宿主不同對叢枝菌根真菌擴繁效應(yīng)的影響

馬俊卿，侯 寧，孫晨瑜，楊怡森，覃圣峰，王 勇，劉 璐，廖虹霖，黃京華,3

（1廣西大學農(nóng)學院，南寧 530004；2廣西高校作物栽培學與耕作學重點實驗室，南寧 530004；3廣西大學植物科學實驗教學中心，南寧 530004）

0 引言

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)能與陸地生態(tài)系統(tǒng)中80%以上的高等植物根系共生形成共生體，即菌根(mycorrhiza)[1-3]。AMF可以促進宿主植物對水分和營養(yǎng)的吸收，促進宿主植物的生長[4-7]，但不同AMF對宿主植物吸收養(yǎng)分的促進作用不同，不同的宿主植物與AMF的共生狀況也不同[8]；基質(zhì)不同、營養(yǎng)元素含量差異等都會不同程度地影響菌根真菌與植物的共生關(guān)系[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMF的生長繁殖與宿主植物的生長特性和狀況密切相關(guān)，孢子的產(chǎn)量跟宿主植物的地下生物量有關(guān)，宿主植物的根系發(fā)達程度會影響孢子密度的變化，從而影響菌劑的擴繁[10]。因此，在菌根菌劑生產(chǎn)過程中應(yīng)該選用根量大的宿主植物以生產(chǎn)高質(zhì)量菌劑[8]。研究表明，玉米(Zea mays)、白三葉草(Trifolium repens)、高粱(Sorghum bicolor)、洋蔥(Allium cepa)、大麥(Hordeum vulrare)、苜蓿(Medicago sativa)、花生(Arachis hypogaea)、青蔥(Allium fistulosum)、棉 花 (Gossypiumhirsutum)、石 刁 柏(Asparagus officinalis)、百喜草(Paspalum notatum)、蘇丹草(Sorghum sudanense)等均可作為AMF擴繁的候選宿主[11]。不同宿主可以選擇性地促進或抑制一些AMF的生長發(fā)育，因此篩選某一特定菌種的最佳宿主在生產(chǎn)實踐中具有重要意義。然而在南亞熱帶濕熱地區(qū)，不同宿主植物對盆栽AMF擴繁的影響鮮有報道。本試驗增設(shè)黑麥草(Lolium perenne)作為擴繁宿主，與常規(guī)宿主植物玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、三葉草(Trifolium pratense)進行試驗，探索不同宿主對聚叢根孢囊霉(Rhizophagus aggregatus)和幼套近明球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)孢子密度、侵染率、接種勢及擴繁效應(yīng)的影響，以篩選合適的宿主植物，為南亞熱帶濕熱地區(qū)AMF菌劑生產(chǎn)體系的建立提供科學依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗供試菌種為：聚叢根孢囊霉（Rhizophagus aggregatus，以下簡稱RA），孢子密度為24個/g；幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum，以下簡稱CE），孢子密度為26個/g。以上2種AMF均購自北京市農(nóng)林科學院中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫（菌株編號分別為BGC BJ07、BGC HEN02A）。本試驗采用盆栽的方法，塑料花盆高15 cm、直徑20 cm，用滅菌河沙做擴繁基質(zhì)。本試驗宿主植物基本情況及來源如表1所示。

表1 宿主植物基本情況及來源

1.2 試驗方法

試驗于2018年3月20日—7月22日在廣西大學農(nóng)學院科研溫室進行，溫室溫度控制在28℃。花盆用0.1%的高錳酸鉀浸泡24 h后用無菌水沖洗干凈，然后將AMF菌劑與滅菌河沙按AMF菌劑:滅菌河沙=1 g:40 g的比例混合均勻轉(zhuǎn)移到花盆中。玉米、高粱均每盆播種10粒種子，出苗后間苗至6株/盆；三葉草和黑麥草每盆播種20粒種子，出苗后間苗至10株/盆。出苗至第60天，每周澆1次水，每次澆水量為200 mL；第61天至擴繁結(jié)束每3天澆一次水，每次200 mL；每2周澆1次霍格蘭營養(yǎng)液，每次50 mL，為植物提供養(yǎng)分。在種植后的第30、60、90、120天收集宿主植物根系及根圍的基質(zhì)?；|(zhì)置于無污染的自封袋中做好標記后帶回實驗室，常溫風干至恒重后用于測定孢子密度；將不同宿主植物的根系分別另外裝袋并做好標記帶回實驗室，用無菌水清洗干凈后室溫保存于50%乙醇中固定，用于染色并測定菌根侵染率。每個處理設(shè)置3組重復(fù)試驗。

1.2.1 孢子密度的測定 取5 g土樣，用濕篩傾析-蔗糖離心法[12]篩選出AMF孢子混合物，對培養(yǎng)皿中的孢子進行密度的觀察，觀察后用0.5～10 μL的移液槍小心將孢子吸到表面皿中，進一步觀察形態(tài)、大小、數(shù)量等。

1.2.2 侵染率的測定 取固定好的宿主植物根系按透明—脫色—酸化—染色—褪色的步驟進行處理[13]，脫色結(jié)束后更換無菌水保存。取20條根段置于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察菌根的形態(tài)結(jié)構(gòu)、侵入點、泡囊等，根段內(nèi)觀察到侵入點、菌絲、泡囊等都記做被侵染。根據(jù)每段根系菌根結(jié)構(gòu)的多少按0%、10%、20%、30%、…、100%的侵染數(shù)量給出每條根段的侵染率，記錄各侵染率下根段的條數(shù)。參照式(1)計算該樣品菌根的侵染率[14-15]。

1.2.3 接種勢的測定 接種勢的測定方法見公式(2)。式(2)中，N為單位長度根段內(nèi)含有的泡囊、孢子數(shù)和侵入點的總和，W為根重，K為單位質(zhì)量根系長度，S為單位質(zhì)量或體積接種劑內(nèi)孢子數(shù)量[14-15]。由于不同種類宿主植物的根長、根重等差異很大，造成的差異會影響接種勢的大小，從而影響其對AMF擴繁效應(yīng)的比較，本研究在此接種勢公式的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，以適于不同種類宿主對AMF的擴繁后接種勢的比較。本研究將接種勢公式優(yōu)化為公式(3)。式(3)中，IR為AMF對宿主植物的侵染率，S為每克基質(zhì)內(nèi)孢子數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016進行整理，并采用SPSS 19.0 Windows軟件包進行統(tǒng)計分析，在5%和1%的置信水平下，通過單因素方差分析和最小顯著性差異(LSD)計算，確定處理之間的統(tǒng)計顯著性差異；用Sigma Plot 10.0及R 3.6.1(https://www.r-project.org/)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同宿主的菌根侵染率

由圖1a可以看出，擴繁RA的試驗中，第30～90天RA對三葉草侵染率的增幅最明顯。擴繁第30天時不同宿主的菌根侵染率差異最小，該時期RA對玉米的菌根侵染率最大，高粱次之，兩者均與三葉草和黑麥草的菌根侵染率之間存在極顯著差異(P＜0.01)，RA對三葉草的菌根侵染率最小，為2.27%。擴繁第60天時不同宿主的菌根侵染率差異均達到極顯著水平(P＜0.01)，菌根侵染率從大到小依次為玉米＞高粱＞三葉草＞黑麥草，玉米和黑麥草的菌根侵染率分別為36.60%和11.80%。擴繁第90天時，玉米的菌根侵染率為41.40%，三葉草的菌根侵染率為38.93%，兩者均與黑麥草及高粱的菌根侵染率之間存在極顯著差異(P＜0.01)，該時期RA對玉米的侵染率最高，為41.40%，對黑麥草的侵染率最低，為23.53%。擴繁第120天時，不同宿主的菌根侵染率之間差異均達到極顯著水平(P＜0.01)，菌根侵染率從大到小依次為玉米＞高粱＞三葉草＞黑麥草，其中玉米和黑麥草的菌根侵染率分別為44.93%和18.93%。

圖1 AMF在不同宿主上的菌根侵染率

由圖1b可以看出，擴繁CE的試驗中，菌根對宿主植物的侵染率與擴繁時間呈正相關(guān)。第30～60天三葉草的增長幅度最明顯，第60～120天高粱的增長幅度最明顯。擴繁第30天時CE對玉米的侵染率最大，對黑麥草的侵染率最低，兩者之間的差異達到極顯著水平(P＜0.01)，且與其他各宿主之間也存在極顯著差異。擴繁第60天時玉米和三葉草兩者分別與黑麥草和高粱之間存在極顯著差異(P＜0.01)。擴繁第90天時三葉草和高粱兩者分別與玉米和黑麥草之間存在極顯著差異(P＜0.01)。擴繁第120天時玉米、高粱和三葉草的侵染率顯著高于黑麥草(P＜0.01)，該時期CE對玉米的侵染率最高，為51.60%，對黑麥草的侵染率最低，為21.20%。

2.2 不同宿主擴繁AMF的孢子密度

由圖2a可以看出，擴繁RA的試驗中，擴繁0～60天玉米的孢子密度增加最快，并且第30天玉米的孢子密度顯著高于三葉草和高粱，60天玉米的孢子密度顯著高于其他各宿主。擴繁第120天基質(zhì)中孢子密度由大到小為玉米＞高粱＞黑麥草＞三葉草，三葉草的孢子密度為78.67個/g，顯著低于其他各宿主植物(P＜0.05)，玉米的孢子密度最大，為102.12個/g，與三葉草之間的差異達到極顯著水平(P＜0.01)。

圖2 不同宿主擴繁AMF的孢子密度

由圖2b可以看出，擴繁CE的試驗中，CE的孢子密度與擴繁時間呈正比，擴繁第0～90天高粱做宿主的孢子密度增長幅度最大。擴繁第30天高粱的孢子密度偏低，并且顯著低于玉米、三葉草和黑麥草(P＜0.05)；第90天高粱的孢子密度超過其他各宿主植物，并顯著高于黑麥草(P＜0.05)。擴繁第120天基質(zhì)中孢子密度由大到小為高粱＞玉米＞黑麥草＞三葉草，高粱的孢子密度最大，為105.87個/g，與黑麥草和三葉草之間均存在極顯著差異(P＜0.01)，黑麥草的孢子密度最小，為89.33個/g，與玉米之間均存在顯著差異(P＜0.05)。

2.3 不同宿主擴繁AMF菌劑的接種勢

由圖3a可以看出，擴繁RA的試驗中，玉米做宿主RA在每個時期的接種勢均最高，黑麥草做宿主的擴繁能力最差。不同宿主對RA接種勢的影響不同，三葉草在前3個時期增加幅度最大。黑麥草在前中期組間差異比較小，高粱的組間差異比較大。擴繁結(jié)束后接種勢從大到小的宿主依次為玉米＞高粱＞三葉草＞黑麥草，玉米做宿主擴繁后的接種勢為137.47。

圖3 不同宿主對AMF接種勢的影響

由圖3b可以看出，擴繁CE的試驗中，各宿主植物對CE的擴繁能力隨著擴繁時間的增加而提高，玉米做宿主CE在0～90天的接種勢均最高，高粱做宿主CE接種勢的增長幅最大，黑麥草的增加幅度最小。黑麥草在各時期組間差異比較小，玉米在各時期的組間差異比較大。擴繁結(jié)束后CE的接種勢從大到小依次為高粱＞玉米＞三葉草＞黑麥草，高粱做宿主擴繁結(jié)束后的接種勢為153.53。

2.4 不同宿主擴繁AMF菌劑的擴繁效果

AMF擴繁后的孢子密度及擴繁效果如表2所示，不同宿主對RA的擴繁效果從高到低依次為玉米＞高粱＞黑麥草＞三葉草，玉米、高粱和黑麥草均與三葉草之間存在極顯著差異(P＜0.01)；玉米擴繁后的基質(zhì)中RA的孢子密度高于其他宿主，擴繁結(jié)束后玉米對RA的擴繁效果為325.56%。不同宿主對CE的擴繁效果從高到低依次為高粱＞玉米＞三葉草＞黑麥草，并且玉米和高粱的擴繁效果均極顯著高于三葉草和黑麥草(P＜0.01)；高粱擴繁后的基質(zhì)中CE的孢子密度高于其他宿主，擴繁結(jié)束后高粱對CE的擴繁效果為307.18%。

表2 不同宿主對RA及CE的擴繁效果

2.5 相同宿主對不同AMF菌劑的擴繁效果

擴繁結(jié)束后，相同宿主對不同AMF的擴繁效應(yīng)如表3所示。同一宿主對不同AMF的擴繁效應(yīng)不同，其中玉米、黑麥草對RA的擴繁效應(yīng)優(yōu)于CE，三葉草和高粱則相反。對RA和CE擴繁效應(yīng)差異影響從大到小依次為黑麥草＞玉米＞高粱＞三葉草，除黑麥草對RA和CE擴繁效應(yīng)的差異達到顯著水平外，其他宿主對RA和CE擴繁效應(yīng)雖然存在差異，但差異未達到顯著水平。

表3 相同宿主對RA和CE的擴繁差異

2.6 AMF侵染率、孢子密度、接種勢相關(guān)性分析

對AMF的侵染率、孢子密度及接種勢進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AMF的侵染率、孢子密度以及接種勢之間均具有顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.001)，結(jié)果如圖4所示。侵染率對AMF接種勢的影響高于孢子密度對接種勢的影響，CE接種勢受侵染率的影響更加明顯，相關(guān)系數(shù)為0.97。AMF侵染率在一定程度上可以反映其孢子密度的大小，并且兩者之間存在極顯著相關(guān)性(P＜0.001)，CE侵染率和孢子密度之間的相關(guān)性要高于RA。

3 討論與結(jié)論

AMF對宿主的侵染程度以及與宿主的共生狀態(tài)與共生時間呈正比，但不會無限增加，在共生90天左右會達到一個穩(wěn)定的共生狀態(tài)。不同宿主受AMF侵染的情況不同，因而不同宿主對同一AMF擴繁的能力不同，相同宿主對不同AMF擴繁的能力也不相同，這與Selvakumarl、李媛媛等[8,16]的研究結(jié)果一致。本試驗發(fā)現(xiàn)侵染率可以反映孢子密度大小，即菌根侵染率和孢子密度間具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，這與Mathur及Al-Raddad[17-18]的研究結(jié)果不同。

在擴繁的第120天，三葉草和黑麥草擴繁的RA的接種勢驟降，其中三葉草接種勢驟降是由孢子密度下降導(dǎo)致的，黑麥草接種勢驟降是由侵染率的下降導(dǎo)致的?？赡苁?個處理在試驗后期遭受了二斑葉螨的為害，噴灑農(nóng)藥殺蟲所致。說明AMF對農(nóng)藥非常敏感，農(nóng)藥對菌根侵染率、后代孢子產(chǎn)量、菌絲和活性均有抑制效應(yīng)，施用農(nóng)藥會顯著降低孢子的萌發(fā)率并顯著抑制菌絲的生長[19-20]。不同農(nóng)藥對宿主AMF后代孢子產(chǎn)量及侵染率的影響程度不同。

本試驗中，玉米擴繁RA和CE兩種AMF的能力均最佳，說明本試驗所選的4種宿主植物中玉米和RA、CE的共生能力高于其他宿主。結(jié)合前人研究結(jié)果分析，原因可能是：（1）玉米的根系較其他宿主更為發(fā)達，更有利于菌劑孢子的繁殖；（2）AMF與玉米共生對玉米根系的生物量提升高于其他宿主植物[21]，而有研究表明孢子的產(chǎn)量跟宿主植物的地下生物量有關(guān)，宿主植物的根系發(fā)達程度會影響孢子密度的變化，從而影響菌劑的擴繁[10]。說明宿主植物對菌劑擴繁的影響可能主要體現(xiàn)在根系發(fā)達程度以及宿主植物與真菌的相互選擇性上[10]。

本試驗中，AMF對黑麥草的侵染率始終低于其他宿主，說明黑麥草與RA、CE的共生能力較其他宿主植物弱，有研究發(fā)現(xiàn)菌根共生能力較弱的植物會降低混作在一起的菌根共生能力較強的植物的侵染率[22-23]，說明菌根共生能力較弱的植物會降低菌根的共生能力，不適合做AMF擴繁的宿主[24-26]。非菌根植物在有效磷資源缺乏的情況下，會通過自身生長和根系活動將土壤中的磷由不可利用形態(tài)轉(zhuǎn)化為可利用形態(tài)，因而與AMF競爭土壤中的鈣磷，接種AMF會降低非菌根植物的磷營養(yǎng)狀況及生物量[26-27]，非菌根植物由于與AMF的共生能力較弱，所以不在AMF擴繁宿主的考慮范圍之內(nèi)。

除宿主植物不同會影響AMF的生長繁殖外，基質(zhì)組分不同[9]、基質(zhì)pH的差異、類黃酮物質(zhì)[28]等都會影響AMF的擴繁效果。本試驗在保證其他變量一致的基礎(chǔ)上僅對不同宿主擴繁AMF效應(yīng)進行了研究，后續(xù)研究將對其各影響因素進行組合研究，以期探索對AMF擴繁影響最大的因子，為AMF的擴繁提供更加充分的理論依據(jù)。

綜上，AMF與不同的宿主植物之間以及不同AMF與同一宿主之間的親和力均不同，即不同宿主對同一AMF的擴繁效應(yīng)不同，相同宿主對不同AMF的擴繁效應(yīng)也不同。AMF侵染率可以反映菌根真菌與植物的共生狀況，在一定程度上也可以反映孢子的生長狀況，并且AMF對宿主的侵染率與其孢子密度之間存在極顯著的相關(guān)性。宿主植物對菌劑擴繁的影響，可能體現(xiàn)在根系發(fā)達程度以及宿主植物與真菌的相互選擇性上，AMF的生長繁殖可能與宿主植物的生長狀況密切相關(guān)，而且孢子密度以及對宿主的侵染率很可能與宿主植物的地下生物量以及根系形態(tài)有關(guān)。AMF對農(nóng)藥非常敏感，農(nóng)藥的使用會降低AMF的侵染率以及孢子密度。因此，為了提高AMF菌劑質(zhì)量及接種勢，針對某一AMF篩選最適的宿主植物是非常有必要的。

AMF的孢子密度及其對宿主的侵染能力不會無限增長，在共生前期增長迅速，而在共生后期則趨于穩(wěn)定。同一AMF與不同宿主的親和力不同，同一宿主對不同AMF的擴繁效應(yīng)也不同。本試驗結(jié)果表明，與豆科植物相比禾本科植物對AMF擴繁效應(yīng)更高，RA的最佳擴繁宿主是玉米，CE的最佳擴繁宿主是高粱。