基因編輯技術(shù)及其在農(nóng)作物中的應(yīng)用進展

閆磊， 張金山， 朱健康，3*， 夏蘭琴*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081； 2. 山東舜豐生物科技有限公司，濟南 250399； 3.南方科技大學前沿生物技術(shù)研究院，廣東 深圳 518055）

隨著全球人口的不斷增長、氣候變暖、耕地和水資源不斷減少，糧食安全將面臨巨大挑戰(zhàn),即使保持現(xiàn)有耕地面積不變，到2030年糧食單產(chǎn)仍需提高1/3以上[1]。農(nóng)作物的傳統(tǒng)育種方法在很大程度上依賴于自然變異或人為通過化學和物理誘變產(chǎn)生的隨機突變，育種周期長、效率較低、成本較高，因此僅僅依靠傳統(tǒng)育種技術(shù)難以達到預期目標。近年來興起的基因編輯技術(shù)能夠?qū)δ繕嘶蜻M行定點編輯，實現(xiàn)基因組DNA片段的敲除、插入和替換等修飾，該技術(shù)將顛覆農(nóng)作物傳統(tǒng)育種模式，實現(xiàn)精準化品種改良[2]。因此，利用基因編輯技術(shù)快速、定向創(chuàng)制農(nóng)作物新種質(zhì)，加快農(nóng)作物新品種培育進程，是保障我國乃至世界糧食安全以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。

目前，應(yīng)用較為廣泛的基因編輯技術(shù)主要包括 3 種：鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription-like activator effector nucleases, TALENs)和 CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated nuclease)，這3類基因編輯技術(shù)均能對植物基因組進行精準的定點敲除、插入和替換[3-6]。其中，CRISPR/Cas系統(tǒng)作為第三代基因組編輯技術(shù)，能夠進行基因敲除、單堿基編輯、基因定點替換和插入以及引導編輯(prime editing，PE)，已成為農(nóng)作物基因功能驗證和遺傳改良的重要工具和研究熱點[2,7]。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)中研究和應(yīng)用最為廣泛的是Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Ⅴ型CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，這些技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、大豆等基因功能研究和重要農(nóng)藝性狀(產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆和抗病蟲等)的遺傳改良[8-12]。同時，科研人員也通過不斷地研發(fā)新型基因編輯工具，進一步擴展CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯范圍，提高其定點編輯和修飾效率，并降低脫靶頻率。

1 CRISPR/Cas介導的基因敲除及其在農(nóng)作物中的應(yīng)用

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)通過引起基因組DNA目標區(qū)域雙鏈斷裂，進而通過非同源末端連接修復（non-homologous end-joining，NHEJ）或同源重組修復 (homology directed repair, HDR）2種方式對基因組進行修復，基因敲除即是通過NHEJ修復方式使目標基因產(chǎn)生隨機插入、缺失或堿基替換變異，導致基因移碼突變或提前終止[13-16]。目前在農(nóng)作物中已報道了多項利用CRISPR/Cas系統(tǒng)進行基因敲除的研究，這些研究創(chuàng)制了不同農(nóng)作物多個重要基因的突變體，為農(nóng)作物基因功能研究和育種應(yīng)用提供了優(yōu)異基因資源。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在農(nóng)作物產(chǎn)量改良中的應(yīng)用

提高農(nóng)作物產(chǎn)量是保障我國糧食安全的首要需求，產(chǎn)量性狀是復雜的數(shù)量性狀，一般由多個基因控制。目前，利用基因編輯技術(shù)已對多個控制農(nóng)作物產(chǎn)量性狀的基因進行了編輯，例如水稻穗粒數(shù)基因OsGn1a、穗型基因OsDEP1、穗粒數(shù)和分蘗數(shù)相關(guān)基因OsIPA1以及粒型和粒重相關(guān)基因OsGW2、OsGW5、OsTGW6和OsGS3等[9,17-20];OsPYLs基因家族的3個成員編輯突變后，水稻的生物量和產(chǎn)量都顯著增加[21]；通過編輯非編碼基因OsmiRNA396S實現(xiàn)水稻高效氮肥利用，從而達到增加產(chǎn)量的目的[22]。小麥粒重相關(guān)基因TaGW2、TaGASR7等也被作為提高產(chǎn)量的靶標基因進行定點編輯[23-26]。Zhang等[27]對小麥氮素利用相關(guān)基因TaARE1進行敲除，創(chuàng)制了氮利用效率和產(chǎn)量提高的小麥新種質(zhì)。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在農(nóng)作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用

農(nóng)作物的品質(zhì)性狀也是重要的育種改良目標之一，重要的品質(zhì)性狀包括淀粉和蛋白質(zhì)含量、食味品質(zhì)、營養(yǎng)成分含量等指標。通過定點編輯水稻和小麥淀粉分支酶基因OsSBEIIb和TaSBEIIa，成功創(chuàng)制了高抗性淀粉水稻和小麥新種質(zhì)，對于降低糖尿病、高血脂等慢性疾病風險具有重要意義[7,12]。Hui等[8]對水稻控制香味性狀的OsBADH2基因進行編輯，改良了水稻的香味品質(zhì)。Dong等[28]對玉米淀粉合成相關(guān)基因ZmWX與ZmSH2同時敲除，創(chuàng)制了甜糯玉米新材料。Sanchez等[29]對小麥α醇溶蛋白基因進行敲除，能夠顯著降低小麥籽粒醇溶蛋白含量，提高小麥加工品質(zhì)。Wang等[30]通過敲除大豆脂肪氧化酶基GmLOX，可以快速在主推大豆品種中疊加無豆腥性狀，提升大豆加工和營養(yǎng)品質(zhì)的同時不影響其他主要農(nóng)藝性狀。Chen等[31]對棉花種子油脂合成代謝過程中的關(guān)鍵基因FAD2進行編輯，創(chuàng)制了能夠提高棉籽油品質(zhì)的高油酸棉花新種質(zhì)。

1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)在農(nóng)作物抗逆性改良中的應(yīng)用

生物或非生物脅迫會直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，通過基因編輯技術(shù)可有效提高農(nóng)作物的抗逆境和抗病能力。通過敲除小麥白粉病抗性基因TaMLO能夠顯著提高小麥白粉病抗性[32]。對小麥條銹病易感基因TaPsIPK1進行敲除，創(chuàng)制了具有條銹病廣譜抗性的小麥材料[33]。對水稻糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因OsSWEET的啟動子區(qū)域進行編輯，破壞其感病效應(yīng)蛋白結(jié)合元件，提高了水稻對白葉枯病的抗性[11]。對柑橘中的易感病基因CsLOB1啟動子進行靶向修飾，提高了柑橘對潰瘍病的抗性[34]。通過敲除水稻OsVQ25基因，顯著提高了水稻對稻瘟菌及白葉枯菌的廣譜抗性[35]。

1.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)在農(nóng)作物育種技術(shù)研發(fā)中的應(yīng)用

農(nóng)作物傳統(tǒng)育種方法具有技術(shù)復雜、人力投入大、周期長等不足，新興的基因編輯技術(shù)能夠為農(nóng)作物育種提供新的思路，在單倍體誘導、雜交制種、雜種優(yōu)勢固定以及多基因聚合育種的應(yīng)用中取得了多項進展。通過編輯玉米單倍體誘導基因PLA1/MTL、DMP和PLD3，可以高效創(chuàng)制地玉米單倍體誘導系[36-39]。對小麥著絲粒特異組蛋白基因TaCENH3進行編輯，也能夠創(chuàng)制高效的小麥單倍體誘導系[40]。同時，基因編輯技術(shù)也推動了雜交制種技術(shù)不斷進步，通過操縱玉米育性基因ZmMs26，并利用熒光標記進行篩選，可以在一代獲得雄性不育系和保持系，大大縮短了育種周期[41]。水稻雜種優(yōu)勢固定的研究也借助基因編輯技術(shù)取得了重大突破：①基因編輯技術(shù)敲除3個或減數(shù)分裂相關(guān)的基因（MiMe）以獲得二倍體配子，并同時在卵細胞中異位表達BBM1使卵細胞直接發(fā)育成胚；②同時敲除PAIR1、REC8、OSD1和MTL4個內(nèi)源基因，均成功創(chuàng)制了無融合生殖的雜種優(yōu)勢固定的水稻材料[42-43]。聚合多個優(yōu)異基因也是農(nóng)作物改良的重要手段，但是基因聚合育種的周期長且難度大。為了解決這一問題，Luo等[44]建立了小麥多基因編輯技術(shù)體系，成功實現(xiàn)了小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因TaQsd1、氮吸收利用基因TaARE1、株型相關(guān)基因TaNPT1、支鏈淀粉合成基因TaSBEIIa和磷轉(zhuǎn)運相關(guān)基因TaSPDT共5個基因的同時編輯，在T1代即可獲得無轉(zhuǎn)基因、多個優(yōu)異等位基因聚合的小麥新種質(zhì)，為加速農(nóng)作物多基因聚合育種提供了有力的技術(shù)支持。

1.6 CRISPR/Cas系統(tǒng)在農(nóng)作物快速馴化中的應(yīng)用

農(nóng)作物在馴化和育種過程中，重要農(nóng)藝性狀改良的同時也會造成基因遺傳多樣性的大量丟失，基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)使農(nóng)作物野生種和祖先種實現(xiàn)快速從頭馴化成為了可能。Li等[45]選用天然抗逆性的野生番茄品種醋栗番茄作為底盤材料，對調(diào)控開花光周期敏感性、株型和果實成熟的基因SP和SP5G的編碼區(qū)、控制果實大小的基因CLV3和WUS以及維生素C合成酶基因GGP1的調(diào)控區(qū)進行了定點編輯，消除了野生番茄開花的光周期敏感性，馴化出株型緊湊、果實大小和維生素C含量顯著提高的新型番茄，同時還保持了野生番茄的耐鹽堿和抗病性狀。Yu等[46]在對異源四倍體野生水稻進行高質(zhì)量基因圖譜和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的基礎(chǔ)上，對四倍體野生稻的相關(guān)馴化基因包括落?；騫SH-1、芒長基因An-1，綠色革命基因SD1、粒長基因GS3以及理想株型基因IPA1進行基因編輯，獲得了表型為不落粒、芒長變短、株高降低、莖稈粗壯、開花期縮短等系列突變體。通過基因編輯實現(xiàn)野生近緣植物的快速馴化，為精準設(shè)計和快速創(chuàng)制農(nóng)作物新種質(zhì)提供了新的策略。

2 堿基編輯系統(tǒng)及其在農(nóng)作物中的應(yīng)用

2.1 堿基編輯系統(tǒng)的原理及類型

單核苷酸變異是農(nóng)作物許多重要農(nóng)藝性狀改良的遺傳基礎(chǔ)，因此開發(fā)一種精準和高效的堿基替換技術(shù)對農(nóng)作物精準育種具有重要意義。2016年，David R. Liu實驗室開創(chuàng)性地研發(fā)了基于胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯系統(tǒng)（base editing），首次將CRISPR/Cas系統(tǒng)從切割DNA的“分子剪刀”變?yōu)榭梢愿膶懱囟▔A基的“修正器”，擴展了基因組精準編輯技術(shù)體系[47-48]。目前，已被廣泛應(yīng)用的單堿基編輯系統(tǒng)主要有3種：能夠?qū)崿F(xiàn)C:G到T:A轉(zhuǎn)換的胞嘧啶單堿基編輯系統(tǒng)(cytosine base editor, CBE)、A:T到G:C轉(zhuǎn)換的腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor，ABE)以及 C:G 到 G:C 轉(zhuǎn)換的堿基編輯器（C-to-G base editor，CGBE）。堿基編輯系統(tǒng)（圖1）使單個核苷酸的精準替換成為可能，能夠使靶基因產(chǎn)生功能缺失或功能獲得型突變，在作物基因功能研究、遺傳改良和目標基因定向進化中具有重大的應(yīng)用潛力[49-52]。

2.2 CBE堿基編輯系統(tǒng)及其在農(nóng)作物改良中的應(yīng)用

CBE系統(tǒng)主要由具有切口酶活性的nCas9、不具有核酸酶活性的dCas9或者dCas12a蛋白，以及胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（uracil glycosylase inhibitor，UGI）融合而成[53]（圖1B）。為了提高單堿基編輯效率、縮小編輯窗口、擴展編輯范圍、降低脫靶頻率等，先后建立了編輯效率提高的CBE4、BE4max、AncBE4max、FNLS-BE3、evorAP OBEC1、evoFERNY和evoCDA1系統(tǒng)[54]，編輯窗口縮小的YE1-BE3、YE2-BE3和YEE-BE3系統(tǒng)[55]，單堿基替換活性更高和indel發(fā)生頻率更低的AID堿基編輯器[56]，Indel發(fā)生頻率降低的BE3-Gam、SaBE3-Gam、BE4-Gam、SaBE4-Gam 和 eBE-S3系統(tǒng)[57]，以及編輯范圍擴展的LbCas12a-BE0、xBE3、CBE-NG、CBE-SpG和CBE-SpRY堿基編輯器[58-61]。

圖1 CRISPR/Cas介導的基因編輯技術(shù)［12］Fig. 1 CRISPR/CAS-mediated gene editing technology［12］

近年來，CBE堿基編輯系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物性狀改良研究[49]。植物CBE系統(tǒng)最初是由本實驗室和多個研究團隊同時建立[54,62-63]，利用CBE3堿基編輯器成功在水稻八氫番茄紅素脫氫酶基因OsPDS和淀粉分支酶Ⅱb基因OsSBEIIb的3個靶點實現(xiàn)了單堿基編輯，編輯效率高達20%左右。與此同時，利用CBE3堿基編輯器獲得了穩(wěn)定遺傳的水稻硝轉(zhuǎn)運蛋白基因OsNRT1.1B和水稻側(cè)根發(fā)育基因OsSLR1的單堿基編輯植株，編輯效率分別為2.7%和13.3%[63]。利用堿基偏好性消除的單堿基編輯系統(tǒng)rBE5對水稻花發(fā)育基因OsPi-d2進行了精準編輯，獲得了抗稻瘟病的水稻新種質(zhì)[56]。此外，通過對番茄、馬鈴薯、西瓜和擬南芥等多種植物的乙酰乳酸合成酶基因ALS進行單堿基替換，獲得了一系列抗除草劑的編輯植株[64-67]。在異源四倍體棉花中也建立了高效的單堿基編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)了1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因GhCLA和磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因GhPEBP的定點突變[68]。在六倍體小麥中，利用CBE系統(tǒng)成功編輯了小麥抗除草劑基因TaALS和TaACC，創(chuàng)制了一系列抗除草劑小麥新種質(zhì)，為麥田雜草防治提供了新材料[54,69]。

2.3 ABE堿基編輯系統(tǒng)及其在農(nóng)作物改良中的應(yīng)用

ABE系統(tǒng)主要由具有切口酶活性的nCas9、不具有核酸酶活性的dCas9或者dCas12a蛋白與腺嘌呤脫氨酶融合而成[50,56]（圖1C）?？蒲腥藛T對ABE系統(tǒng)的優(yōu)化主要集中在提高堿基編輯效率、擴大 PAM（protospacer adjacent motif）選擇范圍和降低可預測脫靶效應(yīng)方面。通過優(yōu)化腺嘌呤脫氨酶二聚體的位置、核定位信號肽（nuclear location signal，NLS）的位置和個數(shù)以及使用不同單鏈向?qū)NA（single-stranded guide RNA，sgRNA）的形式，將ABE系統(tǒng)的堿基編輯效率在小麥和水稻中提高了1.1倍[51]。通過優(yōu)化密碼子序列和增加NLS的個數(shù)構(gòu)建了ABEmax，提高了堿基替換的效率[70]。為了提高ABE編輯系統(tǒng)的效率，進一步通過突變腺嘌呤脫氨酶TadA的8個氨基酸位點構(gòu)建了TadA8e，大大提高了ABE堿基編輯的效率[71]。最近，Tan等[72]開發(fā)了一種更有效的腺嘌呤堿基編輯器 PhieABEs（plant high-efficiency ABEs），該 系 統(tǒng)利用高活性腺嘌呤脫氨酶TadA8e、單鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）與廣靶向性的SpCas9變體，相較于一般的ABE8e系統(tǒng)，它具有更高的堿基編輯活性和更寬的堿基編輯寬度。Yan等[73]通過對TadA8e引入2個突變V82S和Q154R，構(gòu)建了更高效的腺嘌呤脫氨酶TadA9。與TadA8e相比，TadA9擴展了編輯窗口范圍，同時對一些以往難以編輯的內(nèi)源靶點，表現(xiàn)出更強的編輯能力。

目前，ABE系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物性狀改良的研究和應(yīng)用中。利用SaCas9的nCas變體與突變的TadA酶融合，構(gòu)建了ABEP2，可在水稻基因組某些位點實現(xiàn)高達61.3%的堿基編輯效率[47,74]。Li等[48]利用nCas9融合大腸桿菌野生型腺嘌呤脫氨酶（ecTadA）和人工定向進化的腺嘌呤脫氨酶（ecTadA*）二聚體優(yōu)化了ABE系統(tǒng)，在水稻中實現(xiàn)了高達59.1%的A→G編輯效率。Kang等[75]利用ABE系統(tǒng)在擬南芥及油菜中實現(xiàn)了對八氫番茄紅素脫氫酶基因PDSmRNA的可變剪接。Wei等[76]利用ABE8e系統(tǒng)對水稻淀粉合成基因OsWaxy和除草劑抗性基因OsALS進行了定點編輯，編輯效率最高可達100%。

2.4 CGBE堿基編輯器

盡管CBE和ABE系統(tǒng)在已在不同植物中廣泛應(yīng)用，但只能誘導堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換而不能發(fā)生堿基顛換。CGBE是一種新型堿基編輯器，該系統(tǒng)由rAPOBEC1胞苷脫氨酶變體(R33A)、nCas9(D10A)和 尿 嘧 啶 DNA 糖 基 化 酶 (uracil DNA glycocylase，UNG)組成，能夠在哺乳動物細胞和植物中進行C→G編輯。Tian等[77]對CGBE系統(tǒng)進一步優(yōu)化，獲得了可以在水稻中實現(xiàn)高效C＞G編輯的OsCGBE03堿基編輯器，對5個水稻內(nèi)源基因(OsIPA1、OsbZIP5、OsSLR1、OsALS1和OsNRT1.1 B)的C→G平均編輯效率可達21.3%。CGBE系統(tǒng)為植物育種中產(chǎn)生更多的堿基替換類型以及種質(zhì)資源創(chuàng)新提供了有力工具。

2.5 堿基編輯系統(tǒng)在農(nóng)作物定向進化中的應(yīng)用

傳統(tǒng)育種中的基因誘變方法往往存在靶向性不足、突變隨機性較大等不足，利用堿基編輯系統(tǒng)可以對重要基因關(guān)鍵位點進行飽和氨基酸突變，構(gòu)建目的基因片段突變文庫，實現(xiàn)重要農(nóng)藝性狀基因的定向進化。Li等[78]構(gòu)建了新型的飽和靶向內(nèi)源基因突變堿基編輯器（saturated targeted endogenous mutagenesis editors，STEME），該系統(tǒng)在水稻原生質(zhì)體中C→T誘導效率高達61.61%，C→T和A→G同時突變的效率高達15.50%。利用該系統(tǒng)對水稻乙酰輔酶A羧化酶基因OsACC進行飽和突變，并對再生植株進行除草劑篩選，鑒定到3個新的除草劑抗性突變位點：P1927F、S1866F和A1884P。其中，P1927F突變表現(xiàn)出強除草劑抗性，具有較高的生產(chǎn)應(yīng)用價值。Kuang等[79]利用胞嘧啶單堿基編輯器rBE9以及腺嘌呤單堿基編輯器rBE14對水稻乙酰乳酸合酶基因OsALS1進行了飽和突變，通過抗除草劑鑒定，篩選到4個新的抗除草劑等位基因。Wang等[80]利用優(yōu)化的CBE和ABE以及兼具腺嘌呤和胞嘧啶堿基編輯功能的雙元編輯器ACE，對水稻乙酰輔酶A羧化酶基因OsACCase進行飽和突變及定向進化，最終獲得了多個新的具有除草劑抗性的突變類型。

3 CRISPR/Cas介導的HDR及在農(nóng)作物中的應(yīng)用

3.1 CRISPR/Cas介導的HDR

CRISPR/Cas介導的NHEJ突變效率較高，并且已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳改良應(yīng)用中，但是農(nóng)作物改良中往往需要將優(yōu)異等位基因精準引入植物中。這就需要利用HDR介導的基因組精準編輯技術(shù)，來實現(xiàn)優(yōu)異等位基因的定點替換和插入（圖1A）。目前，在許多農(nóng)作物中已實現(xiàn)HDR介導的基因組精準編輯，但是鑒于HDR的低效率和植物細胞中供體模板遞送的局限性，進行HDR介導的農(nóng)作物精準基因編輯仍然存在較大的困難和挑戰(zhàn)[81]。

3.2 在農(nóng)作物改良中的應(yīng)用

本實驗室分別利用CRISPR/Cas9和CRISPR/LbCpf1系統(tǒng)成功實現(xiàn)了水稻抗除草劑基因OsALS的等位替換，通過同時改變其第548和第627位的2個氨基酸，賦予了水稻對磺酰脲類除草劑的抗性[8,82]。進一步利用RNA轉(zhuǎn)錄本作為修復模板，通過HDR方式實現(xiàn)了OsALS的等位基因替換，首次在植物細胞中建立了RNA轉(zhuǎn)錄本作為修復模板介導的同源重組修復體系[83]。同時，還將粳稻中的氮吸收相關(guān)基因NRT1.1B替換為秈稻品種的有利等位基因，以提高其氮素利用效率[84]。Li等[85]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯大豆第4號染色體上的2個基因位點DD20和DD43，并在T1代檢測到了DD43的HDR事件。該團隊還使用CRISPR/Cas9將單鏈寡核苷酸（single-stranded oligonucleotides，ssODNs）或雙鏈DNA作為修復模板，將ALS第165位的脯氨酸替換為絲氨酸，創(chuàng)制了抗除草劑玉米[86]。在木薯和亞麻中已實現(xiàn)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS）中2個氨基酸的替換（T102I/P106S），創(chuàng)制了抗草甘膦除草劑的新材料[87-88]。Wang等[89]將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和小麥矮化病毒（wheat dwarf virus，WDV）雙生載體系統(tǒng)整合，實現(xiàn)了水稻中外源基因的定點插入，其效率最高可達到19%。Shi等[90]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在玉米中實現(xiàn)了乙烯負調(diào)控因子ARGOS8基因啟動子的替換，以增加ARGOS8基因的表達，提高了干旱脅迫下的玉米產(chǎn)量。此外，在擬南芥和番茄等作物中，通過CRISPR/Cas9引起雙鏈斷裂實現(xiàn)了同源染色體靶位點間的同源重組修復，為作物精準育種提供了有效策略[91-92]。

3.3 CRISPR/Cas介導HDR的優(yōu)化

為進一步提高CRISPR/Cas介導的HDR效率，多項研究采用不同策略進行了嘗試。Gil-Humane等[93]采用攜帶CRISPR/Cas9和DRT的小麥矮化病毒（WDV）復制子的策略，將編輯內(nèi)源性泛素基因的HDR效率較非病毒傳遞方法提高了12倍。Vu等[94]利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在番茄中發(fā)現(xiàn)多復制子系統(tǒng)可以有效地將HDR效率提高約3倍，尤其是在溫度較高的環(huán)境下對HDR效率的提升更為顯著。Huang等[95]通過突變LbCas12a的氨基酸（D156R）獲得了編輯效率更高的ttLbCas12a，在煙草中實現(xiàn)了更高效的基因敲入。Aird等[96]采用將ssODNs與Cas/sgRNA的核糖核蛋白復合體（ribonucleo protein，RNP）共價結(jié)合的方法使HDR效率提高了30倍。Miki等[97]使用卵細胞和早期胚胎特異性DD45基因啟動子驅(qū)動SpCas9表達并結(jié)合二代轉(zhuǎn)化策略，在擬南芥中提高了HDR介導的基因敲入和基因替換的效率。該團隊將供體DNA片段進行硫代修飾和磷酸化修飾，極大地提高了CRISPR/Cas9介導的靶向敲入效率，最高可達47.3%。進一步開發(fā)了重復片段介導的同源重組（tandem repeats-HDR，TR-HDR）方法，通過將修飾的片段靶向敲入至目標位點制造的串聯(lián)重復結(jié)構(gòu)，能夠誘導TR-HDR實現(xiàn)片段替換，該策略的基因替換效率最高可達11.4%，這項技術(shù)的突破將大大促進農(nóng)作物定向遺傳改良的進程[98]。此外，過表達DNA修復蛋白RAD51能夠顯著提高動物胚胎細胞中CRISPR/cas9介導的基因敲入效率，該策略為在植物中進一步提高HDR效率提供了重要參考[99]。

4 引導編輯技術(shù)

2019年，一種新型的基因組精確編輯技術(shù)——引導編輯（prime editing，PE）系統(tǒng)問世。該系統(tǒng)利用nSpCas9（H840A）和經(jīng)過工程化改造的M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄酶融合構(gòu)建了引導編輯器（prime editor），由引導編輯向?qū)NA（prime editing guide RNA，pegRNA）中向?qū)NA部分引導在基因組靶點位置附近形成編輯鏈上的單鏈切口，進而通過pegRNA中的引導結(jié)合位點（primer binding site，PBS）序列引導逆轉(zhuǎn)錄酶工作，以利用含有目標編輯序列的逆轉(zhuǎn)錄模板（RT template）將突變精確導入基因組中。該系統(tǒng)在不產(chǎn)生DSB或引入供體DNA的情況下，在哺乳動物細胞中實現(xiàn)小片段的插入、缺失和12種類型堿基-堿基的任意轉(zhuǎn)換，相對于CRISPR介導、依賴于HDR的精確編輯，引導編輯的效率更高，副產(chǎn)物更少；而相對于堿基編輯，引導編輯也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[100]（圖1D）。

4.1 引導編輯技術(shù)在農(nóng)作物中的應(yīng)用

在此基礎(chǔ)上，多家實驗室構(gòu)建了適于植物表達的引導編輯工具PPE（plant prime editing）系統(tǒng)，并成功地在水稻、小麥、玉米等作物中實現(xiàn)了基因組精準編輯。Lin等[101]通過PPE系統(tǒng)在水稻和小麥原生質(zhì)體中實現(xiàn)了多個內(nèi)源基因的精準編輯，獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準刪除的水稻植株。Li等[102]將水稻密碼子優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體融合在具有雙核定位信號的nCas9蛋白的C末端，使用玉米增強型啟動子Ubiquitin驅(qū)動該融合基因表達，并添加了具有增強mRNA穩(wěn)定性的多聚腺苷酸（polyA）結(jié)構(gòu)和豌豆Rubisco小亞基E9終止子終止轉(zhuǎn)錄和翻譯；同時使用水稻組成型Actin啟動子驅(qū)動pegRNA和sgRNA的共表達，采用體內(nèi)可自我剪切的tRNA間隔，構(gòu)建了高效的植物引導編輯系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)分別對水稻外源潮霉素抗性基因hptII和內(nèi)源草甘膦靶標蛋白基因OsEPSPS進行精準編輯，成功獲得了突變基因精準修飾的純合植株和雜合植株，精確編輯效率分別為9.38%和2.22%[102]。Tang等[103]在水稻中對PE2、PE3、PE3b系統(tǒng)進行測試，引導編輯效率為0.05%～0.15%，該研究通過增加核定位信號的數(shù)量等方法使引導編輯系統(tǒng)的效率提升至1.55%。Xu等[104]利用自切割多肽串聯(lián)表達PE系統(tǒng)使篩選標記和逆轉(zhuǎn)錄酶共表達，并由玉米Ubi啟動子驅(qū)動，同時使用增強型的 SgRNA（esgRNA scaffold）作為pegRNA的骨架結(jié)構(gòu)，使得編輯效率平均提高8倍以上，最高可達26%。此外，Xu等[105]利用引導編輯系統(tǒng)在水稻中實現(xiàn)了1個外源靶點和3個內(nèi)源靶點的精準編輯。Hua等[106]首次利用SaCas9介導的引導編輯系統(tǒng)在水稻細胞中實現(xiàn)了報告系統(tǒng)的精確修改。Jiang等[107]首次在玉米中利用引導編輯工具獲得了乙酰乳酸合酶基因ZmALS1和ZmALS2的W542L和S621I雙位點的純合突變體，編輯效率最高可達72%～75%。

4.2 引導編輯技術(shù)的影響因素及優(yōu)化

引導編輯系統(tǒng)中pegRNA的PBS、RT模板、nicking sgRNA的相對位置對引導編輯的效率有很大的影響。因此，多項研究針對pegRNA開發(fā)了設(shè)計工具，優(yōu)化了pegRNA的設(shè)計流程，如pegFinder和PrimeDesign等軟件，以方便研究人員更便捷地進行pegRNA 的設(shè)計[108-109]。Lin等[110]發(fā)現(xiàn)PBS的Tm值對引導系統(tǒng)的編輯效率有重要影響，當PBS的Tm值為30 ℃左右時，引導編輯效率在多數(shù)水稻內(nèi)源位點中達到最高，并且隨著溫度的增高或降低均呈現(xiàn)遞減的趨勢。同時還發(fā)現(xiàn)對1個位點的正鏈和負鏈各設(shè)計1個pegRNA，利用DNA 2條鏈之間存在反向互補序列，可能同時“啟動”細胞中微同源末端修復途徑，共同提高引導編輯系統(tǒng)的編輯效率。Xu等[111]采用在Cas9的N端融合逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV同時在RT模板中引入同義錯配堿基的策略，對水稻8個內(nèi)源基因進行了精準編輯，平均編輯效率可以提高10倍以上。Zou等[112]通過在pegRNAs的3’末端添加結(jié)構(gòu)性的RNA motifs來增強引導編輯系統(tǒng)的穩(wěn)定性，建立了PPE3-evopreQ1引導編輯系統(tǒng)，對水稻內(nèi)源基因OsCDC48、OsALS、OsDEP1、OsEPSPS等進行單個及多個堿基的精準替換，該系統(tǒng)的平均編輯效率達10.0%以上，最高可達47.5%。Li等[113]對PE3引導編輯系統(tǒng)進一步優(yōu)化，分別建立了基于潮霉素抗性基因的代理引導基因編輯器PE3-HS和基于雙草醚抗性基因的代理引導基因編輯器PE3-AS，以及基于這2個基因的雙代理引導基因編輯器PE3-DS。對水稻內(nèi)源基因OsSPL14、OsDHDPS和OsNR2進行編輯，PE3-HS 和PE3-AS編輯器的精準編輯效率提高了約2～14倍，雙代理PE3-DS編輯器的效率最高可提高約50倍，同時率先實現(xiàn)了水稻多個內(nèi)源基因同時精準編輯[113]。

5 我國農(nóng)作物基因編輯研究展望

目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)已成為定向改良農(nóng)作物的重要技術(shù)工具，我國科研人員也建立了基因定點敲除、單堿基編輯、等位基因替換和引導編輯等多項基因編輯技術(shù)體系，并成功應(yīng)用于水稻、小麥、玉米等主要農(nóng)作物的遺傳改良，研究水平處于國際領(lǐng)跑或并跑的地位，具有較強的競爭優(yōu)勢。其中，CRISPR/Cas介導的基因敲除和單堿基編輯技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，但基因精準替換等基因精準編輯的效率仍然較低，大大限制了其在農(nóng)作物改良中的應(yīng)用。因此，建立高效的精準編輯和基因替換技術(shù)體系成為該領(lǐng)域的重要目標和研發(fā)方向。

理論上CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的HDR可實現(xiàn)任意堿基之間的轉(zhuǎn)變，但該途徑多發(fā)生于細胞周期的S期和G2期，而轉(zhuǎn)化所需要的外植體如胚性愈傷是體細胞，且大多數(shù)處在G1期。這些弊端導致HDR在植物細胞中的發(fā)生頻率及應(yīng)用范圍均受到了一定的限制。針對HDR介導的基因替換效率較低的問題，可以通過增加修復模板數(shù)量、促進修復模板靠近DNA雙鏈斷裂部位、采用特異表達啟動子驅(qū)動Cas蛋白表達等策略提高效率[2]。例如采用RNA適配體結(jié)合鏈霉親和素的策略能夠有效增加修復模板數(shù)量，從而提高HDR介導的精準替換效率[114]；通過將Cas蛋白和修復模板結(jié)合并遞送至細胞核內(nèi)也能夠有效富集修復模板的數(shù)量，比如采用ssODNs與Cas/sgRNA的核糖核蛋白復合體共價結(jié)合的策略可以有效提高HDR介導的精準編輯效率[96]；利用卵細胞和早期胚胎特異啟動子驅(qū)動Cas基因表達也能夠有效提高HDR效率[97,115]。此外，如何將外源供體模板高效遞送至細胞中也是一大難題，目前在植物中使用最廣泛的遞送方法主要有基因槍法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，這2種方法都存在一定的不足，迫切需要開發(fā)新的遞送方法，提高遞送效率。近年來，利用病毒載體系統(tǒng)，例如煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）、大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）等將CRISPR/Cas系統(tǒng)遞送到植物中，該策略在玉米、小麥、煙草等作物中已成功實現(xiàn)了可遺傳的靶向基因編輯[116-119]，且該轉(zhuǎn)化過程不需要經(jīng)歷組織培養(yǎng)階段，但其基因編輯效率以及適用的植物物種范圍仍需進一步提高。此外，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，已有多種納米材料能夠高效遞送遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)，該方法具有高效率、無毒性和無轉(zhuǎn)基因整合的優(yōu)勢。目前，納米材料介導的CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)已在動物細胞中成功應(yīng)用，但在植物中利用該方法進行基因編輯尚存在障礙[120-121]，因此，加大對該基因編輯系統(tǒng)在植物中的研究力度，開發(fā)可以高效攜帶瞬時表達載體、Cas/RNP復合體等的納米顆粒遞送體系，將為高效、便捷地創(chuàng)制基因編輯農(nóng)作物提供新的途徑。

我國科研人員利用基因編輯技術(shù)在農(nóng)作物遺傳改良中的研究雖然取得了一系列重要進展，但是前沿技術(shù)的短板依然突出，特別是缺乏核心技術(shù)專利。從ZFNs、TALEN到CRISPR/Cas9等主流基因編輯工具的底盤技術(shù)專利都掌握在美國等發(fā)達國家手中，這將使我國基因編輯育種產(chǎn)業(yè)面臨“卡脖子”的風險，同時也會影響基因編輯農(nóng)作物的產(chǎn)業(yè)化進程。因此，當前的首要任務(wù)是積極開發(fā)原始創(chuàng)新的基因編輯工具。在此基礎(chǔ)上，研發(fā)一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因編輯技術(shù)體系。國家需要進一步加強基因編輯領(lǐng)域基礎(chǔ)研發(fā)和技術(shù)創(chuàng)新的投入，重視原創(chuàng)性工具和技術(shù)研發(fā)以及對原始創(chuàng)新技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)保護。此外，相關(guān)技術(shù)的研發(fā)與育種應(yīng)用結(jié)合不夠緊密，科技創(chuàng)新與市場需求脫節(jié)的現(xiàn)象也是目前存在的主要問題，亟需建立種業(yè)上下游銜接緊密，以市場為導向的高效育種創(chuàng)新體系，以保障我國的糧食安全。