同步異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌Acinetobacter sp.TAC-1的氮代謝途徑研究

高艷輝，譚 娜，趙天濤，，張?jiān)迫?，?千，彭緒亞，艾 鑠

(1.重慶大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院， 重慶 400044； 2.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 400054； 3重慶士繼生態(tài)環(huán)境科技有限公司， 重慶 404100)

廢水的氮脫除工藝研究在世界范圍內(nèi)一直備受關(guān)注，其中生物脫氮工藝被廣泛應(yīng)用，目前主要分為傳統(tǒng)生物脫氮和新型生物脫氮工藝。傳統(tǒng)生物脫氮涉及硝化與反硝化作用2個(gè)反應(yīng)過程[1-2]，它們分別由單一功能的好氧硝化細(xì)菌和厭氧反硝化細(xì)菌在不同反應(yīng)器中或同一反應(yīng)器不同時(shí)間獨(dú)立完成。傳統(tǒng)脫氮工藝成熟，但同時(shí)存在一些不足[3-9]：① 硝化細(xì)菌生物量低且增殖緩慢，對(duì)極端環(huán)境耐受性較差；② 硝化及反硝化過程由于氧氣需求的差別，需要單獨(dú)的構(gòu)筑物，建設(shè)成本較高；③ 硝化過程產(chǎn)生酸度，需要投放堿以中和酸度，增加成本的同時(shí)提高了二次污染的風(fēng)險(xiǎn)。然而，細(xì)菌在單個(gè)細(xì)胞中可同時(shí)實(shí)現(xiàn)硝化和反硝化脫氮，比自養(yǎng)生物具有更高的生長(zhǎng)速率和氮去除效率[10-11]，SND工藝在廢水脫氮領(lǐng)域展現(xiàn)了更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

多層面分析可以更好的揭示同步異養(yǎng)硝化-好氧反硝化代謝途徑。為清晰認(rèn)識(shí)SND氮代謝途徑，采用具有SND功能的Acinetobactersp.TAC-1菌株開展研究：① 以TAC-1菌株為研究對(duì)象，對(duì)其異養(yǎng)硝化基因(hao)及好氧反硝化基因(nirS/nirK、narG/napA、norB及nosZ)進(jìn)行DNA水平的PCR擴(kuò)增與T-A克隆測(cè)序來定性分析脫氮途徑；② 通過T-A克隆構(gòu)建所鑒定脫氮基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，以其為模板建立TAC-1菌株SND過程脫氮基因的qPCR定量檢測(cè)方法；③ qPCR定量分析不同氮源培養(yǎng)條件下TAC-1菌株SND脫氮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的差異，并結(jié)合該菌株不同氮源培養(yǎng)條件下不同生長(zhǎng)階段的氮代謝特性和產(chǎn)物分析共同揭示mRNA水平上TAC-1菌株SND氮代謝機(jī)制。該研究有助于更好的了解SND氮代謝機(jī)制，為SND脫氮工藝的開發(fā)和工程菌的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和培養(yǎng)

本研究所使用菌株為一株具有高效低溫脫氮功能的不動(dòng)桿菌Acinetobactersp.TAC-1，篩選自重慶某生豬養(yǎng)殖企業(yè)畜禽糞污沼液。將TAC-1菌株接種到高溫高壓滅菌的50 mL的肉湯培養(yǎng)基中富集，作為種子液。肉湯培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5。異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L，琥珀酸鈉 7.15 g/L，維氏鹽溶液 50 mL/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。其中維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO45.0，MgSO4·7H2O 2.5，NaCl 2.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO4·4H2O 0.05。亞硝酸鹽培養(yǎng)基：NaNO22 g/L，琥珀酸鈉 27.39 g/L，維氏鹽溶液 50 mL/L。硝酸鹽培養(yǎng)基：NaNO32.4 g/L，琥珀酸鈉 26.68 g/L，維氏鹽溶液 50 mL/L。

1.2 核酸提取和RT-PCR

取一定量培養(yǎng)到指數(shù)期的菌液，常溫離心獲得菌體，按照DNA提取試劑盒(型號(hào)：DP336，天根生化科技(北京)有限公司)說明提取樣品總DNA。取一定量培養(yǎng)到不同時(shí)期的菌液，低溫離心獲得菌體，按照RNA提取試劑盒(型號(hào)：DP419，天根生化科技(北京)有限公司)說明提取樣品總RNA。將提取的總RNA進(jìn)行基因組DNA去除反應(yīng)，以其為模版采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(型號(hào)：TSK301S，北京擎科生物科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)合成cDNA，以cDNA為模版通過SYBR燃料法進(jìn)行后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.3 TAC-1菌株SND氮代謝基因PCR擴(kuò)增和鑒定

以采用1.2小節(jié)方法提取獲得的TAC-1菌株的DNA為模版，根據(jù)文獻(xiàn)引物(表1)分別對(duì)TAC-1菌株SND氮代謝過程nirK、nirS、hao、norB、nosZ及narG基因進(jìn)行終點(diǎn)PCR反應(yīng)，經(jīng)過對(duì)反應(yīng)程序和反應(yīng)體系的不斷優(yōu)化，獲得nirS、narG、hao的反應(yīng)體系為：上下游引物各2 μL、酶混合物25 μL、DNA 3 μL(小于500 ng)，用無菌無酶雙蒸水補(bǔ)足到50 μL；touchdown PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃變性10 s，從65 ℃開始每個(gè)循環(huán)下降0.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，上述操作進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后繼續(xù)98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，上述操作進(jìn)行44個(gè)循環(huán)，最后4 ℃保存。nirK基因的PCR反應(yīng)體系為：上下游引物各1 μL、酶混合物25 μL、DNA 2 μL(小于500 ng)，用無菌無酶雙蒸水補(bǔ)足50 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，上述操作進(jìn)行44個(gè)循環(huán)，最后4 ℃保存。終點(diǎn)PCR引物序列見表1。擴(kuò)增完成后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)目的條帶分子量大小，然后切膠回收序列，使用對(duì)應(yīng)片段的擴(kuò)增引物對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，為了對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行鑒定和分析，將測(cè)序獲得的序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast多序列比對(duì)分析，獲得與測(cè)序序列最相似的物種相似度，從中選擇相似度不同的參考序列與目標(biāo)基因序列，基于目標(biāo)基因序列同源性，使用Neighbor Joining法通過MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap值為1 000次重復(fù))，明確目標(biāo)基因序列在屬水平上的進(jìn)化關(guān)系。

表1 終點(diǎn)PCR及qPCR引物

1.4 TAC-1菌株SND氮代謝基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

通過終點(diǎn)PCR獲取目標(biāo)基因nirK、nirS及narG的擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳檢測(cè)目標(biāo)基因條帶尺寸，并對(duì)大小合適的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，用于目標(biāo)基因T-A克隆。目標(biāo)基因的克隆方法如下：連接體系在室溫(22～30 ℃)放置1～5 min導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞(型號(hào)：TSC01，北京擎科生物科技有限公司)中，冰浴25 min，42 ℃熱敷45 s，冰浴2 min，成為復(fù)蘇菌液，其在37 ℃，200 rpm的搖床中復(fù)蘇1 h后進(jìn)行平板涂布，37 ℃過夜培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子，連接體系為10 μL，根據(jù)基因片段長(zhǎng)度加入相應(yīng)量PCR產(chǎn)物，1 μL pClone007載體(型號(hào)：TSV-007，北京擎科生物科技有限公司)和1 μL 10× Topo Mix酶混合物，用超純水補(bǔ)足10 μL。

插入片段經(jīng)凝膠純化后進(jìn)行連接，通過PCR檢測(cè)排除其他污染可能性，檢測(cè)方法如下：用移液槍槍頭挑取白色透明單菌落至10 μL無菌水中，吹打混勻；取1 μL到20 μL Super PCR Mix(green)中輕微攪動(dòng)，進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR程序如下，98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s；58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s/kb；第二步循環(huán)35次后，4 ℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后切膠回收，使用上游引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)及下游引物M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)進(jìn)行測(cè)序，序列鑒定方法同2.3小節(jié)。根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算質(zhì)粒中目標(biāo)基因的濃度。

Y=X/M×6×1014

(1)

M=(Z1+Z2)×324

(2)

式中：X代表待測(cè)樣品濃度(ng/μL)，Y代表待測(cè)樣品拷貝數(shù)(copies/μL)，M代表樣本分子量，Z1和Z2分別代表載體和目標(biāo)片段的堿基數(shù)。

1.5 基于mRNA差異表達(dá)的TAC-1菌株SND氮代謝途徑分析

1.5.1TAC-1菌株SND氮代謝基因qPCR

以重組質(zhì)粒pClone007-nirK、pClone007-nirS、pClone007-narG為模板，進(jìn)行qPCR定量實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化后的qPCR引物序列見表1。將2.4小節(jié)獲得的單拷貝重組質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，對(duì)每個(gè)基因的每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行退火溫度梯度優(yōu)化，優(yōu)化體系設(shè)置的退火溫度梯度范圍是53～68 ℃，由qPCR儀器自動(dòng)平均分配為8個(gè)溫度梯度。nirK、nirS及narG基因的最優(yōu)qPCR退火溫度分別為56.4 ℃、62.4 ℃及62.4 ℃。以上述10倍梯度稀釋的質(zhì)粒作為構(gòu)建qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，在最優(yōu)的退火溫度條件下進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照試劑盒(型號(hào)：TSE201，北京擎科生物科技有限公司)，獲得對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，根據(jù)擴(kuò)增效率E(80%～105%)和可決系數(shù)R2及擴(kuò)增曲線和溶解曲線來對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行質(zhì)控分析，最后選擇各參數(shù)最優(yōu)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程作為每個(gè)基因的qPCR定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。nirK、nirS及narG基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為方程(3)、(4)及(5)。nirK基因標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)控參數(shù)為E=92.9%，R2=0.999，檢測(cè)限為：3.77～3.77×108copies/μL；nirS基因標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)控參數(shù)為E=100%，R2=0.996，檢測(cè)限為：4.00-4.00×105copies/μL；narG基因標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)控參數(shù)為E=93.5%，R2=0.998，檢測(cè)限為：3.10×101-3.10×106copies/μL。

Y=-3.504·log10X+38.416

(3)

Y=-3.321·log10X+37.825

(4)

Y=-3.4881·log10X+39.360

(5)

式中：Y代表nirK、nirS及narG基因qPCR過程中擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)期的循環(huán)數(shù)，X代表樣品中nirK、nirS及narG基因的初始濃度(copies/μL)。

1.5.2TAC-1菌株SND氮代謝途徑分析

2 結(jié)果與討論

2.1 TAC-1菌株氮代謝途徑基因的鑒定

對(duì)TAC-1菌株的氮代謝調(diào)控基因nirK、nirS、hao和narG分別進(jìn)行終點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)和電泳檢測(cè)，它們對(duì)應(yīng)的電泳成像圖分別見圖1(a)和(d)。從圖1可看出，基因nirK、nirS、narG的DNA片段長(zhǎng)度約為500 bp、900 bp/400 bp及600 bp，均與文獻(xiàn)[19-21]對(duì)應(yīng)片段長(zhǎng)度大致相符。其中將nirK基因和nirS基因的電泳產(chǎn)物分別切膠回收進(jìn)行測(cè)序，獲得對(duì)應(yīng)514 bp和849 bp/425 bp堿基序列。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：nirK基因與Ochrobactrum屬菌株的序列覆蓋率范圍為94%～100%，相似度范圍為97.48%～98.64%。根據(jù)nirK基因?qū)?yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(圖2(a))發(fā)現(xiàn)其與Ochrobactrumanthropistrain YX0903的nirK基因序列最為接近，歸為一枝可信度為61，基因序列覆蓋度為100%，相似度為98.25%。在構(gòu)建發(fā)育樹之前的參考序列篩選過程中發(fā)現(xiàn)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中無法查詢到不動(dòng)桿菌屬的nirK序列，盡管2013年Huang X F等[15]通過酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在不動(dòng)桿菌Y16脫氮過程中硝酸鹽還原酶是與反硝化過程相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵酶，但是在不動(dòng)桿菌的相關(guān)研究中并未有nirK基因的報(bào)道，基于以上分析推測(cè)不動(dòng)桿菌TAC-1菌株的nirK基因可能是通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得。

TAC-1菌株的nirS基因在后續(xù)對(duì)849 bp的片段(圖1(b))進(jìn)行T-A克隆階段不成功，重新嘗試新的引物獲得的425 bp的序列(圖1(c))成功克隆獲得了nirS基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。TAC-1菌株的425 bp的nirS基因與Pseudomonasaeruginosa、Uncultured bacterium、Uncultured prokaryote、Burkholderiaceae bacterium、Wautersia、Ralstonia、Kocuriavarians、Cupriavidus等原核生物的對(duì)應(yīng)序列覆蓋率范圍為90%～100%，相似度范圍為75.91%～99.02%。根據(jù)TAC-1菌株nirS基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(圖2(b))發(fā)現(xiàn)其nirS基因與CupriavidusnecatorH16的nirS基因序列最為接近，歸為一枝可信度為99，基因序列覆蓋度為99%，相似度為99.02%。從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系亦知，TAC-1菌株的nirS基因遠(yuǎn)離已報(bào)道不動(dòng)桿菌屬菌株，其中基因序列與已報(bào)道不動(dòng)桿菌菌株Acinetobacterhaemolyticusstrain ZYL、Acinetobacterseohaensisstrain WC_35及Acinetobacterbaumanniistrain 4300STDY7045820的覆蓋度范圍分別為0、70%及100%，相似度分別為0、72.76%及76.4%，與Acinetobacterhaemolyticusstrain ZYL未發(fā)現(xiàn)任何顯著相似性。推測(cè)不動(dòng)桿菌TAC-1的nirS基因在適應(yīng)環(huán)境過程中發(fā)生了基因突變及基因水平轉(zhuǎn)移。

根據(jù)文獻(xiàn)[21]中擴(kuò)增菌株628 bp的narG基因所用引物擴(kuò)增TAC-1菌株的narG基因，并進(jìn)行凝膠電泳鑒定(圖1(d))測(cè)序，發(fā)現(xiàn)測(cè)序時(shí)引物和序列無法完整結(jié)合，只測(cè)出上游200 bp左右序列，這可能與narG序列自身特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)，NCBI比對(duì)結(jié)果證實(shí)：該序列確實(shí)為narG，要想測(cè)序獲得擴(kuò)增片段的完整序列，須將該基因克隆之后再測(cè)序。因此通過3.2小節(jié)中T-A克隆獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測(cè)序獲得TAC-1菌株narG基因序列，NCBI比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與Aquaspirillum、Ralstonia，Uncultured bacterium clone、Chromobacterium、Aquitalea、Vogesella及Pseudogulbenkiania的序列覆蓋率范圍為99%～100%，相似度范圍為83.57%～86.5%。根據(jù)TAC-1菌株narG基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(圖2C)發(fā)現(xiàn)其與Pseudogulbenkianiasp.NH8B的narG基因序列最為接近，歸為一枝可信度為59，基因序列覆蓋度為100%，相似度為86.5%。從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系亦知，TAC-1菌株的narG基因與已報(bào)道不動(dòng)桿菌屬菌株存在一定距離，且narG基因在已報(bào)道的兩株不動(dòng)桿菌Acinetobacterbaumanniistrain 4300STDY7045842和Acinetobacterseohaensisstrain WC_35之間也存在差異，歸為一枝的可信度僅為44。TAC-1菌株的narG基因序列與上述已報(bào)道的兩株不動(dòng)桿菌菌株的覆蓋度范圍分別為24%和100%，相似度分別為79.25%及79.46%。此外，TAC-1菌株的narG基因與發(fā)育樹中進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的MycobacteriumbovisBCG strain CaseA11、Uncultured bacterium clone soil.119、Uncultured bacterium clone soil.126及Staphylococcusaureus之間無顯著相似性。

對(duì)992 bp的hao基因擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1(e))進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物條帶位置遠(yuǎn)低于992 bp，且序列無法與數(shù)據(jù)庫(kù)hao基因匹配，重新更換了不動(dòng)桿菌屬特異擴(kuò)增462 bp的hao引物[22]后，序列測(cè)序結(jié)果與不動(dòng)桿菌屬基因組序列比對(duì)上，但是未對(duì)該基因命名。測(cè)序序列只有382 bp，與條帶位置不符(圖1(f))。后續(xù)對(duì)382 bp的序列進(jìn)行T-A克隆，但是并不成功。hao基因與文獻(xiàn)報(bào)道[22]片段長(zhǎng)度也不符。文獻(xiàn)[22]研究了該屬水平菌株的hao基因及推測(cè)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬包含自養(yǎng)菌hao基因部分保守區(qū)域的ORF，但是這個(gè)ORF序列與已知自養(yǎng)菌的hao基因沒有明顯的相似性，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與已知異養(yǎng)菌的hao部分氨基酸序列也不完全相同，指出推測(cè)該屬水平菌株所含hao基因可能為一種新型羥胺氧化酶基因。由此推測(cè)：本研究所獲得的TAC-1菌株的hao基因亦可能為一種新型基因。此外在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)整個(gè)代謝途徑的napA、norB、nosZ基因也分別進(jìn)行了擴(kuò)增，但始終無法通過優(yōu)化反應(yīng)條件擴(kuò)增出這些片段，故推測(cè)該菌株可能不含有這幾種氮代謝基因。

基于以上分析，在DNA水平上初步推測(cè)了TAC-1菌株可能的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑，即兩種主導(dǎo)途徑均存在。但是與文獻(xiàn)報(bào)道[15,23]的不動(dòng)桿菌屬的好氧反硝化基因(僅包含nirS基因，或nirK及nirS均無酶活)不同，該菌株同時(shí)含有兩個(gè)亞硝酸還原基因nirK及nirS，且硝酸鹽還原酶調(diào)控基因只含有narG，而非文獻(xiàn)報(bào)道的napA。

圖1 nirK、nirS、narG及hao基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳成像示意圖

圖2 TAC-1菌株nirK(A)、nirS(B)及narG(C)基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹示意圖

2.2 不動(dòng)桿菌TAC-1氮代謝基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2.1nirK基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

通過T-A克隆實(shí)驗(yàn)獲得nirK克隆轉(zhuǎn)化子，搖菌后對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3(a)，與marker對(duì)比發(fā)現(xiàn)nirK條帶約為500 bp；再取菌液提取連接質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3(b)，與500 bp marker對(duì)比可見nirK條帶也約為500 bp。電泳產(chǎn)物切膠回收進(jìn)行測(cè)序，獲得514 bp的nirK基因。從nirK克隆轉(zhuǎn)化子菌液中提取連接質(zhì)粒，進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3(c)，與2000 bp marker對(duì)比可見2425 bp(nirK514 bp+pClone007 1911 bp)條帶。上述電泳結(jié)果表明：nirK標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒連接及導(dǎo)入成功。nirK克隆成功后，利用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的克隆質(zhì)?！皃clone007-nirK”進(jìn)行濃度檢測(cè)，最終獲得1.74×1010copies/μL含有單拷貝nirK基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pClone007-nirK。獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pClone007-nirK用于nirK基因qPCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建。

圖3 nirK克隆轉(zhuǎn)化子菌液PCR(a)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(b)及pClone007-nirK電泳圖(c)

2.2.2nirS基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

對(duì)測(cè)序成功的849 bp的nirS基因回收產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆，經(jīng)過多種克隆載體嘗試，均不成功。更換nirSPCR引物后，獲得425 bp產(chǎn)物，經(jīng)切膠回收，克隆，獲得單克隆平板，對(duì)轉(zhuǎn)化的21個(gè)克隆子進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，經(jīng)過14～16 h培養(yǎng)后，對(duì)渾濁菌液進(jìn)行菌液PCR和質(zhì)粒PCR，獲得如圖4(a)～(b)所示產(chǎn)物條帶，對(duì)21個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，均含有425 bp的nirS基因。對(duì)單克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)待測(cè)樣品“pClone007-nirS”濃度進(jìn)行檢測(cè)，獲得了濃度為1.10×1010copies/μL的pClone007-nirS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，用于nirS基因qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建。

圖4 nirS克隆轉(zhuǎn)化子菌液PCR(a)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(b)電泳圖

2.2.3narG基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

通過T-A克隆實(shí)驗(yàn)獲得narG克隆轉(zhuǎn)化子，搖菌后對(duì)菌液進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒PCR，電泳檢測(cè)如圖4(a)～(b)。電泳產(chǎn)物切膠回收以引物M13F-R進(jìn)行測(cè)序，獲得628 bp的narG基因。利用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)待測(cè)樣品“pClone007-nirS”進(jìn)行檢測(cè)，獲得了濃度為3.10×1010copies/μL的pClone007-narG標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，用于narG基因qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建。

圖5 narG克隆轉(zhuǎn)化子菌液PCR(a)及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(b)電泳圖

2.3 基于mRNA水平差異表達(dá)的TAC-1菌株SND氮代謝途徑分析

圖6 TAC-1在不同氮源培養(yǎng)條件下的脫氮特性、代謝產(chǎn)物和生長(zhǎng)特性曲線

圖7 基于mRNA水平不同氮源培養(yǎng)條件下TAC-1菌株氮代謝基因差異表達(dá)圖

3 結(jié)論

1) 采用touchdown PCR及T-A克隆，結(jié)合凝膠電泳檢測(cè)和Sanger測(cè)序定性分析了不動(dòng)桿菌屬Acinetobactersp.TAC-1在DNA水平上可能的SND氮代謝途徑，推測(cè)該菌株攜帶硝化過程的新型羥胺氧化酶調(diào)控基因；且反硝化過程亞硝酸還原酶調(diào)控基因nirK和nirS并存；此外菌株中還存在膜結(jié)合硝酸鹽還原酶調(diào)控基因narG，不存在周質(zhì)硝酸鹽還原酶調(diào)控基因napA、一氧化二氮還原酶調(diào)控基因norB及一氧化氮還原酶調(diào)控基因nosZ。