分，而NOR和NAND邏輯運(yùn)算，完整的適配體作為分子識(shí)別部分，因此以ATP和thrombin作為輸入，分裂/完整的適配體作為分子識(shí)別元素，生物素作為示蹤物，SA-HR作為報(bào)告分子，分子邏輯門通過(guò)形成放大電信號(hào)作為輸出而構(gòu)建邏輯門。這個(gè)邏輯體系也可用于人血清中的ATP和thrombin的檢測(cè)。也有人［46］在電極上沉積HAuCl4，再自組裝上巰基修飾的DNA與電極上有氧化還原標(biāo)記連接的適配體，當(dāng)加入目標(biāo)物 （ATP或thrombin），會(huì)使連接氧化還原標(biāo)記的適配體與目標(biāo)物結(jié)合，從而檢測(cè)標(biāo)記物信號(hào)來(lái)構(gòu)建AND型邏輯門。這種方法也可用來(lái)同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)與小分子。2.4基于核酸適配體的邏輯門

DNA適配子能夠與目標(biāo)配體特異性的結(jié)合，而在與配體作用的過(guò)程中，存在綁定與釋放兩種狀態(tài)，這兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)換就可以用來(lái)創(chuàng)建一類新的邏輯門。Yoshida等［47］報(bào)道的一種基于DNA適配體的邏輯門，利用其DNA底物與其適配體會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而設(shè)計(jì)了 “AND和OR邏輯門”。

如圖1所示［48］，Itamar Willner等報(bào)道了一種采用雙功能適配子能夠同時(shí)檢測(cè)多種分析物的腳手架，以此來(lái)創(chuàng)建DNA邏輯門。他們是將AMP適配子與cocaine適配子連在一起，組成雙功能適配子，再與包含四極子 DNAzyme的blocker鏈進(jìn)行雜交，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入cocaine或AMP時(shí)，由于配體與適配子之間的親和作用，使得雙鏈結(jié)構(gòu)打開，釋放出DNAzyme序列，折疊成四極子結(jié)構(gòu)并和血紅素作用，催化H2O2氧化ABTS底物，引起吸光度變化。由于AMP和cocaine都會(huì)導(dǎo)致輸出信號(hào)變化，因此可構(gòu)建一個(gè)OR型邏輯門。

圖1　基于AMP和cocaine雙功能適配子的OR邏輯門Fig.1　based on AMP and cocaine bifunctional aptamer OR logic gates

Zhu等［49］報(bào)道了適體分子信標(biāo)（MAB）調(diào)節(jié)DNA鏈置換反應(yīng)，這個(gè)鏈置換的模式可以轉(zhuǎn)換ATP的輸入到一個(gè)DNA鏈的輸出信號(hào)。如圖2所示，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的M鏈?zhǔn)钦麄€(gè)裝置的主要組成部分，粉色的環(huán)狀部分是ATP適配子的序列，它主要是接收輸入ATP的信號(hào)，M的紅色部分用于綁定輸出鏈S形成S-M復(fù)合體，如果綠色的部分暴露在溶液中，R鏈將會(huì)取代S-M復(fù)合體中的S鏈，從而形成R-M復(fù)合體。所以當(dāng)加入ATP，小分子就會(huì)在環(huán)部分綁定到它的適配子上；而加入CABA，CABA與粉色部分雜交，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈部分也會(huì)打開，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，而R與M又雜交取代S，當(dāng)再加入兩個(gè)富含G堿基的片段G1 和G2捕獲上面的輸出鏈，當(dāng)只有S存在時(shí)，G1，G2會(huì)聚集并與S鏈雜交形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)與PPIX綁定從而提高它的熒光強(qiáng)度，依據(jù)此原理可構(gòu)建DNA邏輯電路。

圖2　適體分子信標(biāo)調(diào)整DNA鏈位移將小分子轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA邏輯輸出Fig.2　Molecular aptamer beacon tuned DNA strand displacement to transform small molecules into DNA logic outputs.Different functional domains are plotted in different colors

邏輯門構(gòu)建的生物傳感器還可以與藥物釋放連接起來(lái)，Kolpashchikov和Stojanovic［50］曾利用控制藥物釋放而設(shè)計(jì)了一種邏輯門。這種邏輯門包括計(jì)算單元和藥物釋放單元，可以通過(guò)熒光信號(hào)來(lái)判斷是否存在疾病標(biāo)記物并進(jìn)行藥物定位釋放。疾病標(biāo)記物為輸入信號(hào)，藥物為輸出信號(hào)。當(dāng)疾病標(biāo)記物存在時(shí)，邏輯門會(huì)判斷是否將藥物釋放出來(lái)，則可以在適當(dāng)?shù)陌形稽c(diǎn)產(chǎn)生藥效，可以起到定向給藥的作用。這種給藥方式是一種智能的藥物釋放方式。Benenson等［51］則提出用DNA計(jì)算的方式：輸入信號(hào)（鑒定疾病標(biāo)志物的水平）—計(jì)算部分（判斷是否有疾病發(fā)生）—輸出部分（控制藥物的釋放），選擇性地控制釋放基因藥物來(lái)控制致病基因的表達(dá)水平。

3　結(jié)語(yǔ)

隨著分析科學(xué)的不斷發(fā)展，目前的分析檢測(cè)工作越來(lái)越多的是面對(duì)多目標(biāo)物的實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)的任務(wù)。因此，多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)既是分析科學(xué)的重要研究任務(wù)之一，也是醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)境以及生命科學(xué)領(lǐng)域的研究任務(wù)對(duì)分析科學(xué)所提出的要求。多目標(biāo)物同時(shí)分析檢測(cè)，不僅可以部分解決目前所面臨的許多分析檢測(cè)任務(wù)，而且也為建立新的智能分析檢測(cè)系統(tǒng)如芯片實(shí)驗(yàn)室等提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。在多目標(biāo)物同時(shí)分析檢測(cè)方面，尤其是建立智能化、自動(dòng)化的分析檢測(cè)系統(tǒng)方面，分子邏輯門無(wú)疑則扮演著重要的角色。分子邏輯門不僅可以很方便地實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)同時(shí)分析檢測(cè)，又可以建立簡(jiǎn)便快速、智能化的分析檢測(cè)系統(tǒng)。而針對(duì)DNA為目標(biāo)物的分子邏輯門技術(shù)，不僅具有上述特點(diǎn)，而且是構(gòu)建新一代計(jì)算機(jī)—DNA計(jì)算機(jī)的基石［52-54］。

目前，以半導(dǎo)體材料和集成電路為基礎(chǔ)的計(jì)算機(jī)技術(shù)由于其集成度已接近理論極限，摩爾定律的指導(dǎo)作用將不在有效，限制了計(jì)算機(jī)科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。余洋等［55］從DNA邏輯門的分子基礎(chǔ)﹑DNA邏輯門和DNA計(jì)算機(jī)的模型及雛形等幾個(gè)方面進(jìn)行了綜述介紹，并對(duì)DNA計(jì)算機(jī)的發(fā)展前景以及其實(shí)用化所面臨的各種技術(shù)挑戰(zhàn)做了介紹?？茖W(xué)家們已經(jīng)研究出一些具有邏輯運(yùn)算功能的DNA體系，然而此類體系基本都是基于光學(xué)識(shí)別、檢測(cè)系統(tǒng)，在開發(fā)應(yīng)用到計(jì)算機(jī)上具有一定的局限性［56-57］。因此，科學(xué)家正在積極開發(fā)構(gòu)建新型計(jì)算機(jī)，DNA計(jì)算機(jī)被認(rèn)為是未來(lái)計(jì)算機(jī)科技發(fā)展的主要方向，并可能會(huì)應(yīng)用到實(shí)際問(wèn)題當(dāng)中［3，58-61］。但是由于DNA分子計(jì)算在一些重要研究領(lǐng)域，尤其是在數(shù)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)顯示出巨大應(yīng)用潛力，目前已成為多學(xué)科交叉的研究前沿和熱點(diǎn)。也被多數(shù)研究者所重視，隨著科技的不斷進(jìn)步，新技術(shù)，新理論的突破將為邏輯門的研究帶來(lái)新的發(fā)展［60-61］。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（21365016）*通信聯(lián)系人，E-mail：jinxy588@163.com

DNA detection technology based on molecular logic gates

Meng Li-jun，Xu Kai-ge，Zhang Di，Jin Xiao-yong*
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Ningxia Engineering Research Center of Natural Medicines，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Abstract：DNA have accurate molecular recognition ability and strong signal storage capacity.Using the biological characteristics of DNA molecules to construct molecular level of logic gates and realize the logic operation is an emerging field of computer science and molecular biology in recent years，caused the wide attention of researchers. This article describes the special structural characteristics or property the research progress of DNA molecular logic gate，such as use of DNA molecules，base pairing，DNAzyme activity and aptamer activity.

Key words:molecular logic gates；DNA；DNAzyme；aptamer；review