宮頸和食管鱗狀細胞癌組織中DNA甲基化譜分析及腫瘤標志物初步篩選

徐麗秀,李金秋,馬俊旗,阿仙姑·哈斯木(新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室,烏魯木齊 8600;新疆醫(yī)科大學全科醫(yī)學學院,第七臨床學院;新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科;通訊作者,E-mail:axiangu75@6.com)

tumor markers; common differential genes

鱗狀細胞癌是一類起源于上皮組織的腫瘤,根據部位不同分為頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、食管鱗狀細胞癌(ESCC)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)和宮頸鱗狀細胞癌(CSCC)等,雖其具有共同的組織病理學特征,但病理機制尚不明確。DNA甲基化改變在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用[1,2],不同類型鱗狀細胞癌的發(fā)生也被證實與DNA的異常甲基化有關[3],在宮頸鱗狀細胞癌、食管鱗狀細胞癌以及頭頸部鱗狀細胞癌中,異常甲基化基因的表達往往與腫瘤的分化程度、TNM分期以及患者的預后不良有關[4-6],且隨著研究的深入,部分異常甲基化基因已開始作為不同類型鱗狀細胞癌的早期診斷標志物[7,8]。然而,目前對鱗狀細胞癌發(fā)生過程中共有甲基化基因的研究較少,這些共有甲基化基因可能影響癌細胞的信號轉導,進而導致腫瘤發(fā)生。本次研究中,采用全基因組DNA甲基化分析,以宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌為研究對象,找到兩種腫瘤中共有差異甲基化基因,為進一步了解鱗狀細胞癌的表觀遺傳機制提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究中涉及的32例樣本分別取自2012年6月至2013年3月期間,就診于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科和胸外科住院患者。包括8對宮頸鱗狀細胞癌組織及其癌旁3 cm正常上皮組織,8對食管鱗狀細胞癌組織及其癌旁3 cm正常上皮組織,收集的組織在30 min內存放至-80 ℃保存。每個標本組織均由兩名經驗豐富的病理醫(yī)師進行組織病理學診斷。本研究已得到了新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(批準文號:20130216-147)。

1.2 DNA制備與亞硫酸氫鹽修飾

使用DNA提取試劑盒(QIAGEN, Valencia, CA, USA)從32例組織中提取總DNA。DNA純度測定通過測量A260/A280,以A260/A280范圍在1.80～2.0之間的DNA為實驗樣本。根據EZ DNA甲基化試劑盒(Zymo Research, Orange, CA, USA)說明書,按照1 μg DNA進行亞硫酸氫鹽處理分析。

1.3 Infinium HumanMethylation450 BeadChip(甲基化450k芯片)分析

采用Infinium Human-Methylation 450k Bead Chip(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)進行DNA甲基化分析。根據Illumina公司操作說明進行,步驟如下:將經過亞硫酸鹽處理后的DNA經過15 μl洗脫緩沖液洗脫后用異丙醇重懸DNA,于Infinium HumanMethylation450 Bead Chips中雜交過夜。經過雜交后,將游離DNA去除,通過單核苷酸擴增處理BeadChips,使用Illumina iScan儀器對BeadChips樣本進行掃描以獲得原始數據。

1.4 生物信息學分析

利用在線軟件KEGG pathways分析(www.genome.jp/kegg/pathway.html)對DNA甲基化基因進行通路富集分析。使用在線軟件GO分析(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/)對富集途徑中的基因功能進行分析,包括生物過程、細胞組分和分子功能。對獲得的差異基因通過UALCAN在線數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA在線數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)進行驗證。

1.5 統(tǒng)計學分析

1.5.1 宮頸鱗狀細胞癌與食管鱗狀細胞癌基因甲基化芯片的原始數據處理 采用GenomeStudio v1.9軟件對經過Illumina處理后32例樣本的原始數據進行整理分析,在配對的癌與癌旁組織中每個基因的表達中位數之比為差異倍數(fold change),進行配對t檢驗,得到相應P值。去除掉P>0.05的樣本及探針集后,使用Lumi和R包對原始數據進行歸一化處理。Lumi將得到的歸一化數據中單個CpG位點轉化為甲基化值,即β值,β值范圍為0～1,分別對應完全未甲基化位點和完全甲基化位點。隨后,利用R包的limma模態(tài)分析不同樣品之間的差異,CpG位點篩選標準為|Δβ|>0.2,P<0.05,符合以上條件被認為可以作為差異甲基化基因。

2 結果

2.1 鱗狀細胞癌中甲基化譜差異分析

采用全基因組DNA甲基化分析,分別對宮頸鱗狀細胞癌、食管鱗狀細胞癌及其癌旁正常組織進行檢測,根據|Δβ|>0.2,P<0.05,8例宮頸鱗狀細胞癌組織中共篩選出29 505個差異甲基化位點,其中9 227個高甲基化差異位點,20 278個低甲基化差異位點;8例食管鱗狀細胞癌組織中共篩選出54 009個差異位點,包括21 515個高甲基化位點,32 494個低甲基化位點,兩種組織共有差異位點5 421個,其中2 869個高甲基化位點,2 552個低甲基化位點(見表1)。

表1 宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中差異甲基化CpG位點

2.2 鱗狀細胞癌組織中差異甲基化位點區(qū)域分布情況

對差異位點的亞定位區(qū)域分析發(fā)現,宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織中超過50%的差異位點位于CpG島相關區(qū)域以外的區(qū)域(open sea),但兩種組織的共有差異位點主要分布于CpG島(見表2)。在基因結構分析中,宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織中差異甲基化位點分布區(qū)域主要位于gene body,其次為TSS1500,5′UTR,TSS200,而共有差異甲基化位點主要分布于gene body和5′UTR區(qū)域(見表3)。

表2 宮頸癌和食管癌組織與癌旁組織差異甲基化中CpG位點分布情況 個(%)

表3 宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織與癌旁組織中差異甲基化CpG位點在基因功能區(qū)域的分布 個(%)

2.3 鱗狀細胞癌中差異甲基化基因的鑒定

根據差異甲基化位點進一步匹配得到相應的差異基因,宮頸鱗狀細胞癌組織篩選得到13 790個差異基因,食管鱗狀細胞癌組織得到15 207個差異基因,共有差異基因2 041個(見圖1)。

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析結果

對得到的2 041個差異基因進行富集分析,GO分析結果提示,在生物進程功能注釋類別中,這些基因主要富集于信號傳導、細胞黏附、胚胎骨骼系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生;在分子功能注釋類別中,主要集中于基因序列特異性結合、基因序列特異性結合轉錄因子活性、鈣通道活性的調節(jié);在細胞組分注釋類別中,主要以質膜、基底膜、質膜的整體組成為中心(見圖2)。KEGG-pathway分析結果表明,差異甲基化基因主要富集于25條信號通路,主要涉及黏著斑(hsa04510)、癌癥信號通路(hsa05200)、細胞外基質受體相互作用(hsa04512)和肌動蛋白細胞骨架調節(jié)(hsa04810),前10條通路見表4。

CSCC1～4分別為4例宮頸鱗狀細胞癌樣本;ESCC1～4分別為4例食管鱗狀細胞癌樣本;Cervical tissue 1～4分別為4例宮頸鱗狀細胞癌癌旁樣本;Esophageal tissue 1～4分別為4例食管鱗狀細胞癌癌旁樣本圖1 宮頸鱗狀細胞癌/食管鱗狀細胞癌腫瘤組織組與癌旁組織組差異甲基化基因熱圖Figure 1 Heatmap of differentially methylated genes between tumor tissues and adjacent normal tissues

圖2 宮頸鱗狀細胞癌與食管鱗狀細胞癌中共有差異甲基化基因的GO分析Figure 2 GO analysis of common differential methylated genes in CSCC and ESCC

2.5 差異基因標志物篩選結果

從25條通路中選取富集最顯著的10條通路,其中,7條通路中均出現ITGA6。利用UALCAN數據庫和GEPIA數據庫對ITGA6基因進行驗證,UALCAN結果提示,在宮頸宮頸鱗狀細胞癌癌和食管鱗狀細胞癌中,ITGA6的表達高于正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3A)。GEPIA數據庫結果顯示,在食管鱗狀細胞癌ITGA6基因的表達高于正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但在宮頸鱗狀細胞癌中未出現顯著差異(見圖3B)。

表4 宮頸鱗狀細胞癌與食管鱗狀細胞癌中共有差異甲基化基因的KEGG富集分析結果

CSEC:宮頸鱗狀上皮細胞癌;ESCA:食管鱗狀上皮細胞癌;與相應正常組織比較,*P<0.05圖3 UALCAN數據庫和GEPIA數據庫中ITGA6在宮頸鱗狀細胞癌及食管鱗狀細胞癌中的表達Figure 3 The expression of ITGA6 in CSEC/ESCA and normal tissues on UALCAN database and GEPIA database

3 討論

世界范圍內,宮頸癌作為女性第四大惡性腫瘤,威脅全球女性的健康[9];食管癌作為四大腫瘤之一,同樣給人類帶來巨大的公共健康問題[10]。在新疆地區(qū),食管癌和宮頸癌作為此地區(qū)主要腫瘤類型[11],盡管醫(yī)療診斷及治療的水平有了很大程度的改善,然而這兩種腫瘤的患病率及死亡率仍然居高不下。因此,能夠有效地對疾病做出早期診斷,提高患者生活質量,是亟待解決的問題。宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌均是鱗狀上皮細胞來源的腫瘤,其具有共同的組織病理學類型,尋找一種共有的分子生物學標志物將有助于鱗狀細胞癌的早期診斷,從而提高患者的預后。

表觀遺傳學已證實在腫瘤的發(fā)生過程中扮演著重要的角色,其中,DNA甲基化作為主要的表觀遺傳機制,為研究腫瘤早期發(fā)現提供了有力的理論依據。通常認為正常細胞中往往呈現低甲基化,抑癌基因的高甲基化或者癌基因的低甲基化是導致腫瘤發(fā)生的開端。目前,在抗腫瘤治療中,已有部分甲基轉移酶抑制劑獲得FDA批準,這預示著甲基化研究在腫瘤治療領域中擁有廣闊的應用前景[12]。然而,針對鱗狀細胞癌中共有的甲基化基因的研究卻鮮有報道。在本次研究中,選取鱗狀細胞癌中的兩種類型(宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌)找到其與癌旁正常組織間的差異甲基化基因,進一步篩選得到兩種組織的共有差異基因,為鱗狀細胞癌的診斷、患者預后的評估和臨床治療的選擇提供依據。

研究證實DNA異常甲基化通常發(fā)生于CpG位點,本次研究發(fā)現宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織中,低甲基化CpG位點的數量遠遠高于高甲基化位點數量,提示在腫瘤發(fā)生過程中腫瘤的DNA甲基化狀態(tài)會隨之發(fā)生明顯的改變,其中CpG島的異常甲基化被認為與腫瘤發(fā)生密切相關。CpG島(CpG island)是指CpG二核苷酸大量富集于基因的5′調控區(qū),在基因表達調控中發(fā)揮重要作用的DNA序列。本次研究結果中觀察到在宮頸鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌中分別有5 278和5 841個甲基化差異位點位于CpG島,值得注意的是,在這兩種腫瘤組織中差異甲基化位點更頻繁地出現在shores,而不是在CpG島。盡管對這一亞定位的生物學意義了解相對較少,但研究提示疾病的發(fā)生與islands, shores和shelves上的甲基化變化存在一定的關系[13]。此外,一項關于人類結腸癌甲基化的研究發(fā)現,大多數甲基化改變發(fā)生在shores,并不是傳統(tǒng)意義上的CpG島[14]。提示shores上甲基化位點的變化可能與鱗狀細胞癌的發(fā)生存在一定聯系。CpG島上的基因啟動子區(qū)域(TSS1500、TSS200、5′UTR和第1外顯子)發(fā)生甲基化改變可以直接調控基因的異常表達,包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活[15],既往研究報道,HEADLAMP技術根據宮頸癌中DAPK1啟動子高甲基化的特征可以高效率檢測宮頸癌病變[16]。Kadian等[17]發(fā)現高危HPV感染可以誘導人子宮頸鱗狀細胞癌中APC、SFRP1和PTEN基因啟動子區(qū)域呈現高甲基化狀態(tài),促使這些基因的表達沉默,進而觸發(fā)腫瘤的發(fā)生。ZFPs啟動子甲基化缺失可以抑制其與下游FZD1和DVL2蛋白結合,阻遏Wnt/β-catenin信號活化,在食管鱗狀細胞癌中起到抑癌基因的作用[18]。本次研究發(fā)現,啟動子區(qū)域上分布著大量的差異甲基化位點,提示基因啟動子甲基化水平改變可能會潛在地影響宮頸癌和食管癌中多個靶基因的轉錄活性,進一步誘導腫瘤的發(fā)生。

將宮頸癌和食管癌中篩選出的2 041個共有差異甲基化基因通過GO功能富集分析和KEGG通路分析,GO分析結果提示,在生物進程功能注釋類別中,這些基因主要富集于信號傳導、細胞黏附、胚胎骨骼系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生;在分子功能注釋類別中,主要集中于基因序列特異性結合、基因序列特異性結合轉錄因子活性、鈣通道活性的調節(jié);在細胞組分注釋類別中,主要以質膜、質膜的整體組成、基底膜為中心。KEGG通路分析結果顯示,以上甲基化基因主要富集于25條信號通路,包括黏著斑(hsa04510)、癌癥信號通路(hsa05200)、細胞外基質受體相互作用(hsa04512)和肌動蛋白細胞骨架調節(jié)(hsa04810)。隨后,從25條通路中選取富集最顯著的10條通路發(fā)現,7條通路中均出現ITGA6基因,利用UALCAN數據庫和GEPIA數據庫對ITGA6基因進行驗證,結果提示,與正常組織相比,ITGA6在癌組織中高表達。ITGA6已證實在前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌中均作為致癌基因,促進腫瘤的惡性進展[19-21]。在宮頸癌中,ITGA6可以與miR-144形成復合體,增強癌細胞的增殖及轉移能力[22]。ITGA6可以作為食管癌生存預后的指標[23],且抑制了食管癌組織對放療抵抗的敏感性[24]。

綜上所述,甲基化芯片聯合生物信息學分析篩選并初步鑒定ITGA6基因可以作為鱗狀細胞癌差異甲基化基因,接下來,需要進行功能性實驗來驗證ITGA6基因在鱗狀細胞癌中的具體作用,為找到鱗狀細胞癌的共有分子指標或治療靶點提供理論依據。