羊肚菌母種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究*

趙航軻，陳 杭，馬 薇，羊玉蓉，降初拉爾布，唐 瑤，劉良珍，唐明先

（甘孜州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000）

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota） 盤菌綱 （Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella）[1-3]，是世界四大珍貴食用菌之一。富含19種氨基酸，其中9種為人體必需氨基酸，約占氨基酸總含量的40%[4]，同時(shí)含有39.7%的碳水化合物及24.5%的蛋白質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖和蛋白質(zhì)[6]具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和降低膽固醇等藥用活性[7-9]，對抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)具有重要意義[10-11]。

羊肚菌母種退化是導(dǎo)致其栽培時(shí)抗逆性差、產(chǎn)量低、品質(zhì)差的重要原因。2018年～2020年，甘孜州羊肚菌栽培面積迅速擴(kuò)大到2 000 hm2，獲得巨大經(jīng)濟(jì)效益，在扶貧攻堅(jiān)中發(fā)揮較大作用。近年來甘孜州部分農(nóng)戶采用自己制備的羊肚菌菌種，不僅因?yàn)榧夹g(shù)和經(jīng)驗(yàn)不足，同時(shí)更因母種自帶雜菌，且營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件不適合菌絲生長和保存，出現(xiàn)了種源混亂、抗逆性差、新型病蟲害增多、品質(zhì)參差不齊、產(chǎn)量差異明顯等問題，給菇農(nóng)造成了巨大損失。若要羊肚菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，必須保障優(yōu)良的母種。因此，對羊肚菌母種的營養(yǎng)及環(huán)境條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，為羊肚菌母種的復(fù)壯、保藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

六妹羊肚菌（Morchella sextelata M.Kuo） 菌株，由甘孜藏族州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母粉5 g、KH2PO41 g、VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將保藏的羊肚菌菌種接種于固體培養(yǎng)基上，置于24℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。

1.2.2 羊肚菌液體種培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

1） 碳源篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種至玉米粉、可溶性淀粉、玉米芯粉、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、甘露醇替代葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，各組分含量保持不變，播床24℃、160 r·m-1避光恒溫培養(yǎng)，每12小時(shí)測量菌絲生長速度，共培養(yǎng)1周后確定最佳碳源，篩選出最適濃度。

2） 氮源篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種至蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、硝酸鈣替代酵母粉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其余培養(yǎng)方法同碳源篩選。

3） 無機(jī)鹽篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種 至 FeSO4、 CaCl2、 NaCl、 K2PO4、 MgSO4·7H2O、MnSO4、K2SO4替代K2HPO4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其余方法同氮源篩選。

4） 生長因子篩選

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌塊分別接種至VB2、VB6、VB7、吲哚乙酸、葉酸、煙酸、赤霉素替代VB1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其余方法同無機(jī)鹽源篩選。

正交法優(yōu)化母種培養(yǎng)基組分：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以最佳碳源、最佳氮源、最佳無機(jī)鹽、最佳生長因子作為4個(gè)影響羊肚菌母種培養(yǎng)基組分的因素，正交試驗(yàn)方案見表1。

表1 母種培養(yǎng)基組分的正交優(yōu)化試驗(yàn)Tab.1 Orthogonal optimization experiment on thecompositions of medium for stock culture

1.2.3 羊肚菌液體菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在最佳培養(yǎng)基基礎(chǔ)上選取透光率為0、20%、40%、60%、80%、100%，使用1%鹽酸和1%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，培養(yǎng)溫度為 18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平正交試驗(yàn)篩選出羊肚菌母種最佳培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)方案見表2。

表2 母種環(huán)境條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)Tab.2 Orthogonal optimization experiment of cultivation conditions for stock calture

2 結(jié)果與分析

2.1 母種培養(yǎng)基組分優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 母種培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)結(jié)果

最佳碳源及最佳濃度的篩選結(jié)果見圖1。

圖1 最佳碳源（A） 及最佳濃度（B） 篩選Fig.1 Screening of optimal carbon source(A)and optimal concentration(B)

如圖1所示，8種碳源均能促進(jìn)菌絲生長，其中以可溶性淀粉為唯一碳源時(shí)，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為 0.83 cm·d-1，且菌絲致密、粗壯、有活力。因此確定可溶性淀粉為最佳碳源，最佳濃度為 20 g·L-1。

最佳氮源及最佳濃度的篩選結(jié)果見圖2。

圖2 最佳氮源（A） 及最佳濃度（B） 篩選Fig.2 Screening of optimal nitrogen source(A)and concentration(B)

如圖2所示，8種氮源均能促進(jìn)菌絲生長，其中以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為0.76 cm·d-1，所以確定蛋白胨為最佳氮源，最佳濃度為5 g·L-1。

最佳無機(jī)鹽及其添加濃度的篩選結(jié)果見圖3。

圖3 最佳無機(jī)鹽（A）及最佳濃度（B）篩選Fig.3 Screening of optimal inorganic salt(A)and optimal concentration(B)

如圖3所示，8種無機(jī)鹽均能促進(jìn)菌絲生長，其中以KH2PO4為唯一無機(jī)鹽時(shí)，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為 0.65 cm·d-1，所以確 KH2PO4為最佳無機(jī)鹽，最佳濃度為1.5 g·L-1。

最佳生長因子及其添加濃度的篩選結(jié)果見圖4。

圖4 最佳生長因子（A）及最佳濃度（B）篩選Fig.4 Screening of optimal growth factor(A)and optimal concentration(B)

如圖4所示，8種生長因子均能促進(jìn)菌絲生長，其中以葉酸為唯一生長因子時(shí)，菌絲生長速度最快（P＜0.05），為 0.61 cm·d-1，因此確定葉酸為最佳生長因子，最佳濃度為10 mg·L-1。

2.1.2 母種培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)

選擇單因素試驗(yàn)最佳碳源可溶性淀粉、最佳氮元蛋白胨、最佳無機(jī)鹽KH2PO4、最佳生長因子葉酸進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化分析，優(yōu)化結(jié)果見表3。

表3 母種培養(yǎng)基組分的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Tab.3 Orthogonal experimental optimization results of the medium compositions for stock culfure

由表3極差R值可知，可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4、葉酸4個(gè)因素對羊肚菌菌絲生長速度的影響主次順序?yàn)椋旱鞍纂?可溶性淀粉>KH2PO4>葉酸（B>A>C>D）。正交試驗(yàn)表明，羊肚菌菌絲生長的最佳培養(yǎng)基為：A2B2C3D2（可溶性淀粉20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、葉酸10 mg·L-1）。同時(shí)對正交結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 母種培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test of medium compositions for stock culture

由表4可知，4個(gè)影響因素中，可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4均達(dá)到極顯著水平，生長因子影響不顯著，即其對菌絲生長速度的影響順序?yàn)椋旱鞍纂?可溶性淀粉>KH2PO4>葉酸（B>A>C>D）。其中氮源影響最大，與極差分析結(jié)果基本一致，因此確定母種最佳培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉20 g·L-1，蛋白胨 5 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，葉酸 10 mg·L-1。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為檢驗(yàn)培養(yǎng)基優(yōu)化工藝的可信度，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作的可行性，采用最優(yōu)培養(yǎng)基組合為可溶性淀粉 20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、葉酸10 m g·L-1，進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到羊肚菌菌絲平均生長速度的驗(yàn)證值為（1.54±0.05） cm·d-1。該結(jié)果明確了利用正交試驗(yàn)法優(yōu)化羊肚菌母種培養(yǎng)基的最佳工藝是有效可行的。

2.2 母種培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 母種培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

母種培養(yǎng)基培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果見圖5。

圖5 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)篩選Fig.5 Single factor test screening of cultivation conditions

由圖5A可知，在透光率為0～20%的條件下菌絲生長速度不斷增加。當(dāng)透光率為20%時(shí)，菌絲生長速度達(dá)到最大，為1.24 cm·d-1；在透光率為20%～100%時(shí)菌絲生長速度緩慢下降。因此，最優(yōu)透光率初步確定為20%。

母種培養(yǎng)基pH優(yōu)化結(jié)果見圖5B。由圖5B可知，初始pH為5.5～6.5時(shí)菌絲生長速度不斷增加；當(dāng)pH為6.5時(shí)，生長速度達(dá)到最大，為1.35 cm·d-1；pH為6.5～8.5時(shí)菌絲生長速度緩慢下降。因此，最佳母種培養(yǎng)基pH確定為6.5。

母種培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度優(yōu)化結(jié)果見圖5C。由圖5C可知，在20℃～24℃時(shí)，隨著溫度的上升菌絲生長速度不斷增加；當(dāng)溫度為24℃時(shí)，生長速度達(dá)到最大，為1.32 cm·d-1，在24℃～28℃條件下菌絲生長速度緩慢下降。因此，培養(yǎng)溫度初步確定為24℃。

2.2.2 母種培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)

由母種培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)最佳條件所設(shè)計(jì)的母種培養(yǎng)基培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 母種培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal test on cultivation conditions for stock culture

由表5極差R值可知，可透光率、初始pH、溫度3個(gè)因素對羊肚菌菌絲生長速度影響主次順序?yàn)椋和腹饴?初始pH>溫度（A>B>C）。正交試驗(yàn)表明，能夠使菌絲生長效果最好的培養(yǎng)條件為：A2B2C3（透光率20%、初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度26℃）。同時(shí)對正交表進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 母種培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)方差分析Tab.6 Variance analysis of orthogonal test of cultivation conditions for stock culture

由表6可知，3個(gè)影響因素中，透光率、初始pH達(dá)到極顯著水平，溫度達(dá)到顯著水平，即其對菌絲生長速度影響的大小順序?yàn)锳>B>C，其中透光率影響效果最顯著，與極差分析結(jié)果基本一致。因此確定培養(yǎng)母種最佳環(huán)境條件為：透光率20.0%、初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度26℃。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交優(yōu)化試驗(yàn)分別對羊肚菌的母種培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳營養(yǎng)條件為：可溶性淀粉20.0 g·L-1、蛋白胨5.0 g·L-1、KH2PO42.0 g·L-1、葉酸 10.0 m g·L-1；最佳母種環(huán)境條件為透光率20.0%、pH 6.5、溫度26.0℃。通過對母種營養(yǎng)條件及環(huán)境條件的優(yōu)化，使羊肚菌菌絲在營養(yǎng)生殖階段初期生長速度快、發(fā)菌整齊致密、爬壁有力，為母種保藏、原種及栽培種制備提供了有力保障。