真空冷凍干燥技術(shù)在連翹加工中的應(yīng)用研究

郭俊俊，張國香

（山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，山西 太原 030006）

連翹果實(shí)為木犀科植物連翹（Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl）的干燥成熟種子[1]，主產(chǎn)于我國河南、山西、陜西、山東等地[2]。中藥制劑中，連翹果實(shí)長于清心熱，用于治療邪陷心包、神昏譫語等癥[3]。連翹果實(shí)主要含有苯乙醇及其苷類、木脂素及其苷類、五環(huán)三萜類、黃酮類及揮發(fā)油類等活性成分，藥理研究認(rèn)為其具有抗菌、抗炎、止呃逆、抗肝損傷、抑制磷酸二酯酶、抗病毒、降血壓等作用[4]。目前，應(yīng)季采收的連翹（青翹）處理方式主要有自然風(fēng)干、熱風(fēng)干燥及真空冷凍干燥等方式，通過比較發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥工藝處理的連翹與自然風(fēng)干、熱風(fēng)干燥處理的樣品連翹相比，外觀品質(zhì)較好，復(fù)水率顯著提高，連翹中連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素、蘆丁的提取率有提高。真空冷凍干燥過程中，預(yù)凍速率、擋板溫度及真空壓力等工藝參數(shù)均會(huì)影響連翹最終產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，以連翹（青翹）冷凍干燥工藝參數(shù)為研究對(duì)象，從優(yōu)化凍干產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)及提高連翹活性成分的提取率等方面入手，系統(tǒng)研究真空冷凍干燥工藝中預(yù)凍速率、真空壓強(qiáng)及隔板溫度等工藝參數(shù)對(duì)二者的影響，選出優(yōu)化后的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)照品連翹酯苷A（批號(hào)11810-201606）、連翹苷（批 號(hào)110821-201615）、蘆 ?。ㄅ?號(hào)100080-201608）、連翹脂素（生產(chǎn)編號(hào)PCS1413，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%），中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供；甲酸為色譜純，西格瑪奧德里奇（中國）有限公司提供；其他試劑均為分析純；水為制備的超純水；連翹，取自山西汾西縣連翹生產(chǎn)基地的成熟青翹果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)儀器

SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；BSA223S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；KQ-500E型超聲波清洗器，（200 W，25 kH），昆山超聲波聲儀器廠產(chǎn)品；XW80A型渦旋混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠產(chǎn)品；CP225D型十萬分之一天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；明澈-D 24 UV純水/超純水一體系統(tǒng)，Merck millipore默克密理博中國有限公司產(chǎn)品；S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品；VERTEX 70型傅立葉紅外變換光譜儀，布魯克光譜儀器有限公司產(chǎn)品；TSQ Endura型液相色譜三重四極桿串聯(lián)色譜儀配有Thermo fisher VANQUISH UHPLC超高壓液相部分，TSQ Endura的三重四極桿的質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

取部分連翹樣品進(jìn)行連翹共晶點(diǎn)、共熔點(diǎn)溫度測定，取部分連翹樣品進(jìn)行冷凍干燥工藝參數(shù)設(shè)定試驗(yàn)。真空冷凍干燥技術(shù)主要包括物料鋪盤厚度、預(yù)處理、預(yù)凍結(jié)、升華干燥、解析干燥、后處理等工藝過程。對(duì)冷凍干燥后的樣品，使用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)活性成分進(jìn)行含量分析，使用紅外光譜儀及掃描電鏡對(duì)活性物種類和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 操作要點(diǎn)

連翹樣品為山西汾西縣采收的應(yīng)季連翹（青翹）。連翹樣品應(yīng)去除雜質(zhì)，選取大小均一的備用。測定共晶點(diǎn)、共熔點(diǎn)的樣品應(yīng)用小刀一分為二，以便電阻法試驗(yàn)使用。用于冷凍干燥工藝試驗(yàn)的樣品，由于連翹形態(tài)特點(diǎn)而不做切片處理，可整顆直接鋪盤。連翹冷凍干燥工藝參數(shù)設(shè)置范圍：預(yù)凍速率（5～8℃/min），隔板溫度（-10～60℃），真空壓強(qiáng)（30～55 Pa）。

選取連翹凍干工藝的干燥速率[5]、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率[6]作為連翹凍干工藝的干燥特性指標(biāo)。連翹冷凍干燥樣品活性成分提取有連續(xù)回流浸提和超聲提取2種方法。經(jīng)比較，超聲提取可滿足試驗(yàn)要求，且操作簡單、方便快捷。常用提取溶劑有甲醇、乙醇、丙酮及水。經(jīng)試驗(yàn)考查，甲醇-水（4∶1）系提取效率最高，且成本較乙醇低，安全性較丙酮高。超聲提取時(shí)間控制在45 min，提取效率達(dá)到最高。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹共晶點(diǎn)、共熔點(diǎn)測定

連翹的共晶點(diǎn)和共熔點(diǎn)采用電阻法進(jìn)行測定。取50 g 1.3.2制備的連翹樣品1份進(jìn)行冷凍干燥，采用預(yù)凍速率為1℃/min進(jìn)行預(yù)凍，同時(shí)測定連翹的電阻變化并記錄，當(dāng)物料預(yù)凍到-35℃時(shí)，通過調(diào)整隔板溫度，以1℃/min進(jìn)行升溫，同時(shí)測定連翹的電阻變化并記錄

連翹電阻隨溫度降低變化圖見圖1，連翹電阻隨溫度升高變化圖圖2。

圖1 連翹電阻隨溫度降低變化圖

圖2 連翹電阻隨溫度升高變化圖

由圖1～圖2可知，當(dāng)連翹溫度高于-25℃時(shí)，電阻變化緩慢，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)，電阻隨溫度變化速率陡然增大，故連翹共晶點(diǎn)及共熔點(diǎn)溫度為-25～-30℃時(shí)，因此設(shè)定連翹預(yù)凍溫度為-35℃，預(yù)凍2 h，再進(jìn)行真空冷凍干燥。

2.2 連翹凍干曲線繪制

使用SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品），對(duì)1.3.2制備的樣品進(jìn)行凍干試驗(yàn)，同時(shí)監(jiān)測凍干過程物料溫度、冷阱溫度、凍干箱壓力等3個(gè)參數(shù)隨時(shí)間的變化曲線，并繪制出連翹的凍干曲線。

連翹凍干曲線見圖3。

圖3 連翹凍干曲線

由圖3可知，連翹的凍干過程主要包括物料的預(yù)凍過程、升華干燥過程和解析干燥過程[7]。-35℃下預(yù)凍2 h；然后控制隔板溫度，使物料溫度達(dá)到-30℃（共結(jié)晶溫度附近），維持15 h進(jìn)行真空冷凍干燥，直到物料中的凍結(jié)冰升華完畢，此階段凍干箱內(nèi)的真空度維持在物料溫度所對(duì)應(yīng)飽和蒸汽的30%，即35～50 Pa；最后控制隔板溫度，使物料溫度達(dá)到最高容許溫度30℃，同時(shí)保持高真空度，維持6 h，進(jìn)行凍干物料的解析干燥，直到整個(gè)凍干程序結(jié)束。

2.3 預(yù)凍速率對(duì)連翹干燥特性的影響

取50g 1.3.2制備的樣品5份，按照凍干曲線試驗(yàn)設(shè)置的條件，分別以4.5，5.5，6.5，7.5，8.5℃/min速率進(jìn)行預(yù)凍2 h，隨后執(zhí)行后續(xù)冷凍干燥程序，直至凍干程序結(jié)束。分取凍干物料進(jìn)行干燥速率、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率計(jì)算，并繪制預(yù)凍速率對(duì)干燥特性的變化圖。

不同預(yù)凍速率下連翹干燥特性變化見圖4。

由圖4可知，冷凍干燥過程中，凍結(jié)溫度越低，凍結(jié)速率越快，形成的晶核數(shù)量越多，晶粒越細(xì)，凍干產(chǎn)品質(zhì)量好，但凍干過程慢，生產(chǎn)效率低、面積收縮率大。相反，如果凍結(jié)速度慢，晶核數(shù)量少，晶粒大，凍干時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，面積收縮率小。結(jié)合真空冷凍機(jī)自身特征，預(yù)凍速率應(yīng)當(dāng)控制在5～8℃/min。

圖4 不同預(yù)凍速率下連翹干燥特性變化

2.4 真空壓強(qiáng)對(duì)連翹干燥特性的影響

取50 g 1.3.2制備的樣品6份，按照凍干曲線試驗(yàn)設(shè)置的條件，分別以腔內(nèi)真空壓強(qiáng)為30，40，50，60，70，80 Pa執(zhí)行冷凍干燥程序，直至凍干程序結(jié)束。分取凍干物料進(jìn)行干燥速率、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率的計(jì)算，并繪制真空壓強(qiáng)對(duì)干燥特性的變化圖。

不同壓強(qiáng)下連翹干燥特性變化見圖5。

由圖5可知，連翹的干燥速率隨干燥室壓強(qiáng)增加呈先升后降的趨勢，在40 Pa時(shí)速率達(dá)最大值。物料單位時(shí)間其干燥速率[5]與生產(chǎn)率[6]呈正相關(guān)，因此連翹的單位時(shí)間生產(chǎn)率也呈現(xiàn)相同的趨勢。真空壓力過高，會(huì)影響連翹的品質(zhì)。故壓力應(yīng)當(dāng)控制在35～50 Pa。

圖5 不同壓強(qiáng)下連翹干燥特性變化

2.5 隔板溫度連翹干燥特性的影響

取50 g 1.3.2制備的樣品6份，按照凍干曲線試驗(yàn)設(shè)置的條件，分別以隔板溫度為35，40，45，50，55，60℃執(zhí)行冷凍干燥程序，直至凍干程序結(jié)束。分取凍干物料進(jìn)行干燥速率、生產(chǎn)效率及樣品表面積收縮率的計(jì)算，并繪制隔板溫度對(duì)干燥特性的變化圖。

不同隔板溫度下連翹干燥特性變化見圖6。

圖6 不同隔板溫度下連翹干燥特性變化

由圖6可知，隨著隔板溫度的升高，增加了傳熱推動(dòng)力，有利于水分逸出，加快干燥速率，連翹的干燥速率和生產(chǎn)率也隨之增大，且溫度升高會(huì)加劇連翹的收縮變形，溫度過高會(huì)使連翹受熱不均，影響品質(zhì)。綜合考慮，隔板溫度控制在50～60℃。

2.6 不同工藝參數(shù)對(duì)連翹中4種活性物質(zhì)得率的影響

將2.3、2.4及2.5不同工藝參數(shù)條件下冷凍干燥后的樣品粉碎研磨，各取1 g，置于50 mL具塞量筒中，準(zhǔn)確加入70%的甲醇25 mL，稱質(zhì)量，常溫超聲提取45 min，放冷，稱質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足失重，過0.25 μm濾膜，取濾液2.0 mL上液質(zhì)聯(lián)用儀測定連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素、蘆丁等4種活性成分含量。按以上方法每份凍干物料各測定2次，取平均值，繪制活性物質(zhì)得率對(duì)工藝參數(shù)的曲線圖。

不同干燥特工藝參數(shù)條件下連翹中4種活性成分變化趨勢見圖7。

由圖7可知，干燥工藝各參數(shù)設(shè)置對(duì)連翹中4種活性成分得率的影響顯著。且各活性成分得率隨干燥工藝各參數(shù)的變化規(guī)律不盡相同。因此，以單一因素對(duì)連翹冷凍干燥工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，無法綜合和全面反映干燥工藝參數(shù)設(shè)置對(duì)連翹凍干品質(zhì)的影響，需要采用正交試驗(yàn)來解決問題。

圖7 不同干燥特工藝參數(shù)條件下連翹中4種活性成分變化趨勢

2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的考查結(jié)果，建立活性成分得率與各因素（預(yù)凍速率、真空壓強(qiáng)、隔板溫度）之間的數(shù)學(xué)模型，選用L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)水平重復(fù)3次，以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[8]。以連翹活性物質(zhì)得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)預(yù)凍速率、真空壓強(qiáng)、隔板溫度3個(gè)因素進(jìn)一步考查。以得到連翹冷凍干燥工藝參數(shù)的較佳設(shè)置。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，二次回歸正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 二次回歸正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

由表2可知，最優(yōu)凍干工藝參數(shù)是8號(hào)，即A3B2C1，根據(jù)預(yù)凍速率、正空壓強(qiáng)和隔板溫度三因素對(duì)連翹有效成分得率影響的主次順序?yàn)轭A(yù)凍速率>隔板溫度>真空壓強(qiáng)，確定最優(yōu)凍干工藝組合為A3B2C1。既預(yù)凍速率為7.5℃/min，真空度為40 Pa，隔板溫度為50℃的條件下，連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素、蘆丁的甲醇浸出物含量分別為3.648%，0.560%，0.037%，0.170%，連翹活性成分提取得率的綜合評(píng)分最高為1.103 9%。

2.8 凍干產(chǎn)品品質(zhì)分析

在最優(yōu)干燥工藝下制備凍干連翹樣品，并以自然干燥、熱風(fēng)干燥樣品為對(duì)照，進(jìn)行特性對(duì)比研究。自然干燥指自然條件下曬干，熱風(fēng)干燥樣品是在與優(yōu)選的真空冷凍干燥工藝相同的溫度條件下干燥。

2.8.1 連翹紅外指紋圖譜研究。

分別將適量不同干燥方式的樣品粉末與溴化鉀按照1∶100比例混合均勻，直接壓片，采用傅立葉紅外變換光譜儀進(jìn)行掃描[2]。結(jié)果為不同干燥方式所得連翹樣品的紅外指紋圖譜峰形相似，僅存在信號(hào)強(qiáng)弱差異。表明連翹樣品在不同的干燥方式下，其化學(xué)成分并未發(fā)生變化。

2.8.2 連翹樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究結(jié)果

真空冷凍干燥的產(chǎn)品色度更接近新鮮連翹樣品；凍干產(chǎn)品更好地保留了連翹樣品的植物組織結(jié)構(gòu)，植物結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生塌陷；采用真空冷凍干燥工藝制備的連翹樣品植物形態(tài)及品質(zhì)更接近新鮮樣品，質(zhì)量良好。

不同干燥方式的連翹樣品紅外指紋圖譜見圖8，不同干燥方式的連翹樣品和新鮮樣品的SEM圖見圖9。

圖8 不同干燥方式的連翹樣品紅外指紋圖譜

3 結(jié)論

從冷凍干燥技術(shù)關(guān)鍵參數(shù)的確定出發(fā)，使用電阻法測定了連翹的共晶點(diǎn)溫度和共熔點(diǎn)溫度，在-25～-30℃范圍內(nèi)，因此設(shè)定連翹預(yù)凍溫度為-35℃。通過測定凍干速率、單位時(shí)間生產(chǎn)率及干燥樣品的面積收縮率等干燥特性指標(biāo)，確定冷凍干燥工藝關(guān)鍵核心參數(shù)預(yù)凍速率、真空壓強(qiáng)計(jì)及隔板溫度等。從而繪制出連翹冷凍干燥工藝的凍干曲線。通過各類單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得出SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）對(duì)連翹的凍干工藝的最優(yōu)參數(shù)值為預(yù)凍速率7.5℃/min，真空度40 Pa，隔板溫度50℃。該條件下，凍干的連翹樣品，在外觀、色澤及內(nèi)部結(jié)構(gòu)保留了與新鮮樣品具有同樣的品質(zhì)，而且更多地保留了連翹中易揮發(fā)、高溫易氧化分解的活性成分。

圖9 不同干燥方式的連翹樣品和新鮮樣品的SEM圖