聚乙二醇誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合的研究進(jìn)展

劉瑞芳, 王傲澤，陳 秋，王藝偉,張晗妍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100; 2.富平縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局)

1 細(xì)胞融合技術(shù)的重要性

細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是在自然條件或人工誘導(dǎo)下，兩個(gè)及以上的細(xì)胞或原生質(zhì)體發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合、核融合形成雙核或多核細(xì)胞的過程。早在19世紀(jì)30年代，Muller就觀察到腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)自發(fā)融合產(chǎn)生多核細(xì)胞。自20世紀(jì)50年代，短短30年間，細(xì)胞融合技術(shù)完成了從病毒誘導(dǎo)異種細(xì)胞融合到PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合再到電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合的巨大飛躍，融合方法得到了不斷的革新和完善, 融合率也逐步地提高。

細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一, 目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，并已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果,在免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)特別是克隆抗體和動(dòng)植物遠(yuǎn)緣雜交育種、基因圖譜的繪制等諸多方面, 都具有重要的意義。 PEG誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)被作為細(xì)胞生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容，具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)材料容易獲取等優(yōu)點(diǎn)，但也具有較為突出的缺點(diǎn)——細(xì)胞融合率低，在很大程度上影響了教學(xué)效果。改進(jìn)和完善細(xì)胞融合的條件，提高細(xì)胞融合率，能大大提高學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，有助于學(xué)生科學(xué)探究能力的形成。

2 細(xì)胞融合的方法

目前，細(xì)胞融合方法主要包括：(1)物理法如電融合誘導(dǎo)法、激光融合法，空間細(xì)胞融合技術(shù)、離子束細(xì)胞融合技術(shù)以及非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)。(2)化學(xué)法如鹽類融合法、高鈣和高pH值融合法、聚乙二醇融合法(PEG法)。(3)生物法如仙臺(tái)病毒(SeV)誘導(dǎo)法、水皰性口炎病毒(VSV)誘導(dǎo)法。

聚乙二醇融合法(PEG法)誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合的融合率相對(duì)較高，實(shí)驗(yàn)成本低廉且廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中。橢球形的雞紅細(xì)胞因其運(yùn)動(dòng)時(shí)所受到的阻力較大而體型較小，融合率不及兔紅細(xì)胞與蟾蜍紅細(xì)胞，但便于取血、觀察以及融合率的計(jì)算。因此，實(shí)驗(yàn)主要對(duì)提高聚乙二醇誘導(dǎo)雞血細(xì)胞融合率的條件進(jìn)行優(yōu)化和探究。

細(xì)胞融合過程大致可分為細(xì)胞的接觸、細(xì)胞質(zhì)膜的融合、細(xì)胞質(zhì)的重組和遺傳物質(zhì)的選擇四個(gè)部分?；诩?xì)胞膜的流動(dòng)性，經(jīng)過PEG分子的誘導(dǎo)，通過熱力學(xué)力和滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞膜緊密接觸，帶有負(fù)極性的PEG分子借氫鍵結(jié)合水分子，以致細(xì)胞脫水，使細(xì)胞質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，相鄰的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)因膜脂雙層的相互親和與表面張力相互結(jié)合。這一過程受到PEG分子量和濃度、融合溫度和時(shí)間以及pH值的影響,且融合溫度與融合時(shí)間對(duì)細(xì)胞融合率的影響遠(yuǎn)小于聚乙二醇濃度的影響。

3 目前的研究成果

3.1 不同PEG的分子量與濃度對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響

PEG的分子量越大，濃度越高，對(duì)細(xì)胞膜的破壞越強(qiáng)烈，對(duì)細(xì)胞的毒性也越大，且 PEG 濃度過高時(shí)細(xì)胞反應(yīng)液體環(huán)境粘滯度升高，可能會(huì)阻礙細(xì)胞融合。因此，PEG 濃度對(duì)雞紅細(xì)胞的融合率影響較大，其次為融合溫度、反應(yīng)時(shí)間。大部分的研究采用了分子量為4000的PEG進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究適合的PEG濃度。華小黎的研究認(rèn)為，在其他試驗(yàn)條件相同的情況下，使用PEG 4000，濃度為45% PEG融合率較高。而仇燕則認(rèn)為PEG4000濃度為35% 時(shí)融合率最高。此外，劉哲等人使用PEG1500，通過調(diào)整其他條件，使融合率最高達(dá)到25.47%；侯元通過調(diào)整pH 值，實(shí)現(xiàn)了以分子量為8000的PEG作為誘導(dǎo)劑的蟾蜍血細(xì)胞融合，且在相同實(shí)驗(yàn)條件下，PEG 8000的作用超過PEG 4000。因此，認(rèn)為目前最適合雞血細(xì)胞融合的PEG分子量與濃度暫不明確，分子量為2000、4000、6000、8000的不同濃度的PEG都有可能促成細(xì)胞融合，需要進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證，研究PEG分子量、濃度及其互作效應(yīng)對(duì)細(xì)胞融合率的影響。

3.2 不同融合溫度對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響

在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性會(huì)隨著溫度的升高而增強(qiáng)，流動(dòng)性的增強(qiáng)可促進(jìn)細(xì)胞膜的融合，提高融合率。但高溫過度也可使細(xì)胞因不能承受高溫而失去活性，導(dǎo)致融合率降低。劉哲等人的研究結(jié)果表明，在融合溫度為35 ℃、37 ℃、39 ℃時(shí)，與PEG1500作用10 min，39 ℃時(shí)細(xì)胞融合率最高, 達(dá)25.47%。而王惠等人在融合時(shí)間15 min、濃度為50%的PEG4000 條件下, 融合溫度23 ℃的融合率最低, 30 ℃的融合率次之, 37 ℃的融合率最高, 溫度升高至44 ℃時(shí), 融合率反而下降。仇燕等人使用50% PEG4000，在不同溫度 (30 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃) 水浴鍋中融合20 min，細(xì)胞融合率隨著反應(yīng)溫度的升高而增加, 37 ℃時(shí)細(xì)胞融合率最高達(dá)20.15%, 并發(fā)現(xiàn)有少量細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂,39 ℃時(shí)融合率反而有所下降。然而，從實(shí)際課堂中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，上述溫度下的融合結(jié)果并不理想?？紤]到雞的體溫高于40 ℃，認(rèn)為雞血細(xì)胞可以承受高于39 ℃的融合溫度，應(yīng)嘗試探索更高的融合溫度能否進(jìn)一步提高融合率。

3.3 不同融合時(shí)間對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響

王惠使用PEG4000,在37 ℃水浴鍋內(nèi)溫浴5 min、10 min、15 min，結(jié)果顯示融合率不隨時(shí)間的推移發(fā)生顯著變化。而仇燕則認(rèn)為在35 ℃時(shí)，濃度為35%的PEG 4000 ，細(xì)胞融合的最適融合時(shí)間為 40 min，時(shí)間過長(zhǎng)或過短均會(huì)降低融合率。劉哲的實(shí)驗(yàn)設(shè)置溫度為37 ℃, PEG1500作用時(shí)間分別為2 min、5 min、10 min、20 min，結(jié)果表明融合10 min的細(xì)胞融合率最大, 可達(dá)22.61%, 但有一部分細(xì)胞已經(jīng)破碎，10 min后細(xì)胞融合率不隨時(shí)間推移而發(fā)生顯著變化。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大差異，不同濃度、不同分子量的PEG以及不同溫度都可能影響雞血細(xì)胞融合的最適時(shí)間。細(xì)胞的靠近、接觸、融合都需要一定時(shí)間，但隨著融合時(shí)間的增長(zhǎng)，PEG對(duì)細(xì)胞的破壞隨之增強(qiáng)，融合時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞形狀發(fā)生改變。此外，綜合考慮PEG的分子量和濃度與融合時(shí)間，高 PEG 濃度、短孵育時(shí)間的方式優(yōu)于低 PEG 濃度、長(zhǎng)孵育時(shí)間的方式，這是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間孵育造成了細(xì)胞與PEG分離。因此，我們認(rèn)為融合時(shí)間可能取決于PEG的分子量和濃度，考慮融合時(shí)間與融合溫度之間的互作。

4 小結(jié)

PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合法是最為經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的細(xì)胞融合技術(shù)，但由于其效果受多種因素影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常并不理想。PEG 法誘導(dǎo)細(xì)胞融合既是細(xì)胞生物學(xué)中一項(xiàng)重要研究技術(shù)，也是細(xì)胞生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)課程中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，為了提高細(xì)胞融合效果，使學(xué)生徹底掌握這項(xiàng)重要技術(shù)。