茵芩合劑質(zhì)量標準研究

歐人豪 曾 金 韋祖巧 李 萍

廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院（柳州市婦產(chǎn)醫(yī)院、柳州市兒童醫(yī)院）藥學部，廣西柳州 545001

茵芩合劑為廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院在研制劑，由綿茵陳、黃芩、熟大黃、甘草四味中藥按傳統(tǒng)工藝制得，具有清熱利濕、退黃作用，主要用于防治新生兒黃疸。處方中綿茵陳、黃芩分別為君藥和臣藥，熟大黃為佐藥，甘草為使藥。綠原酸、咖啡酸均為綿茵陳的活性成分[1-2]，綠原酸具有保肝利膽、清除自由基等作用[3]，咖啡酸也具有一定的抗氧化、抗炎等保肝作用[4]；黃芩苷、黃芩素為黃芩的主要有效成分[5]，具有抗菌[6]、抗炎、抗氧化[7－9]和保肝利膽[10－11]等作用。為控制制劑質(zhì)量，本研究采用微乳薄層色譜法對其中綿茵陳、黃芩和熟大黃同時進行鑒別，采用高效液相色譜法梯度洗脫對綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素同時測定，建立簡便可行的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）；ZF-1 三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；FA1004 電子分析天平（上海天平儀器廠）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDZ4-WS 臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.2 試藥

綠原酸（批號：110753-201716）、大黃素（批號：110756-201512）對照品購于中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷（批號：AF20022601）、黃芩素（批號：AF906 1605）、咖啡酸（批號：AF9060905）對照品購于成都埃法生物科技有限公司；綿茵陳（批號：121555-201602）、黃芩（批號：120955-201309）、大黃（批號：120984-201202）對照藥材購于中國食品藥品檢定研究院；綿茵陳（批號：20190519）、黃芩（批號：20190817）、熟大黃（批號：20190609）、甘草（批號：20190824）購于廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司中藥飲片廠；茵芩合劑為廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 供試品1 溶液 取樣品10 ml，3500 r/min 離心5 min，取其上清液在水浴中蒸干，殘渣加甲醇適量溶解即得。

2.1.1.2 供試品2 溶液 取樣品10 ml，3500 r/min 離心5 min，取其上清液，乙酸乙酯萃取2 次（10 ml/次），萃取液在水浴中蒸干，殘渣加甲醇適量溶解即得。

2.1.1.3 對照藥材溶液 分別取綿茵陳1 g、黃芩0.2 g、大黃0.5 g，加甲醇20 ml，超聲，濾過，濾液在水浴中蒸干至適量，得各對照藥材溶液。

2.1.1.4 對照品溶液 稱取綠原酸、黃芩苷和大黃素等標準品各1.0 mg，分別加甲醇5 ml 溶解，得各對照品溶液（質(zhì)量濃度均為0.2 mg/ml）。

2.1.1.5 陰性對照溶液 按處方比例稱取缺黃芩的各味藥材，照制劑制備工藝制得黃芩陰性樣品，同法分別制得綿茵陳和大黃陰性樣品。按“2.1.1.1”項下方法制得綿茵陳和黃芩陰性對照溶液；按“2.1.1.2”項下方法制得大黃陰性對照溶液。

2.1.2 微乳液制備

按質(zhì)量比稱取十二烷基硫酸鈉∶正丁醇∶環(huán)已烷∶水=2.7∶6.3∶1.0∶30.0，超聲10 min，靜置24 h 備用。

2.1.3 薄層層析

取“2.1.1”項下各溶液約3 μl，分別點樣于聚酰胺薄膜板上，取微乳液適量，按體積比9∶1 加入甲酸作為展開劑，展開7.0 cm，取出晾干。大黃素及其他大黃成分在日光下顯黃色斑點；置紫外線（365 nm）下綠原酸顯藍紫色熒光斑點；噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，日光下黃芩苷顯墨綠色斑點。結(jié)果顯示供試品色譜中顯示有與對照藥材和對照品位置和顏色相同的斑點，而各陰性對照無干擾。見圖1～3。

圖1 茵芩合劑中綿茵陳薄層色譜圖

圖2 茵芩合劑中黃芩薄層色譜圖

圖3 茵芩合劑中大黃薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.25%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；流速1.0 ml/min；波長310 nm；柱溫30℃；進樣量20 μl。梯度洗脫程序：0 min，10%A；0～25 min，10%→35%A；25～35 min，35%→55%A；35～40 min，55%→10%A。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 混合對照品溶液 取綠原酸、咖啡酸、黃芩素各適量，精密稱定，分別置容量瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為綠原酸2.980 mg/ml、咖啡酸0.300 mg/ml和黃芩素0.248 mg/ml 的單一對照品貯備液；另取黃芩苷適量，精密稱定，置容量瓶中，以含1.0 μmol/L 氫氧化鈉的50%甲醇（pH 值約為6.0）制成0.510 mg/ml的黃芩苷貯備液。取以上各貯備液于50 ml 容量瓶中，加50%甲醇（不含堿）制成綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素濃度分別為59.60、6.00、408.00、19.84 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液 取茵芩合劑0.25 ml 于25 ml 容量瓶中，50%甲醇定容，密塞，超聲10 min，3600 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例分別制備缺茵陳和黃芩的陰性對照樣品，再按“2.2.2.2”項下方法制得綿茵陳陰性樣品溶液和黃芩陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性考察

取“2.2.2”項下的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，分別進樣。結(jié)果顯示，四種檢測成分的色譜峰分離度較好，其他成分對測定無干擾。見圖4。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 至5 ml 容量瓶中，以50%甲醇定容，制成系列混合對照品溶液，進樣。以對照品濃度（X）為橫坐標，峰面積的1/1000（Y）為縱坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗

取同一濃度供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果顯示綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素峰面積的平均RSD 分別為0.25%、1.29%、0.10%和1.00%，提示儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一濃度供試品溶液，置室溫下，分別于0、2、4、8、12 h 進樣測定峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素12 h 內(nèi)峰面積的平均RSD 分別為0.42%、1.36%、0.23%和2.49%，提示供試品溶液在室溫放置12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.7 重復(fù)性試驗

取同批次茵芩合劑6 份（批號：201021），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進樣，結(jié)果顯示綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素的峰面積的平均RSD 分別為1.94%、2.10%、1.72%和2.22%，提示該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密量取同批次已知含量樣品6 份（批號：201021），每份0.25 ml，分別置于50 ml 容量瓶中，每份加入綠原酸對照品貯備液160 μl、咖啡酸對照品貯備液120 μl、黃芩素對照品貯備液400 μl 和黃芩苷對照品貯備液7.20 ml，以50%甲醇定容，余下操作同“2.2.2”項下方法，進樣，結(jié)果見表2。

表2 茵芩合劑4 種成分加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品含量測定

取3 批茵芩合劑樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣，結(jié)果見表3。

表3 3 批茵芩合劑樣品含量檢測結(jié)果（mg/ml）

3 討論

微乳液為微乳薄層色譜展開劑，是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按適當比例自發(fā)形成的澄清透明、各向同性、低黏度的熱力學穩(wěn)定體系[12]，為達到最佳效果，必要時可加入一些改性劑如甲酸[13-14]、丙酮等[15]。微乳薄層色譜可用于鑒別黃酮類[13,16]、有機酸類、醌類[15]、酚類[17]等中藥有效成分，具有分離成分多，特別是對結(jié)構(gòu)類似的化合物也能很好分離的特點。本研究使用該方法同時鑒別茵陳、黃芩和大黃3 種成分，樣品處理簡單，較傳統(tǒng)薄層色譜鑒別方法[18-20]可節(jié)省時間和試劑成本。

前期研究發(fā)現(xiàn)，配制含量測定所需的對照品溶液時，使用50%甲醇比100%或70%甲醇效果好，綠原酸峰形對稱，無肩峰出現(xiàn)。另外，由于黃芩苷在中藥材或中藥制劑中以鎂鹽的形式存在[21]，其醇溶性和水溶性均較好，而黃芩苷對照品未成鹽，難溶于甲醇，幾乎不溶于水[22]。增加黃芩苷的方法有多種[23-24]，本研究在甲醇水溶液中加入微量氫氧化鈉使黃芩苷成鈉鹽，使其完全溶解，經(jīng)考察所配制的對照品溶液在20℃左右放置12 h 或在2～8℃放置4 d 黃芩苷和其他成分含量下降只有1%左右，說明加入微量氫氧化鈉對各目標成分的測定結(jié)果無明顯影響。

本研究采用梯度洗脫法測定綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素，方法簡單，重復(fù)性好，相較于以往類似處方制劑的有效成分含量測定[19-20,25]，具有檢測有效成分更多，更節(jié)約成本的優(yōu)勢，可用于優(yōu)化類似處方制劑的質(zhì)量控制。