低劑量七氟醚調節(jié)海馬神經元凋亡、減輕心肺轉流術后認知功能障礙的機制研究

秦建華，馬慶軍，馬冬梅，徐桂萍

心肺轉流術(CPB)是指將血液自上下腔靜脈或右心房引出，經體外氧合后重新注入動脈的人工循環(huán)技術，常用于輔助心臟手術[1-2]。然而，術后認知功能障礙(POCD)是CPB的主要并發(fā)癥[3-4]。POCD的臨床特征是焦慮、記憶力減退，甚至可發(fā)展為阿爾茨海默病[5-7]，嚴重限制了CPB的臨床應用。海馬神經元狀態(tài)對于維持正常的認知功能至關重要[8]，海馬神經元凋亡與炎癥是CPB誘導POCD的主要原因[9-10]。因此，探索潛在的海馬神經元凋亡抑制劑，用于治療CPB誘導POCD非常重要。七氟醚麻醉在POCD進展中的作用存在爭議[11-12]，因為七氟醚在海馬神經元凋亡調節(jié)中起著雙重作用。既往研究證實七氟醚會誘導海馬神經元凋亡并引起認知功能障礙[13-15]。然而，仍有部分研究報道了七氟醚能通過降低血流速率改善缺血/再灌注誘導的神經元凋亡[16-17]。PI3K/AKT信號通路可調節(jié)細胞增殖[18]和細胞凋亡[19]等多種細胞功能，并參與POCD的調控[20]。既往研究顯示，PI3K/AKT信號通路參與海馬神經元凋亡的調控[21-22]。然而，七氟醚是否可以通過激活PI3K/AKT信號通路來減輕神經元凋亡？基于此，本研究旨在探究低劑量七氟醚調節(jié)海馬神經元凋亡、減輕CPB所致POCD的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胰酶(Gibco，美國)；Annexin V/PI雙染試劑盒(Sigma，美國)；聚D-賴氨酸(Sigma-Aldrich，德國)；2% B27plus葡萄糖(Invitrogen，美國)；0.25% Glumax神經基礎培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)；CCK-8試劑盒(聯(lián)科生物技術有限公司)；臺盼藍(Gibco，美國)；Anti-Ki67、Anti-PI3K、Anti-p-Akt、Anti-Akt、Anti-Cleaved-Caspase-3、Anti-Bax、Anti-Cyclin D1、Anti-CDK2、Anti-β-actin(Abcam/CST/Proteintech，美國/中國)；Morris水迷宮裝置(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)；顯影儀(Bio-Rad，美國)；大鼠呼吸機(上海贊德醫(yī)療器械有限公司)；膜式氧合器(北京米道斯醫(yī)療器械股份有限公司)。

1.2實驗動物 本實驗所用大鼠均由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK(新)2018-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF動物房內，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，光照/黑暗周期12 h/12 h，自由進食和飲水。另取10只雄性新生SD大鼠，體質量5～10 g，年齡<24 h，用于分離原代海馬神經元(PHN)細胞。本實驗符合國家衛(wèi)生部動物保健研究所的指導方針，并經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準號20190422581)。

1.3CPB誘導POCD模型構建及分組 根據(jù)文獻[10]構建CPB誘導POCD大鼠模型。60只老年雄性SD大鼠適應環(huán)境喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、假手術組、模型組、模型+0.4%七氟醚組和模型+0.4%七氟醚+LY294002組。所有大鼠腹腔內注射50 mg/kg戊巴比妥麻醉。對照組不予任何干預。模型+0.4%七氟醚組和模型+0.4%七氟醚+ LY294002組預先吸入低劑量七氟醚(0.4%)2 h。CPB裝置主要由蠕動泵、膜式氧合器和注射器針筒構成，由三通及專用軟管連接。整個系統(tǒng)預充15 ml血安定、4 ml乳酸林格液及1 ml碳酸氫鈉混合溶液。待大鼠完全麻醉后，氣管插管并接呼吸機通純氧氣，設置呼吸頻率60/min，二氧化碳分壓35～45 mmHg。大鼠雙側腹股溝消毒備皮，切開皮膚并分離出股動脈，隨后穿刺置管并固定，經穿刺管注射300 U/kg肝素。左側套管連接壓力表監(jiān)測平均動脈壓(MAP)，右側套管留作動脈灌注管。大鼠頸部皮膚消毒備皮，分離暴露右頸內靜脈，右頸內靜脈置管，緩慢向心臟方向插入約3 cm，使導管前端位于右心房處，結扎固定套管。開始CPB，將右心房血液引流至貯血器，經蠕動泵泵入氧合器再經右股動脈回輸，灌注流速約100 ml/(kg·min)。氧合器以0.2 L/min純氧供氧，37 ℃恒溫水循環(huán)通過氧合器熱交換使血液維持恒溫。60 min后停止CPB，根據(jù)需要向貯血器內加入多巴胺維持平均動脈壓(MAP)≥60 mmHg，加入碳酸氫鈉維持酸堿平衡，如有血容量不足征象，則適當補充CPB裝置內剩余血液。假手術組完全麻醉后，備皮消毒，分離出雙側股動脈與右頸靜脈，左股動脈穿刺置管，連接壓力表監(jiān)測MAP，維持60 min。模型+0.4%七氟醚+LY294002組CPB術后予PI3K/AKT抑制劑LY294002連續(xù)鼻滴，每只10 μg/d，連續(xù)鼻滴3 d。

1.4PHN細胞分離與缺氧/復氧(H/R)模型構建及分組 將新生SD大鼠斷頭，剝離顱骨，分離海馬組織。用手術剪將海馬組織碎成1 mm3細胞團，放入0.25%胰蛋白酶溶液中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，待細胞完全分散。收集細胞懸液并過濾，獲得PHN細胞懸液。將收集的PHN細胞溶入含聚D-賴氨酸、2% B27plus葡萄糖(4.5 g/L)、0.25% Glumax和10%胎牛血清的神經基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育15 d，根據(jù)先前研究[12]，收集PHN細胞并在低氧條件下培養(yǎng)2 h誘導H/R模型。待細胞生長至80%時融合，取1×106PHN細胞接種于96孔板，在95%空氣和5% CO2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作為對照組。此外，為模擬七氟醚體外麻醉情況，培養(yǎng)箱中以5 L/min流量將PHN細胞分別暴露于不同劑量七氟醚(0.2%、0.4%、0.6%和0.8%)下3 h。隨后構建H/R模型，將PHN細胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中通入95%氮氣和5% CO2混合氣體2 h。完成H/R模型構建后，取出培養(yǎng)瓶，以PBS液清洗細胞3次，更換含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。0.2%七氟醚組是在對照組條件下，只通入0.2%七氟醚，不做H/R模型構建，而H/R+0.2%七氟醚+LY294002組則是在通入0.2%七氟醚前加入10 μmol/L的LY294002。

1.5Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能 Morris水迷宮是一個直徑1.8 m、高0.8 m的圓形水池，水池劃分為4個象限，并將可移動平臺放置在第一個象限中。使用ANY-迷宮系統(tǒng)實時記錄CPB誘導POCD模型構建前后每日平均逃避潛伏期(從大鼠浸入水中至到達平臺的時間)、游泳速度、平臺象限滯留距離和時間百分比。

1.6免疫組織化學染色 取小鼠，腹腔麻醉，剪開胸腔，自心臟灌注生理鹽水與4%多聚甲醛溶液固定組織，取出組織后石蠟包埋，切成約5 μm厚切片。取切片脫蠟至水，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置于微波爐中加熱約20 min修復抗原。再以3%過氧化氫室溫孵育5 min，消除內源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗后，加入10%羊血清封閉約60 min。PBS液洗滌后，加入Anti-Ki67抗體，4 ℃避光孵育過夜。PBS液沖洗，加入生物素標記二抗，37 ℃避光孵育30 min，加入辣根酶標記的鏈霉素，37 ℃孵育30 min，DAB顯色劑顯色，自來水沖洗，復染，封片，光學顯微鏡下拍照。

1.7TUNEL染色檢測凋亡細胞情況 取小鼠腦組織石蠟切片浸入二甲苯溶液中，重復2次，每次5 min。以梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min。PBS液漂洗2次，滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，37 ℃反應15 min，PBS液洗滌2次。制備TUNEL染色反應液(TdT︰熒光素標記dUTP液=1︰9混合)，滴加至浸沒整個切片，37 ℃暗濕盒中反應60 min，PBS液漂洗2次，滴加1滴抗熒光猝滅劑在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞。使用胰酶消化PHN細胞，接種于24孔板內，按實驗分組處理PHN細胞，加入細胞固定液固定細胞30 min。PBS液漂洗2次，加入含0.1% Triton-X的PBS液，冰浴2 min。取TUNEL染色反應液滴至浸沒PHN細胞，37 ℃暗濕盒中反應60 min，PBS液漂洗2次，滴加1滴抗熒光猝滅劑在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞。

1.8Western blot法檢測蛋白表達 取大鼠海馬組織按體積/質量比4︰1加入RIPA裂解液，研磨成細胞懸液?；蛉HN細胞，每1×106細胞中加入100 μl RIPA裂解液制成細胞懸液。將細胞懸液靜置30 min使蛋白完全裂解，4 ℃、12 000 r/min離心，取上清液檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液制成樣品。取十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，拔出上樣梳，每孔加入10 μg樣品，調節(jié)電泳電壓為60 V/30 min、120 V/60 min，整個凝膠電泳過程以上樣緩沖液跑至底部為終點。達到終點后，采用濕法轉膜法將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，調節(jié)轉膜電流為2 mA/60 min。取出PVDF膜，以4%脫脂牛奶封閉120 min，隨后使用目的蛋白一抗稀釋液孵育PVDF膜過夜。次日，取出PVDF膜，PBST洗凈一抗稀釋液，在二抗稀釋液中室溫孵育2 h，滴加ECL超敏發(fā)光液在顯影儀下顯影，獲得對應蛋白條帶，并使用Image J軟件分析。

1.9Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡情況 使用胰酶消化PHN細胞，接種于24孔板內，按實驗分組處理PHN細胞。再用胰酶消化PHN細胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化，取流式檢測試劑盒中Annexin V與PI溶液加入各組細胞中，避光孵育5 min。使用流式細胞儀通過FITC通道與PE通道檢測Annexin V/PI雙陽性表達占比。

1.10CCK-8法檢測細胞增殖情況 使用胰酶消化PHN細胞，接種于24孔板內，按實驗分組處理PHN細胞。每孔加入100 μl完全培養(yǎng)基+10 μl CCK-8溶液，37 ℃避光培養(yǎng)2 h后，用酶標儀于波長450 nm處檢測吸光度值，計算細胞增殖情況。

1.11臺盼藍染色檢測細胞活力 使用胰酶消化PHN細胞，接種于24孔板內，按實驗分組處理PHN細胞。再用胰酶消化PHN細胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化，取20 μl細胞懸液與20 μl臺盼藍混合，使用細胞計數(shù)儀計算PHN細胞活力。

2 結果

2.1CPB誘導POCD大鼠模型構建 3組大鼠在CPB誘導POCD模型構建前，逃避潛伏期(圖1a)、游泳速度(圖1c)、平臺象限滯留距離和時間百分比(圖1d、1e)比較無差異(P>0.05)。CPB誘導POCD模型構建后，與對照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期(圖1b)顯著延長，平臺象限滯留距離、時間百分比(圖1d、1e)顯著降低(P<0.01)。提示CPB誘導POCD大鼠模型構建成功。

2.2CPB誘導POCD大鼠模型海馬神經元增殖與凋亡情況 為評估大鼠海馬神經元增殖和凋亡情況，本研究采用免疫組織化學染色檢查Ki67蛋白的表達和定位。Ki67表達于細胞核，是細胞增殖的標志抗原。結果表明，與對照組比較，模型組Ki67表達顯著降低(P<0.01)，見圖2a。TUNEL染色結果顯示，與對照組比較，模型組海馬神經元中有更多的TUNEL陽性細胞(P<0.01)，見圖2b。海馬神經元凋亡結果再以Western blot法進行驗證，結果表明模型組促凋亡蛋白(Cleaved-Caspase-3和Bax)表達較對照組顯著增加(P<0.01)，見圖2c。

圖2 CPB誘導POCD大鼠海馬神經元增殖與凋亡情況

2.3H/R模型對PHN細胞增殖與凋亡的影響 本研究采用Annexin V/PI雙染與CCK-8法、臺盼藍染色等評估H/R模型對PHN細胞增殖與凋亡的影響。Annexin V/PI雙染結果顯示，與對照組比較，H/R組PHN細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，見圖3a。此外，H/R組PHN細胞增殖與細胞凋亡具有時間依賴性，CCK-8法檢測結果表明，H/R組PHN細胞處理72和96 h后增殖水平顯著低于對照組(P<0.01)，見圖3b；臺盼藍染色結果顯示，H/R組PHN細胞處理48、72和96 h后細胞活力顯著低于對照組(P<0.01)，見圖3c。

圖3 H/R模型對PHN細胞增殖與凋亡的影響

2.4不同劑量七氟醚對海馬神經元凋亡的影響 為驗證七氟醚對海馬神經元凋亡的改善作用，本研究首先通過不同劑量七氟醚(0.2%、0.4%、0.6%和0.8%)處理PHN細胞3 h。結果表明，與對照組比較，高劑量七氟醚(0.6%和0.8%)顯著抑制了PHN細胞增殖和分裂(P<0.05)，低劑量七氟醚(0.2%和0.4%)顯著誘導了PHN細胞增殖與分裂(P<0.05)，見圖4a、4b。表明七氟醚以濃度依賴的方式調節(jié)PHN細胞的增殖和分裂。值得注意的是，低劑量七氟醚(0.2%)逆轉了H/R處理對PHN細胞增殖作用(圖4c)，以及對分裂(圖4d)和細胞活力(圖4e)的抑制作用(P<0.01)。Western blot結果顯示，低劑量七氟醚(0.2%)顯著增加了Cyclin D1和CDK2的表達(P<0.01)，見圖4f。TUNEL染色結果表明，低劑量七氟醚(0.2%)逆轉了H/R誘導的PHN細胞凋亡(P<0.01)，見圖4g。低劑量七氟醚(0.4%)預處理的CPB誘導POCD大鼠海馬組織Cleaved-Caspase-3和Bax表達水平降低(P<0.01)，表明低劑量七氟醚(0.4%)減輕了CPB誘導POCD大鼠的海馬神經元凋亡，見圖4h。

圖4 不同劑量七氟醚對海馬神經元凋亡的影響

2.5低劑量七氟醚通過激活PI3K/AKT信號通路對海馬神經元凋亡的影響 體內實驗中，與對照組比較，模型組大鼠海馬神經元p-PI3K和p-AKT表達水平顯著降低(P<0.01)，而低劑量七氟醚(0.4%)處理可顯著提高p-PI3K和p-AKT表達水平(P<0.01)，見圖5a。此外，低劑量七氟醚(0.4%)處理可以降低凋亡相關蛋白(Cleaved-Caspase-3和Bax)表達，增加增殖相關蛋白(Cyclin D1和CDK2)表達(P<0.01)，見圖5b、5c。然而，LY294002處理CPB誘導POCD大鼠海馬神經元后，低劑量七氟醚(0.4%)的增益作用被顯著逆轉(P<0.01)，見圖5b、5c。此外，LY294002還逆轉了低劑量七氟醚(0.4%)促進H/R處理PHN細胞的增殖和生存作用，見圖5d、5e。

圖5 低劑量七氟醚通過激活PI3K/AKT信號通路對海馬神經元凋亡的影響

3 討論

CPB引起的POCD嚴重降低了心臟手術患者生活質量[3-4]，并且由于其發(fā)病機制不清楚，目前尚無有效的治療手段[5-6]。探究CPB誘導POCD發(fā)病機制必須構建合理的體內和體外模型?；谙惹暗膱蟮繹10]，本研究成功建立了老年CPB誘導POCD大鼠模型，證實CPB會誘導大鼠出現(xiàn)明顯的認知功能障礙。此外，CPB誘導POCD的特征是缺血再灌注損傷誘導海馬神經元凋亡[9]，本研究顯示，與對照組相比，CPB造成大鼠海馬神經元增殖受到抑制，且細胞凋亡增加。此外，為了體外模擬CPB誘導損傷，本研究自新生大鼠海馬組織中分離出PHN細胞培養(yǎng)，并構建了H/R模型。H/R處理PHN細胞48 h后，PHN細胞活力降低，表明H/R誘導的PHN細胞凋亡存在時間依賴性。上述結果證實，海馬神經元凋亡對于CPB誘導的POCD進展至關重要。

麻醉被廣泛用于外科手術，被認為可誘導神經元凋亡造成認知功能障礙[12]。然而，一些麻醉劑如異丙酚，通過維持細胞骨架的穩(wěn)定性來抑制POCD的發(fā)生[11]，這部分有爭議的麻醉藥物成為CPB誘導POCD的潛在治療藥物。七氟醚麻醉在調節(jié)神經元凋亡中一直存在爭議，一方面七氟醚會誘發(fā)海馬神經元凋亡，引起認知功能障礙[13-15]；另一方面，七氟醚能抑制神經元凋亡并減輕缺血再灌注誘導的細胞凋亡[16]。先前報道將這種現(xiàn)象歸因于不同的七氟醚濃度[17]，本研究則證實了七氟醚對PHN細胞活力的影響取決于其濃度。具體而言，高劑量七氟醚會抑制PHN細胞增殖，而低劑量七氟醚則會促進PHN細胞增殖。同時本研究也證實，低劑量七氟醚在CPB誘導POCD大鼠和H/R誘導PHN細胞模型中均能抑制海馬神經元凋亡，這表明低劑量七氟醚可能與CPB期間其他類型的麻醉劑聯(lián)合使用，是減輕POCD的理想藥物，但是仍需更多的實驗結果驗證。

既往研究顯示，激活PI3K/AKT信號通路并抑制海馬神經元凋亡可減輕大鼠模型POCD程度[21]。本研究顯示，CPB誘導POCD大鼠海馬組織中PI3K/AKT信號通路被抑制，與既往報道結果一致[20]。值得注意的是，低劑量七氟醚處理H/R誘導的PHN細胞，可以激活其PI3K/AKT信號通路[23]。這使我們認識到低劑量七氟醚可能影響CPB誘導POCD大鼠的PI3K/AKT信號通路，這一假設得到了進一步實驗證實，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量七氟醚重新激活了CPB誘導POCD大鼠的PI3K/AKT信號通路。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)LY294002逆轉了低劑量七氟醚對CPB誘導POCD大鼠和H/R誘導PHN細胞凋亡的保護作用。以上結果表明，低劑量七氟醚通過激活PI3K/AKT信號通路減輕了CPB誘導POCD模型PHN細胞凋亡。

總之，七氟醚以劑量依賴的方式影響海馬神經元，低劑量七氟醚通過激活PI3K/AKT信號通路抑制海馬神經元凋亡，從而減輕CPB誘導的POCD。