玉米秸稈連續(xù)還田對土壤微生物群落組成的影響

何亞玲，崔慧珍，王兵兵，馬 琨

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學西北土地退化與生態(tài)恢復國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川 750021）

秸稈還田是培肥地力，保持土壤養(yǎng)分平衡，提高土壤肥力最有效的措施和途徑[1]。通過秸稈粉碎還田、深翻等方式，可以加快秸稈在土壤中腐熟速度，增加土壤有機質(zhì)與速效養(yǎng)分，不斷提高耕地質(zhì)量[2]。相關(guān)研究認為，土壤微生物群落在作物秸稈的腐解中起著決定性作用，土壤微生物群落會對秸稈腐解過程作出響應[3]。土壤微生物能夠提高土壤中無機物的有效性，促進植物根系對養(yǎng)分的吸收，提高土壤質(zhì)量，改善土壤環(huán)境[4]。

長期秸稈還田可改善土壤質(zhì)地，提高土壤固碳能力，增加作物產(chǎn)量和土壤微生物活性[5-6]；Yang等[7]認為長期秸稈還田可形成更健康的土壤微生物群落。玉米秸稈還田后，土壤微生物對碳源的利用能力提高，微生物群落多樣性及均勻度增加[8]。崔慧珍等[9]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)玉米秸稈還田后，以磷脂脂肪酸（PLFAs）表征的土壤微生物生物量在秸稈還田后明顯增加；水稻秸稈還田后，土壤中碳源種類產(chǎn)生變化，細菌優(yōu)勢種群及相應豐度改變[10]；劉驍蒨等[11]認為，水稻秸稈覆蓋還田配施適量的氮磷鉀肥能顯著提高土壤微生物生物量碳、氮和土壤的細菌多樣性；Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田較無機肥處理的土壤中有更多的微生物類群。盡管不同作物秸稈還田管理后，土壤有機碳種類變化不同，但均增加了土壤微生物的多樣性。因此，長期秸稈還田對土壤微生物的生存環(huán)境產(chǎn)生了一定的影響，有助于形成穩(wěn)定的土壤微生物群落，對改善土壤肥力及土壤結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，除氣候、土壤類型等因素之外，秸稈還田量是影響土壤微生物群落組成的一個重要因素。目前，有關(guān)秸稈還田后土壤微生物群落變化的研究，多集中于某一季作物的秸稈還田對土壤微生物群落的影響方面。因此，開展不同秸稈還田量的試驗，研究連續(xù)玉米秸稈還田后，土壤微生物群落組成的變化特征及其與土壤理化性狀間的相互關(guān)系,以期為提高該地區(qū)土壤肥力、促進土壤養(yǎng)分良性循環(huán)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于寧夏同心縣河西鎮(zhèn)農(nóng)場村（37°9′34″N，105°48′2″E）。海拔1 310 m，年平均降水量277 mm，平均蒸發(fā)量為2 330 mm，平均氣溫8.7℃。土壤類型為灰鈣土，土壤質(zhì)地為砂質(zhì)壤土。2013年秋季，開始該試驗前土壤基本理化性狀為：pH 8.26；全鹽0.28 g/kg；有機質(zhì)9.2 g/kg；全氮0.54 g/kg；堿解氮41 mg/kg；全磷0.83 g/kg；有效磷41.5 mg/kg；全鉀20.2 g/kg；速效鉀216 mg/kg；緩效鉀1 014 mg/kg；陽離子代換量9.3 cmol/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗開始于2013年秋季，每年秋季在玉米收獲后，將秸稈粉碎成3～5 cm的小段，深耕翻入0～40 cm土層。供試玉米品種為先玉335，播種密度為6 500株/667 m2，采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)秸稈還田量分別為0 t/hm2（M0）、0.3 t/hm2（M200）、0.6 t/hm2（M400）、0.9 t/hm2（M600）、1.2 t/hm2（M800）5個處理，3次重復，共15個小區(qū)，小區(qū)面積為60 m2（4 m×15 m）。玉米全生育期氮肥（N）年平均施用量為26 kg/667 m2，苗期追施60%，抽穗期追施30%，灌漿期追施10%；磷肥（P2O5）12.5 kg/667 m2和鉀肥（K2O）2.5 kg/667 m2，苗期深施。

1.3 取樣方法

2019年為連續(xù)試驗的第6年，在當年6月18日（大喇叭口期）、9月22日（成熟期），按5點取樣法，采集玉米行間0～20 cm土層土壤樣本，同一小區(qū)的樣本均勻混合為1個樣本，各小區(qū)土壤樣本獨立。土樣用冰盒保鮮帶回實驗室，過1 mm篩，一部分低溫儲存于-40℃冰箱，用于土壤微生物群落測定；一部分低溫儲存于-80℃冰箱，用于微生物多樣性分析；剩余樣品自然風干，用于土壤理化性狀測定。

1.3.1 土壤理化性質(zhì)土壤pH的測定采用電位計法，土壤總碳和全氮采用碳氮分析儀（Elementar Vario MAX）測定，全磷的測定采用HClO4-H2SO4消煮法，堿解氮的測定采用堿解氮擴散法，速效磷的測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀的測定采用NH4OAc浸提-火焰光度法，含水量的測定采用烘干法[13]。

1.3.2 土壤微生物群落組成的測定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性采用磷脂脂肪酸法（PLFA），參照魏?；鄣萚14]的方法，稱取相當于4 g干土質(zhì)量的鮮土于棕色玻璃瓶，加磷酸緩沖液，甲醇∶氯仿（2∶1）混合液105 mL，氯仿和無菌超純水混勻振蕩，黑暗培養(yǎng)18～24 h，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮和SPE硅膠柱分離磷脂脂肪酸，通過Agilent 7890B型氣相色譜儀，MIDI Sherlock脂肪酸圖譜微生物鑒定系統(tǒng)分析待測樣品的成分，內(nèi)標為正十九烷酸甲酯。

1.3.3 宏基因組測序流程首先，采用CTAB方法對土壤樣本的基因組DNA進行提取[15]，隨后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物；使用New England Biolabs公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer為酶和緩沖液；使用高效和高保真的酶進行PCR擴增。接著，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，割膠回收目標條帶。最后，委托天津諾禾致源生物科技有限公司，使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，文庫檢測合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，Origin 2019繪圖，利用DPS 7.05單因素方差分析進行顯著性檢驗，Canoco 5.0進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈連續(xù)還田在玉米關(guān)鍵生育時期對土壤微生物群落PLFA含量的影響

連續(xù)秸稈還田6年后，隨秸稈還田量的變化，土壤微生物群落PLFA組成在玉米關(guān)鍵生育時期對玉米秸稈還田產(chǎn)生了不同的季節(jié)性響應特征（表1）。6月和9月的土壤樣品分析結(jié)果顯示，以PLFAs標記的細菌、真菌、放線菌、叢枝菌根真菌的脂肪酸含量，整體上表現(xiàn)為隨秸稈還田量的增加而升高。與對照（M0）相比，M200在玉米大喇叭口期時（6月），土壤中細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、叢枝菌根真菌PLFA含量有顯著增加（P<0.05），分別較M0提高了75.31%、59.38%、87.76%、75.00%；M800在玉米大喇叭口期時（6月），土壤中革蘭氏陰性菌、放線菌、真菌、叢枝菌根真菌的PLFA含量均有顯著增加（P<0.05），較對照分別增加了71.43%、55.00%、109.09%和50.00%，但不同秸稈還田量處理間差異不著性（P>0.05）。

表1 秸稈連續(xù)還田對玉米不同生育時期對應土壤微生物群落PLFA質(zhì)量比的影響 μg/g

玉米成熟期時（9月末），土壤主要微生物群落的PLFAs含量表現(xiàn)出與玉米大喇叭口期對應土壤類似的變化趨勢，但不同秸稈還田量下，土壤細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌、真菌、叢枝菌根真菌均與對照處理間有顯著增加（P<0.05）；與M200處理相比，當秸稈還田量為M800時，細菌、放線菌、叢枝菌根真菌間均有顯著增加（P<0.05）；與對照（M0）相比，M800在玉米成熟期時對應土壤中革蘭氏陰性菌、放線菌、真菌、叢枝菌根真菌的PLFA含量均有顯著增加（P<0.05），較對照分別增加了97.18%、77.14%、103.70%和133.33%，與玉米大喇叭口期對應土壤微生物的PLFA相比，革蘭氏陰性菌、放線菌、叢枝菌根真菌分別提高了25.75%、22.14%、83.33%?？梢?，連續(xù)秸稈還田6年后，在對應作物的主要生育時期、受還田量的影響，以PLFAs含量表征的土壤微生物群落組成會發(fā)生顯著變化。

土壤真菌/細菌PLFA含量的比值可用來表征2類微生物種群相對豐度的變化狀況，比值越高說明農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)[16]。革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌PLFA含量的比值可以表征土壤營養(yǎng)脅迫程度，G+/G-越小，土壤質(zhì)地越好[17]。由圖1可見，隨秸稈還田量的增加，土壤真菌/細菌PLFA含量比值在玉米大喇叭口期（6月）呈升高趨勢；M600、M800與對照M0及M200間有顯著差異（P<0.05），但玉米成熟期（9月），土壤真菌/細菌PLFA含量比值在各處理間并無顯著差異（P>0.05）。在玉米大喇叭口期、成熟期，對應各處理土壤間的G+/G-脂肪酸含量均無顯著差異（P>0.05）?？梢?，受不同用量玉米秸稈連續(xù)還田的影響，土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性仍然較好；高還田量下，有促進生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性增強的趨勢，但不會顯著影響革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌的比值。

圖1 秸稈連續(xù)還田對土壤真菌/細菌（F/B）、革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌PLFA含量比值（G+/G-）的影響

2.2 玉米秸稈還田對土壤細菌群落相對豐度的影響

不同秸稈還田量下土壤細菌相對豐度在門、屬水平下均存在一定的差異。由圖2（a）可知，在門分類水平上，土壤Proteobacteria（變形菌門）和Acidobactera（酸桿菌門）細菌為優(yōu)勢菌群，各處理的相對豐度為47.05%～50.47%。隨著玉米秸稈還田量的增加，各處理間變形菌門的相對豐度無顯著差異，但酸桿菌門相對豐度呈增加趨勢，與對照（M0）相比，M800處理下土壤酸桿菌門的相對豐度增加了13.83%，有顯著差異（P<0.05）。由圖2b可知，在屬分類水平上，土壤細菌相對豐度較高的的4個類群分別為Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌屬）、Pedosphaera（叉絲單囊殼屬）、Gemmatirosa和Gemmatimonas（芽單胞菌屬），相對豐度達到總豐度的3.90%～4.73%，但隨著秸稈還田量的次序增加，土壤細菌優(yōu)勢屬的相對豐度有逐步逐步下降的趨勢；與M0相比，在秸稈還田量為M800時，土壤芽孢桿菌屬相對豐度較M0降低了17.65%，2個處理間有顯著差異（P<0.05）。不同秸稈還田量處理間，土壤鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、叉絲單囊殼屬相對豐度間并無顯著差異（P>0.05）?？梢?，秸稈連續(xù)高量還田可以影響基于門、屬水平下的土壤細菌群落組成相對豐度。

圖2 玉米秸稈連續(xù)還田對基于門（a)、屬（b)水平上土壤細菌相對豐度的影響

2.3 玉米秸稈連續(xù)還田對土壤細菌群落組成的影響

不同秸稈還田處理下，基于宏基因測序下35個相對豐度較高的物種聚類熱圖（圖3）表明，玉米秸稈還田后土壤微生物群落的物種組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。與M0相比，玉米秸稈還田后增加了變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度；顯著降低了奇古菌門（Thaumarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、毛霉門（Mucoromycota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠菌門（Chlorobi）等微生物類群的相對豐度（P>0.05）。當秸稈還田量為M200時，硝棘菌門（Nitrospinae）、降氨酸菌門（Candidatus Aminicenantes）、河床菌門（candidate division Zixibacteria）、護微菌門（Candidatus Tectomicrobia）、懶桿菌門（Ignavibacteriae）、藍菌門（Cyanobacteria）等微生物類群相對豐度顯著降低（P<0.05），擬桿菌門的相對豐度顯著增加（P<0.05）。

圖3 玉米秸稈連續(xù)還田后土壤細菌群落組成聚類熱圖分析

2.4 玉米秸稈連續(xù)還田對土壤細菌群落分布影響的PCA分析

主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）結(jié)果表明（圖4），第一排序軸（32.19%）和第二排序軸（14.11%）可在累積貢獻率46.30%上揭示不同用量秸稈連續(xù)還田對土壤細菌群落組成的差異。圖4中每個點代表一個樣品，不同顏色代表不同的處理組，樣點之間距離遠近及空間分布離散程度，可反映樣品細菌群落組成的相似度或差異性大小。盡管各處理下，土壤樣點分布較為分散，但秸稈還田后各處理土壤樣點與對照處理（M0）土壤樣點在第一排序軸上分開。此外，M400、M600和M800處理的土壤樣品空間分布聚集度提高，組間距離也較近。整體上，秸稈還田可影響土壤細菌群落的組成，但秸稈還田量在200～800 kg/666.7 m2時，土壤細菌群落組成的相似性仍較高。

圖4 玉米秸稈連續(xù)還田對土壤細菌群落分布影響的PCA分析

2.5 土壤主要細菌類群與土壤理化性狀間的相互關(guān)系

第一主軸（RDA1）和第二主軸（RDA2）累計解釋總方差的75.36%（圖5a），土壤主要微生物類群與土壤理化性質(zhì)間有較好的相關(guān)性。真菌、細菌、放線菌的PLFA含量與土壤速效鉀、速效磷、全磷、全氮、堿解氮、有機質(zhì)均呈正相關(guān)，與pH呈負相關(guān)?；陂T水平上土壤細菌群落相對豐度與土壤理化性狀間的相互關(guān)系在第一主軸（RDA1）和第二主軸（RDA2）累計解釋變量為27.29%（圖5a），蒙特卡羅檢驗表明，全氮（P=0.006）、堿解氮（P=0.008）是影響土壤主要微生物PLFA含量變化的主要因素；冗余分析結(jié)果表明，土壤總PLFAs量、細菌、真菌和放線菌PLFAs量與土壤全氮和堿解氮相關(guān)性較強。

圖5 土壤微生物PLFA含量、土壤細菌群落相對豐度與土壤理化性狀間相互關(guān)系的冗余分析

土壤中擬桿菌門、酸桿菌門、變形菌門細菌相對豐度與土壤有機質(zhì)、全氮、堿解氮呈正相關(guān)；芽單胞菌門、綠彎菌門、疣微菌門、放線菌門等與pH、全磷呈正相關(guān)。但蒙特卡羅檢驗表明，只有土壤全氮與土壤細菌群落相對豐度間的相關(guān)性達到顯著水平，土壤全氮（P=0.04）是驅(qū)動不同秸稈量連續(xù)還田下土壤細菌群落組成相對豐度發(fā)生變化的主要驅(qū)動因子。

3 討論

3.1 秸稈連續(xù)還田對玉米不同生育時期下對應土壤微生物PLFA的影響

連續(xù)秸稈還田6年后，不同秸稈還田量下對應土壤微生物PLFAs含量均高于對照（M0），高量秸稈還田與對照間存在顯著差異。于寒等[18]的研究證實，秸稈還田為微生物提供了豐富的碳源和氮源，促進了微生物的生長和繁殖，長期還田（15年）更能顯著提高微生物生物量；王偉華等[19]的研究表明，長期秸稈還田直接調(diào)節(jié)和優(yōu)化了土壤C/N，為土壤微生物的生長繁殖提供更多的能源、養(yǎng)分及適宜的土壤環(huán)境，導致土壤中微生物PLFAs含量升高，本文的研究結(jié)果與之一致。

試驗中，隨作物生育進程的變化，在玉米成熟期對應土壤樣本中的土壤微生物PLFAs含量明顯高于玉米大喇叭口期。分析認為，隨秸稈還田時間的延長，秸稈的腐熟程度越高，微生物所能利用的有機碳含量越高，更有利于土壤微生物獲得養(yǎng)分，并保護土壤微生物成分，如構(gòu)成土壤微生物生物量大部分的細菌和真菌[20]。相關(guān)研究認為，以PLFAs表征的土壤微生物生物量隨著干旱的加劇而降低，在潮濕、低溫的環(huán)境下較高[21-22]。分析認為，玉米大喇叭口期是作物的需水高峰期，植物對水分的需求量極高，因此可能導致土壤中水分的迅速下降。由于研究區(qū)域的土壤水分限制，反而會導致土壤微生物的競爭作用加劇，可能是以PLFAs表征的土壤微生物總生物量在大喇叭口期間對應土壤樣本中降低的主要原因。

真菌和細菌是土壤中2類重要的微生物，真菌/細菌的比值會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。試驗中，連續(xù)6年不同秸稈還田量下土壤微生物真菌/細菌比值在大喇叭口期對應土壤樣本中的差異顯著，在成熟期無明顯差異。這說明，隨秸稈還田量的增加，更有利于促進真菌的生長，但這與Bardgett等[23-24]人的研究報告中認為，高土壤肥力和養(yǎng)分有效性有利于細菌而非真菌的研究不一致，分析認為，秸稈還田條件下，土壤微生物群落的變化，可能并不能完全歸因于資源供應的數(shù)量差異。Christophe的研究證實，秸稈資源的質(zhì)量差異可使土壤細菌向真菌的轉(zhuǎn)變[24]。此外，由于土壤叢植菌根真菌會向宿主轉(zhuǎn)移大量的礦物質(zhì)元素[25]。因此，在菌根真菌寄主植物玉米后，土壤叢植菌根真菌會消耗土壤養(yǎng)分[24]。而玉米大喇叭口期正是玉米對土壤養(yǎng)分需求的最大效率期，其較成熟期對土壤養(yǎng)分的耗養(yǎng)更大，因此，更易引起土壤微生物菌群的變化，而導致真菌/細菌的比值出現(xiàn)差異。與真菌/細菌比值變化不同的是，秸稈還田后對應各秸稈處理土壤間的G+/G-脂肪酸含量在玉米大喇叭口期、成熟期均無顯著差異，但土壤G+、G-的PLFAs含量較M0處理均有顯著差異，且隨秸稈還田量增加而增加。崔慧珍等[9]研究也發(fā)現(xiàn)，盡管G+/G-在各處理間無顯著性差異，但G-較G+所占細菌總磷脂脂肪酸含量比例大，本研究結(jié)果與之一致。徐學池等[26]的研究也證實了秸稈還田能夠提高革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生物量，主要是因為G-對土壤環(huán)境的敏感度高，在富營養(yǎng)環(huán)境中生長速度高于G+的緣故。

3.2 秸稈連續(xù)還田對土壤細菌群落組成的影響

土壤細菌群落組成的改變是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要原因[27]。本試驗中，在門水平上，土壤變形菌門和酸桿菌門細菌為土壤優(yōu)勢菌群，這與前人[28]研究結(jié)果基本一致。在秸稈還田處理土壤中，變形菌門相對豐度最高，其次為酸桿菌門。由于大多數(shù)變形菌門細菌是營兼性或者專性厭氧生活，因此，變形菌門偏好干旱型土壤環(huán)境[29-30]。試驗中，較M0相比，秸稈還田下變形菌門相對豐度更高，但不同秸稈還田量下土壤變形菌門無明顯差異，高秸稈還田量顯著增加了酸桿菌門的相對豐度。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)，與秸稈不還田相比，秸稈還田處理顯著提高了土壤變形菌門的相對豐度，但各秸稈還田梯度間土壤變形菌門的相對豐度變化無規(guī)律性；李妍[32]認為隨秸稈還田量的增加，很大程度上增加了土壤的碳氮含量，使土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，促進了酸桿菌門的繁殖。此外，有研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌具有許多編碼纖維素酶和半纖維素分解酶的基因[33]。因此，隨秸稈還田量的增加，土壤中需要被分解的高纖維素含量的秸稈越多，所施環(huán)境壓力越大，促進了酸桿菌門的繁殖。

許多研究已經(jīng)證實了土壤因素對土壤細菌群落組成的重要性[34]。在本研究中，土壤全氮和堿解氮含量是長期秸稈還田后影響土壤主要微生物PLFAs含量變化的主要因素，而土壤全氮是影響土壤細菌群落相對豐度的顯著因子。任萬軍等[35]研究表明，秸稈的利用和活躍的土壤微生物活動，可以有效提高土壤有全氮、堿解氮的含量。在土壤堿解氮含量較高的條件下，土壤變形菌門的相對豐度才較高[36]。靳玉婷等[37]認為，土壤細菌包含多種代謝種類，且廣泛參與了土壤氮元素的生物化學循環(huán)。如變形菌門中的α-變形菌中較多的為固氮菌，在固氮菌的作用下，游離的氮素能被植物吸收利用，同時改變了土壤中氮素的含量，進而影響了土壤細菌群落的組成。邱文靜等[38]研究表明，固氮菌是土壤細菌類群中的重要組成部分，秸稈還田顯著改變了固氮菌群落豐富度，提高了固氮菌群落的多樣性，全氮能夠改變固氮菌群落組成。這可能是土壤全氮影響細菌群落相對豐度的主要原因。

4 結(jié)論

玉米秸稈連續(xù)還田改變了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成，土壤微生物的PLFA含量在玉米不同生育時期具有明顯的變化特征；土壤變形菌門和酸桿菌門細菌是土壤優(yōu)勢菌門；土壤全氮、堿解氮是影響土壤主要微生物PLFA含量變化的主要因素；土壤全氮也是影響土壤細菌群落變形菌門、擬桿菌門等相對豐度變化的主導因子。