豬輪狀病毒病診斷與防控研究進(jìn)展

李元新，陳伯祥，趙子惠，成偉偉，楊 明 ，蒙 琦

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000)

豬輪狀病毒病是由豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)引起的仔豬一種以急性腹瀉為特征的急性腸道傳染病。主要特征表現(xiàn)為厭食、嘔吐、腹瀉、水樣和糊狀糞便等癥狀，病程后期嚴(yán)重脫水導(dǎo)致仔豬死亡。在室溫環(huán)境中，病毒的感染力可保持7～9個(gè)月。豬輪狀病毒病潛伏期為16～24 h，該病不僅在我國(guó)大范圍流行，而且發(fā)病率和死亡率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于臨床癥狀和流行病學(xué)表現(xiàn)與豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬流行性腹瀉 (PED) 非常相似，在實(shí)際生產(chǎn)中往往難以診斷而錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，從而導(dǎo)致仔豬大面積死亡。因此，掌握豬輪狀病毒病檢測(cè)技術(shù)對(duì)該病的診斷和防治均具有重要意義。本文就豬輪狀病毒病的臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行全面綜述，旨在為本病的監(jiān)測(cè)和綜合防控提供技術(shù)支持。

1 臨床及病理診斷

1.1 臨床診斷

對(duì)于養(yǎng)殖基礎(chǔ)薄弱，經(jīng)濟(jì)條件差的養(yǎng)殖戶來(lái)說(shuō)，臨床診斷是他們常用的一種診斷方法，該方法主要根據(jù)養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)對(duì)仔豬出現(xiàn)的嗜睡、嘔吐、腹瀉、食欲減退，并伴有腹瀉，初期糞便水樣、糊狀、半固體狀或似乳清樣，之后逐漸變?yōu)橐环N黃綠色和灰白色等臨床癥狀來(lái)判斷。雖然在一定程度上可以診斷并治療該病，但由于病原未知，存在巨大的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 病理剖檢診斷

豬輪狀病毒病在解剖后可以明顯地看到消化道炎癥，由于感染豬輪狀病毒后，仔豬胃腸功能減弱，表現(xiàn)胃部存有大量乳凝塊，小腸部的糞便顏色變暗發(fā)黑，腸部淋巴結(jié)腫脹嚴(yán)重。通過(guò)鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)小腸絨毛萎縮變短，空腸和回腸表現(xiàn)為微絨毛變少，上皮細(xì)胞從柱狀變成扁平狀。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病毒的分離鑒定

目前診斷豬輪狀病毒病經(jīng)典技術(shù)方法是病毒分離鑒定。將病料處理后接種于適宜細(xì)胞，傳代并根據(jù)細(xì)胞病變狀況來(lái)判定PoRV陰陽(yáng)性，該法雖然直觀，但存在試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、操作步驟多，價(jià)格偏高等不足。國(guó)內(nèi)學(xué)者已成功分離出了豬A群輪狀病毒毒株。庫(kù)旭鋼等(2012)從腹瀉仔豬采集糞便樣本經(jīng)處理接種在MA-104細(xì)胞上，通過(guò)分離鑒定最終判定為豬輪狀病毒。張賀偉等(2014)將腹瀉仔豬的糞便處理后接種于篩選的該毒株的最適細(xì)胞系MA-104上，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定和遺傳學(xué)分析，成功分離出了豬A群輪狀病毒毒株。但該法過(guò)程繁瑣，耗資較大，目前基層已應(yīng)用較少。

2.2 電鏡觀察診斷

應(yīng)用電鏡觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒粒子的形狀看起來(lái)像車(chē)輪，對(duì)采取的病料用磷鎢酸來(lái)感染處理，在電鏡下找到特征性的病毒粒子，測(cè)定直徑，再拍照保存。最后根據(jù)所得病毒顆粒的直徑大小是否符合病毒顆粒直徑范圍來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性。直接電鏡法主要主要用來(lái)檢測(cè)動(dòng)物糞便，免疫電鏡法主要用于動(dòng)物血清檢查，雖然該方法操作簡(jiǎn)單、直觀高效，較病毒的分離鑒定在人員操作上要求不高。但所使用的電鏡設(shè)備價(jià)格昂貴，不適宜在基層進(jìn)行大規(guī)模推廣。

2.3 血清學(xué)診斷

2.3.1 免疫熒光檢測(cè)(IFA) 利用IFA檢測(cè)豬輪狀病毒是將患病豬糞便或病死豬腸道內(nèi)容物經(jīng)處理后制成涂片，經(jīng)固定、染色，用熒光顯微鏡觀察，這種方法在診斷輪狀病毒中應(yīng)用最普遍，但對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和樣品質(zhì)量的要求均比較嚴(yán)格。

2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試(ELISA) ELISA方法作為經(jīng)典的病毒檢測(cè)方法，因其操作方法簡(jiǎn)單，能對(duì)大批量樣品進(jìn)行檢測(cè)，污染小且檢出率高等特點(diǎn)，近幾年在基層和各實(shí)驗(yàn)室已普遍應(yīng)用，特別是對(duì)基層獸醫(yī)部門(mén)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查帶來(lái)了方便。近年來(lái)，為達(dá)到方便使用，提高檢出效率，以便更好地適應(yīng)于基層，許多科研工作者在方法上做了大量的創(chuàng)新研究。孟柳等建立了的間接ELISA，利用純化的豬輪狀病毒的VP6蛋白成功檢測(cè)到了豬輪狀病毒血清抗體。同樣，陳淑華等以豬群輪狀病毒VP6基因表達(dá)的蛋白作為抗原，建立起的間接ELISA方法能夠快速檢測(cè)出其IgG抗體，總符合率可達(dá)91.5%以上，在豬輪狀病毒病流行病學(xué)調(diào)查上應(yīng)用較廣，在豬群抗體水平的監(jiān)測(cè)上也有所應(yīng)用。黃小波等利用雙抗體夾心ELISA方法成功檢測(cè)到了豬輪狀病毒。各種ELISA方法因其高效、簡(jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于基層獸醫(yī)部門(mén)的樣品的檢測(cè)，但由于該方法重復(fù)性不夠強(qiáng)，因而具有一定的局限性。Zhu JY Yang等利用在大腸桿菌中表達(dá)的PoRV VP6基因在兔體內(nèi)產(chǎn)生抗體，建立一種能區(qū)分PoRV和其他豬病毒的鑒別ELISA方法， 抗VP6血清抗體可作為PoRV檢測(cè)的良好診斷試劑。Nagesha H S 等通過(guò)酶免疫分析利用VP7特異性單克隆抗體直接對(duì)豬輪狀病毒進(jìn)行血清分型，采用單克隆抗體進(jìn)行血清型環(huán)評(píng)試驗(yàn)，將細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的豬輪狀病毒和糞便輪狀病毒分為血清型G3、G3/5、G4和G5。該單克隆抗體證實(shí)并擴(kuò)展了多克隆抗血清的血清分型結(jié)果。因此，這些單抗是豬輪狀病毒血清分型的潛在試劑。使用亞群特異性單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)G3、G3/5和G5血清型含有亞群I抗原，而G4輪狀病毒含有亞群II或亞群I抗原。

2.3.3 膠體金免疫層析技術(shù)(GICA) GICA是一種高效的免疫學(xué)測(cè)定方法，結(jié)合了膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)重新組合而建立起來(lái)。其基本原理是通過(guò)微孔膜滲透作用和毛細(xì)現(xiàn)象，使抗原抗體在固相膜上結(jié)合并迅速反應(yīng)，然后利用膠體金標(biāo)記抗體直接顯色來(lái)判斷陰陽(yáng)性。為使該項(xiàng)技術(shù)在輪狀病毒檢測(cè)應(yīng)用中發(fā)揮作用，也有研究者研制出了檢測(cè)豬輪狀病毒的膠體金試紙條。該方法整個(gè)過(guò)程僅需15 min左右，但也存在一些不足，如樣品質(zhì)量難以控制、靈敏性差、難以定量等。

2.4 分子生物學(xué)診斷方法

2.4.1 RT-PCR 診斷 RT-PCR是一種實(shí)驗(yàn)室常用的分了生物學(xué)診斷技術(shù)，它可以利用少量的核酸樣品能準(zhǔn)確地檢測(cè)到RNA序列。張雙翔等根據(jù)豬輪狀病毒VP6和VP7不同的基因序列，成功設(shè)計(jì)出了2對(duì)RT-PCR特異性引物，建立起針對(duì)不同靶基因的豬輪狀病毒快速檢測(cè)方法，均有明顯的特異性。張維誼等建立的豬輪狀病毒RT-PCR檢測(cè)方法在PoRV、TGEV)、PEDV的病毒檢測(cè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，后兩者均表現(xiàn)為陰性，體現(xiàn)出了很強(qiáng)的特異性。該方法與傳統(tǒng)的血清學(xué)和免疫學(xué)方法相比，能夠快速檢測(cè)到組織中是否有病毒感染。但由于該方法需要特定的儀器設(shè)備和試劑，在基層難以推廣應(yīng)用。

2.4.2 多重RT-PCR技術(shù) 多重RT-PCR技術(shù)是病毒鑒別診斷的重要技術(shù)手段，它可以將設(shè)計(jì)好的多對(duì)引物在一次反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增，避免了逐一分離病毒的復(fù)雜程序。任玉鵬等建立起的能同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬群輪狀病毒(GAR)的多重 RT-PCR鑒別檢測(cè)方法，均能很好的檢測(cè)出該三種病毒的陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)豬薩佩羅病毒(PSV)、豬博卡病毒(PBoV)、豬環(huán)曲病毒(PToV)、金黃色葡萄球菌(SA)豬鏈球菌2型(SS2)、豬源大腸桿菌(E. coli)、豬源沙門(mén)氏菌(S.choleraesuis)、空腸彎曲桿菌(Cje)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證明該法具有較強(qiáng)的靈敏性和特異性。王睿敏等對(duì)豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV) 、豬Delta冠狀病毒(PDCoV)和豬輪狀病毒 (PRoV)建立了多重 RT-PCR檢測(cè)方法，并且用該方法對(duì)2017年至2018年從廣西各地采集的270份腹瀉樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果都驗(yàn)證了該方法可行有效，對(duì)豬病毒性疾病的流行病學(xué)調(diào)查意義重大，應(yīng)用前景廣闊。

劉海源等針對(duì)建立PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分別設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了PEDV-TGEV-RV的多重PCR方法，PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分別設(shè)計(jì)了特異性引物，分別擴(kuò)增出預(yù)期的311 bp、763 bp和516 bp的目的片段，成功建立同時(shí)檢測(cè)豬三種常見(jiàn)病毒感染的多重PCR方法。通過(guò)敏感性和特異性的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本方法對(duì)PEDV、TGEV、RV的最高敏感度分別為30 pg，TGEV的最高敏感度為18 pg，RV的最高敏感度為42 pg，并通過(guò)對(duì)其他常見(jiàn)幾種病原進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)本方法特異性良好，可以應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。利用該檢測(cè)方法對(duì)2015年到2016年來(lái)自山東省濟(jì)南、泰安、萊蕪等發(fā)病豬場(chǎng)的并對(duì)412份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明PEDV、TGEV和RV的陽(yáng)性率分別為22.3%、7.28%和1.46%，PEDV與TGEV、PEDV與RV、TGEV與RV雙重混合感染陽(yáng)性率分別為5.34%、1.94%和2.91%，PEDV、TEGV和RV三重感染陽(yáng)性率為4.85%。Kerlei C. Médici等采用RT-PCR方法檢測(cè)A組輪狀病毒，采用一致引物擴(kuò)增VP4基因的876 bp (P型)和VP7基因的1062 bp (G型)， 利用輪狀病毒B12組8號(hào)基因(NSP2)的434 bp擴(kuò)增產(chǎn)物和輪狀病毒C組5號(hào)基因(VP6)的270 bp擴(kuò)增產(chǎn)物的半巢式PCR方法鑒定了非典型輪狀病毒。

2.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-Time Quantitative PCR)。它是將RT-PCR技術(shù)與光譜技術(shù)相結(jié)合的一種核酸定量檢測(cè)技術(shù)。具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。與常規(guī)RT-PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR克服了假陽(yáng)性和污染環(huán)境問(wèn)題。陳小飛等根據(jù)GenBank中近些年來(lái)豬輪狀病毒A群 VP6的序列分析，選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，成功構(gòu)建立了TB Green熒光定量PCR 檢測(cè)方法。對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測(cè)下限為106拷貝/μL，敏感性是普通RT-PCR的3.54倍，在這個(gè)方法的應(yīng)用過(guò)程中采集了91份臨床病料來(lái)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40份病料呈陽(yáng)性。對(duì)豬呼腸孤病毒(MRV)、豬瘟病毒(HC)、巴氏桿菌(PM)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬捷申病毒(PTV)、鏈球菌(SS)以及豬等孢球蟲(chóng)(I.suis)檢測(cè)均為陰性。陳如敬等根據(jù)豬輪狀病毒的 VP6 基因特征設(shè)計(jì)具有特異性的引物和探針，經(jīng)過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種檢測(cè)豬輪狀病毒的 TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法，最低可檢測(cè) 192拷貝/μL。對(duì)該方法的應(yīng)用中采集了79份病料，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了6份樣品是陽(yáng)性，說(shuō)明了該方法特異性強(qiáng)，靈敏性高。但由于該方法對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)技術(shù)水平的要求較高，并需要一定的儀器設(shè)備，在一般實(shí)驗(yàn)室難以普及應(yīng)用。Elizabeth C.M. Marconi等〗以RV的NSP5基因的一段保守序列為靶向基因建立了SYBR-Green實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。 A組輪狀病毒(RVA)是人類(lèi)和幾種動(dòng)物腹瀉的最常見(jiàn)原因之一。運(yùn)用該方法與采用SYBR-Green實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time polymerase chain reaction, PCR)，以牛nadh - desrogenase - 5 mRNA為外源內(nèi)參，靶向擴(kuò)增非結(jié)構(gòu)蛋白5 (non - structural protein 5, NSP5)基因的137 bp片段，對(duì)常規(guī)PCR對(duì) 65份豬糞便標(biāo)本中的RVA進(jìn)行診斷。 65份樣本進(jìn)行了檢測(cè)(25份常規(guī)PCR和基因測(cè)序檢測(cè)呈陽(yáng)性)。 總體一致性(kappa)為0.843，表明各項(xiàng)試驗(yàn)的一致性“非常好”，相對(duì)靈敏度為100% (25+Real Time PCR/25+ Conventional PCR)，相對(duì)靈敏度為87.5% (35- Real Time PCR/40- Conventional PCR)。分析結(jié)果表明，該方法具有較高的重復(fù)性(變異系數(shù)≤1.42%)。因此，該方法是一種快速、靈敏的豬RVA診斷方法。

2.4.4 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP) RT-LAMP近些年來(lái)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病病原基因檢測(cè)，它也是一種快速等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，與RT-PCR法相比，RT-LAMP法省去了RT-PCR法中的預(yù)變性、變性、退火步驟即可循環(huán)擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物判定不需要電泳，肉眼就能夠判定。該方法極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，結(jié)果可自動(dòng)判讀，臨床實(shí)用性高，應(yīng)用前景更加廣闊。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，其最低可檢出10基因拷貝。胡興義等就已經(jīng)利用此方法建立起了豬輪狀病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)，結(jié)果對(duì)203份豬腹瀉樣本檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣本16份，靈敏度能達(dá)到1.0×102拷貝/μL。該方法在恒溫條件下進(jìn)行，無(wú)需特殊儀器，適合應(yīng)用于基層養(yǎng)殖場(chǎng)。

3 PoRV 防控

目前防控 PoRV的疫苗主要有減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馮力等人研制成功TGE-PED-RV三聯(lián)活疫苗，防治豬病毒性腹瀉病方面發(fā)揮了重要作用。史月明等研制成功的油乳劑滅活疫苗 , 免疫仔豬可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和保護(hù)性抗體。Oneal 等 將 RV 的核酸亞單位片段VP2/6- VLPs、VP2/4/6-VLPs 與霍亂毒素混合研制出亞單位疫苗，免疫動(dòng)物后可使受試動(dòng)物得到良好保護(hù)。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了多種形式的 VLPs(6/7-VLPs、2/6/7-VLPs、2/4/6/7- VLPs)，發(fā)現(xiàn)這些 VLPs 都具有較好的免疫保護(hù)效果。使我國(guó)豬病毒性腹瀉病得到精準(zhǔn)防控，極大的減少了經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì) PoRV 目前還沒(méi)有特異性治療藥物，主要采取疫苗預(yù)防，藥物治療，做好消毒，注意保暖，營(yíng)養(yǎng)均衡等措施達(dá)到防控的目標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)

對(duì)于豬輪狀病毒病，僅僅依據(jù)臨床癥狀和剖檢變化來(lái)作出判斷是具有一定局限性的，只有結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷才能最終確診該病的發(fā)生，但各種實(shí)驗(yàn)方法又不能完全滿足檢測(cè)的實(shí)際需要。例如，電鏡觀察診斷操作簡(jiǎn)便，直觀高效，但由于實(shí)驗(yàn)儀器電鏡價(jià)格昂貴，無(wú)法在基層單位推廣使用；免疫學(xué)方法能夠檢測(cè)豬輪狀病毒感染、發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，但由于抗體只在感染至特定時(shí)期才出現(xiàn)，所以ELISA等抗體檢測(cè)方法具有一定局限性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR、RT-LAMP、RT-PCR、多重RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)在豬感染豬輪狀病毒早期就可以檢測(cè)到病毒核酸，對(duì)于豬輪狀病毒早期檢測(cè)具有重要作用，但對(duì)操作技術(shù)要求相對(duì)較高。國(guó)內(nèi)外關(guān)于豬輪狀病毒病的研究雖然起步較晚，卻引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，并取得了許多豬輪狀病毒病診斷技術(shù)方面的成果。由于各種診斷方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，因此要根據(jù)診斷的目的和要求，并結(jié)合實(shí)際條件選擇合適的診斷方法。目前市場(chǎng)上已有多家公司根據(jù)不同的診斷技術(shù)提供了多種豬輪狀病毒病的檢測(cè)試劑盒，為該病的快速診斷提供了有力保障。為了實(shí)現(xiàn)診斷方法的便捷性和診斷試劑的商品化，應(yīng)將各種診斷方法有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，從而達(dá)到最佳的檢測(cè)效果，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬輪狀病毒感染及時(shí)、快速檢測(cè)。相信將來(lái)隨著分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，豬輪狀病毒病的診斷技術(shù)會(huì)愈加高效、便捷。同時(shí)，對(duì)豬輪狀病毒病采取綜合防控措施，能大大減輕該病的發(fā)生，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。