慢性阻塞性肺疾病中牙槽骨破壞與牙周膜VEGF-A165a表達水平的關(guān)系

黃永松 王婷婷 徐 麗 芮 艷

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，蚌埠 233004）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）與慢性牙周炎（chronic periodontitis， CP）的相關(guān)性研究，目前成為諸多學者關(guān)注的重點[1，2]。研究表明，COPD合并CP（COPD+CP）的患者中，牙周炎的嚴重程度明顯高于單純CP患者，提示COPD對慢性牙周炎的潛在促進作用[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，局部結(jié)締組織的成纖維細胞在受到外界炎癥介質(zhì)刺激后，其釋放的VEGF能誘導破骨細胞形成[4]，其中VEGF的功能與M-CSF相似，能夠刺激破骨細胞前體RANK受體， VEGF還能夠促血管形成，導致單核-巨噬細胞系的破骨細胞前體局部聚集，從而進一步有利于破骨細胞發(fā)生[5]。

本課題組前期研究證實了根尖牙周炎病變處成纖維樣細胞的VEGF-A可變剪接，與根尖區(qū)牙槽骨破壞過程密切相關(guān)，其中A型可變剪接體（VEGF-A165a）與總VEGF-A的比例，與曲面斷層影像中，根尖區(qū)牙槽骨吸收破壞范圍呈正相關(guān)。確認了慢性炎癥狀態(tài)下，根尖區(qū)牙周膜，至少部分憑借VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體刺激局部破骨細胞形成，導致了牙槽骨吸收[6]。而在COPD循環(huán)系統(tǒng)中，炎癥介質(zhì)、代謝產(chǎn)物、細胞因子等生物學大分子的存在，也被證實與牙周炎嚴重程度有關(guān)[7]。隨著COPD病程的增加，VEGF水平增加，與COPD的嚴重程度成正相關(guān)[8]，而VEGF-A165a是VEGF最主要的異構(gòu)體，且未有文獻報道VEGF-A165a在牙周炎患者局部牙周組織表達情況。因此本研究推測COPD合并慢性牙周炎（COPD+CP）患者的牙周膜細胞所處微環(huán)境應不同于單純的慢性牙周炎（CP），可能因此改變了VEGF-A異構(gòu)體的表達，導致骨破壞狀態(tài)改變。為驗證此推論，本研究以COPD+CP的患者及CP患者為模型，通過培養(yǎng)拔除的患牙牙周膜成纖維細胞，對VEGF-A165a的骨破壞作用進行探討，旨在為COPD合并慢性牙周炎疾病的發(fā)病機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對象及分組

選擇2018年7月至2019年12月間在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科就診的COPD伴發(fā)重度牙周炎（CP）患者12例，其中輕、中、重和極重度各3例，年齡68 ～ 86歲，平均年齡（72.1±6.2）歲，男性8例，女性4例。另選取口腔門診診斷為單純性重度牙周炎患者11例，年齡65 ～ 79歲，平均年齡 （70.5±4.6）歲，男性6例，女性5例。兩組病人年齡、選取的拔除患牙各指標無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

納入標準： COPD+CP組：（1）在吸入支氣管擴張劑后，第一秒用力呼氣容積（FEV1）占用力肺活量（FCV）比值（FEV1/FCV<70%），表明存在持續(xù)氣流受限。（2）近3個月未住院行慢阻肺治療的患者，且近3個月未使用激素、抗組胺及抗生素類藥品；（3）所有患者均有≥1顆牙齒松動達III度且牙槽骨吸收≥根長的1/2至2/3，達到拔除指標。（4）近3個月未行系統(tǒng)的牙周治療。CP組：（1）沒有任何基礎(chǔ)性疾??；（2）沒有吸煙等不良習慣；（3）所有患者均有≥1顆牙齒松動達III度且牙槽骨吸收≥根長的1/2至2/3，達到拔除指標。（4）近3個月未行系統(tǒng)的牙周治療。

本研究通過蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢查 COPD分級參考《內(nèi)科學》第8版GOLD 2018年度分級標準[9]。牙周檢查：參考《牙周病學》第4版慢性牙周炎分型的重度[10]：牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm，牙槽骨吸收超過根長的1/2至2/3。選取兩組患者對拔除的患牙進行檢測記錄，檢測指標包括牙槽骨吸收程度，探診深度、附著喪失、齦溝出血指數(shù)，菌斑指數(shù)。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將拔除的患牙，以及拔牙手術(shù)中刮除根尖區(qū)炎癥性牙周膜組織的病例，收集其新鮮手術(shù)標本，分離培養(yǎng)病變狀態(tài)的牙周膜成纖維細胞，采用文獻[4]的方法進行原代培養(yǎng)。使用α-MEM（GIBCO，GrandIsland，NY，USA） 培養(yǎng)基。破骨細胞前體 raw264. 7使用DMEM培養(yǎng)基（GIBCO）。培養(yǎng)條件為37 ℃，95 %濕度，5%CO2。所有培養(yǎng)基含1%雙抗（ 青霉素100 U/mL，鏈霉素100 g/mL） ，2 mM L-谷氨酰胺，10% 胎牛血清（ fetal bovine serum，F(xiàn)BS， GIBCO）。

1.2.3 制備條件培養(yǎng)基和誘導破骨細胞 培養(yǎng)病變的牙周膜成纖維細胞，制備條件培養(yǎng)基[4]。細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，至匯合度70% ～ 80%，更換無血清 α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 7 d，550×g離心10 min，棄沉淀后，以50%上清，40%新鮮α-MEM，10% FBS和 20 ng/μl 重 組 鼠 RANKL（R&D，Minneapolis，MN，USA）混合制備條件培養(yǎng)基。破骨前體細胞（Raw 264.7細胞）以1 000個/孔接種于24孔板，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔日換液至第10 d，以抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate- resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒（TRAP kit，廠商 ： Sigma，St. Louis，MO，USA） 染色。破骨細胞計數(shù)：僅TRAP陽性且細胞核不少于3個的細胞（TRAP+MNCs）。

1.2.4 RNA提取及real-time PCR 采用TRIzol Reagent（Life Technologies， Carlsbad，California，USA）提取細胞總RNA，2 μg總RNA制備cDNA用第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life Technologies）。20 μl real-time PCR反應體系，以Light Cycler real-time PCR system（Roche Diagnostics Ltd，Shanghai，China） 運行，程序 ： 95℃ 10 min，退火延伸 40個循環(huán)，60 ℃ 1 min，95℃ 15 min[4]。所有異構(gòu)體相對表達量由β-actin校準。VEGF-A引物序列參照相關(guān)文獻[12]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 牙周膜成纖維細胞中VEGF-A165a的表達水平

兩組牙周膜成纖維細胞狀態(tài)相同，細胞呈典型的梭形成纖維細胞樣（圖1）。COPD+CP組表達VEGF-A165a（0.025±0.017 ） 水平高于CP組（0.012±0.007）（P<0.05）。PCR結(jié)果顯示重度和極重度組的牙周膜成纖維細胞的VEGF-A165a表達水平均高于輕度組（P<0.05），由此提示牙周膜患者中的VEGF-A165a的表達水平與COPD的患病程度密切相關(guān)。

圖1 CP和COPD+CP組的牙周膜成纖維細胞（40×）

2.2 牙周膜成纖維細胞條件培養(yǎng)基誘導破骨效應

相比CP組， COPD+CP組患者的牙周膜成纖維細胞的條件培養(yǎng)基能誘導更多的破骨細胞形成（P<0.05）。重度組與極重度組基誘導破骨細胞的數(shù)量均高于輕度組（P<0.05），詳見表1、2和圖2、3。

圖2 CP組和COPD+CP組誘導破骨細胞效應

表1 COPD+CP組VEGF-A165a相對表達量及誘導破骨細胞數(shù)量對比（）

表1 COPD+CP組VEGF-A165a相對表達量及誘導破骨細胞數(shù)量對比（）

指標 COPD+CP輕度(n=3) COPD+CP 中度(n=3) COPD+CP 重度(n=3) COPD+CP 極重度(n=3)VEGF-A165a 0.014±0.006 0.09±0.009 0.036±0.012 0.042±0.011破骨細胞誘導數(shù)量 12.187±1.630 10.667±9.018 25.317±4.531 31.250±4.234

表2 CP組和COPD+CP組的VEGF-A和VEGF-A165a表達水平（）

表2 CP組和COPD+CP組的VEGF-A和VEGF-A165a表達水平（）

指標 CP組(n=11) COPD+CP組(n=12) P值VEGF-A 0.071±0.059 0.107±0.041 0.138 VEGF-A165a 0.012±0.007 0.025±0.017 0.026*破骨細胞誘導數(shù)量 10.205±3.796 19.859±11.059 0.012*

2.3 相關(guān)性分析

雙變量Perason檢驗結(jié)果顯示，兩組牙周膜成纖維細胞VEGF-A165a相對表達量與拔除患牙的臨床指標，均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。而VEGF- A165a相對表達量與破骨細胞誘導效率，無論是CP組（R=0.658）還是COPD+CP組（R=0.830）均為正相關(guān)性，且有統(tǒng)計學意義（P<0.05），詳見表3和圖4。

圖4 2組VEGF-A165a相對表達量與破骨細胞的相關(guān)性分析

表3 VEGF-A165a相對表達量與CP組和COPD+CP組各指標的相關(guān)性分析

3 討論

本文探討了VEGF基因可變剪接和牙槽骨破壞的關(guān)系。VEGF可通過可變剪接產(chǎn)生多種mRNA， 如 VEGF-A121、VEGF-A165、VEGF- A189等，VEGF能誘導破骨細胞形成[6]。基于課題組前期研究中，證實了根尖周囊腫的骨破壞與VEGFA165a表達量正相關(guān)[6]。因此，本研究在牙周炎中探索VEGF-A165a表達量與破骨細胞發(fā)生的關(guān)系，并研究COPD對該過程的影響。

圖3 CP組和COPD+CP組VEGF-A165a表達水平及破骨誘導效率

目前對于特定的VEGF異構(gòu)體對破骨細胞分化過程中的作用尚有待研究。本研究采用了提取慢性牙周炎中局部牙周膜成纖維細胞進行體外培養(yǎng)，觀察VEGF-A165a其對破骨細胞的誘導效率和COPD分級的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)COPD+CP組表達更高水平的VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體（P<0.05），也能誘導更多的破骨細胞形成。說明COPD實際上加重了牙周炎局部牙周膜細胞中的VEGF-A165a表達，而隨之導致了牙周炎局部破骨細胞形成效率增高，此結(jié)果與COPD改變循環(huán)炎癥因子的報道相一致[11]，這個經(jīng)循環(huán)炎癥因子改造的局部病變微環(huán)境，也賦予了牙周膜間質(zhì)細胞更高的破骨細胞誘導效率。

在COPD+CP組，重度組和極重度組也會表達出更高水平的VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體。此結(jié)果進一步顯示了VEGF-A165a異構(gòu)體的表達，可能是因COPD肺功能分級而變化的，隨COPD肺功能的降低而在牙周炎部位表達增加，導致牙槽骨部位出現(xiàn)更多破骨細胞。有學者研究發(fā)現(xiàn)VEGF水平的升高，與COPD預后不良有關(guān)，隨著COPD病程的增加，VEGF水平增加，與COPD的嚴重程度成正相關(guān)[12]。但是由于樣本量較少，實驗的結(jié)果還需要充實，來證實VEGF-A165a型可變剪接異構(gòu)體與COPD肺功能分級相關(guān)。

同時兩組的VEGF-A165a相對表達量與拔除患牙的臨床指標進行Perason相關(guān)性分析，均無相關(guān)性（P>0.05），且臨床指標兩組差異無統(tǒng)計學意義，這可能是我們選擇的牙齒都是III度松動的達到拔牙指標的牙齒，而使得拔除患牙的臨床指標的無差異性。然而，無論是CP組還是COPD+CP組，VEGF-A165a相對表達量和破骨細胞誘導效率都是成正相關(guān)性，且有統(tǒng)計學意義。這提示我們不是因為牙周狀態(tài)不同而造成的破骨細胞生成的差異，而是VEGF-A165a不同造成的破骨細胞的差異。

4 結(jié)論

本研究提示：COPD+CP組的VEGF-A165a表達量和破骨細胞誘導效率均高于CP組，且重度和極重度比輕度COPD組更明顯；VEGF-A165a異構(gòu)體的表達，可能因COPD肺功能分級而變化。該研究結(jié)果為臨床干預COPD合并慢性牙周炎的治療研究提供了一個潛在靶點。