廣東始興枇杷葉總黃酮提取工藝研究

劉慕妝，李紫寧，趙晨惠，范文靜，陳禮培*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；5.佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231）

枇杷是薔薇科亞熱帶喬木，享有“天下第一果”的美稱，是廣東始興名優(yōu)特產(chǎn)水果之一，有近500 年栽培歷史。2004 年，始興被命名為“中國枇杷之鄉(xiāng)”。枇杷葉被廣泛關(guān)注，這是由于其具有祛痰、止咳止嘔、和胃清肺、提高免疫力等功效［1-3］。枇杷葉有黃酮類［4］、三萜酸類［5］、倍半萜苷類［6］、多酚［7］和多糖［8］等主要成分。其中黃酮類化合物有清除體內(nèi)自由基的功能，在抗氧化、抗病毒、降血糖、抑制炎癥因子等方面展示了較好的生理活性，在治療呼吸道疾病、心血管疾病及中毒性肝臟損傷等方面也有顯著效果［9-10］，具有較高的應(yīng)用價值。然而，始興每年產(chǎn)生的大量枇杷葉大都作為落葉垃圾或直接焚燒處理，絕大部分枇杷葉沒有被開發(fā)利用，這不僅造成了枇杷葉資源浪費(fèi)，還引起一定程度的環(huán)境污染。若能夠深入研究優(yōu)化提取枇杷葉中總黃酮工藝，可成為提升始興枇杷葉附加值的一種途徑，使其“變廢為寶”。

國內(nèi)外枇杷葉總黃酮的提取方法主要有：回流提?。?1］、纖維素酶輔助提?。?2］、減壓內(nèi)部沸騰提?。?3］、微波提取［14］、超聲提取等［15］。其中，超聲波輔助提取始興枇杷葉的總黃酮，是一種較綠色、新穎的提取工藝，該提取方法具有穿透力強(qiáng)，選擇性高，提取時間短，且溶劑用量較少的優(yōu)點(diǎn)［16］。鑒此，本研究以始興枇杷葉為原料，以枇杷葉總黃酮提取率作為指標(biāo)，對超聲波輔助乙醇法提取枇杷葉總黃酮的工藝進(jìn)行研究，以獲得枇杷葉總黃酮提取的最佳工藝，旨在為始興枇杷葉的綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枇杷葉，廣東始興；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（AR≥98 %），北京索萊寶科技有限公司；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制；硝酸鈉（分析純），廣州試劑公司；硝酸鋁（分析純），廣州試劑公司；氫氧化鈉（分析純），廣州試劑公司；無水乙醇（分析純）；廣州試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

采用的儀器設(shè)備有：高頻超聲波清洗機(jī)SB25-12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平ME2002/02，梅特勒-托利多；移液槍PL 系列，梅特勒-托利多；臺式高速冷凍離心機(jī)ALLEGRA-64R，貝克曼；紫外分光光度計(jì)UV-2350，尤尼柯；恒溫干燥箱DHG-9248A，上海精宏；多功能粉碎機(jī)GX-04，浙江高鑫工貿(mào)有限公司。

1.3 測定方法

1.3.1 枇杷葉總黃酮提取工藝流程

將枇杷葉于60 ℃干燥48 h，將干燥后的枇杷葉粉碎研磨并過80 目篩，得到枇杷葉粉末。按照一定的料液比，加入一定質(zhì)量濃度的乙醇溶劑，在一定的溫度下，超聲提取一定的時間，超聲提取結(jié)束后得到枇杷葉總黃酮提取樣品，4 000 r/min 離心10 min，取0.5 mL 上清液進(jìn)行總黃酮測定。

1.3.2 枇杷葉總黃酮測定方法

式中：C 為提取液中的黃酮含量，mg/mL；V 為提取液的體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；m 為枇杷葉粉末的質(zhì)量，mg。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取1.00 g 枇杷葉粉末，以乙醇為提取溶劑，按下述試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

固定料液比1∶20 g/mL，超聲時間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，改變超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃），考察超聲溫度對始興枇杷葉中的總黃酮提取率的影響；固定料液比1∶20 g/mL，超聲時間40 min，超聲溫度50 ℃，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)（30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %），考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對始興枇杷葉中的總黃酮提取率的影響；固定料液比1∶20 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，超聲溫度50 ℃，改變超聲時間（30、40、50、60、70、80 min），考察超聲時間對始興枇杷葉中的總黃酮提取率的影響；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，超聲溫度50 ℃，超聲時間40 min，改變料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL），考察料液比對始興枇杷葉中的總黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken的原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以料液比、超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度4 個因素作為自變量，分別用A、B、C、D 表示，低中高水平分別用-1、0、1 編碼，用總黃酮提取率作為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平如表1 所示。

一是播后苗前搶田間濕度好時選用異丙隆與丙草胺、氟唑磺隆等藥劑混用進(jìn)行土壤封閉；二是小麥苗齡達(dá)2葉1心-3葉1心（根據(jù)不同藥劑來確定），抓住溫濕度條件好時及早進(jìn)行莖葉處理（搶用藥），盡可能在雜草3葉期前用藥，提高對抗性雜草的防除效果。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Design-Expert8.0.6 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，利用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對枇杷葉總黃酮提取率的影響

由圖1 可知，始興枇杷葉總黃酮提取過程中，提取溶劑太少時，物料中的黃酮類化合物提取不充分，提取率較低。當(dāng)料液比在1∶10～1∶25 g/mL 范圍內(nèi)時，隨著溶劑用量的增加，始興枇杷葉中的總黃酮提取率不斷增大，這是由于在溶劑用量增加的同時，也會增大枇杷葉粉末與乙醇溶液之間接觸面積，有利于枇杷葉黃酮類化合物的釋放。料液比為1∶25 g/mL 時，總黃酮提取率達(dá)到峰值，總黃酮可以最大限度地溶解出來。當(dāng)繼續(xù)增加提取溶劑的用量后，提取率反而減小，其原因可能是當(dāng)溶劑用量太大的時候，一方面會導(dǎo)致一些大分子物質(zhì)也溶解出來，比如可溶性蛋白物質(zhì)［18］，競爭總黃酮的提取作用，影響了始興枇杷葉中黃酮類化合物的提取效果［19］；另一方面過量的乙醇溶液會與黃酮類化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成酚酸類物質(zhì)［20］。而且乙醇溶液過多還浪費(fèi)大量試劑，造成資源浪費(fèi)［21］。

圖1 料液比對總黃酮提取率的影響

2.1.2 超聲時間對枇杷葉總黃酮提取率的影響

由圖2 可知，枇杷葉總黃酮提取過程中，當(dāng)超聲時間太短時，黃酮類化合物僅部分溶解出來，無法達(dá)到完全提取。當(dāng)超聲時間在30～50 min 范圍內(nèi)時，隨超聲時間的延長，始興枇杷葉總黃酮提取率逐漸增大。當(dāng)超聲時間增加至50 min 時提取率達(dá)到峰值，從枇杷葉粉末中溶解出來的目標(biāo)成分含量最多，提取效果最好。但當(dāng)繼續(xù)增加提取時間時，提取率反而下降，這是由于超聲時間過長，一方面，總黃酮已達(dá)到提取平衡，提取率不再增加，另一方面時間過長可能導(dǎo)致總黃酮降解或順反異構(gòu)化，導(dǎo)致黃酮提取率下降［22-23］。

圖2 超聲時間對總黃酮提取率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

植物中的黃酮大多是由苷元與糖組合而成，糖易溶于水，而苷元易溶于乙醇溶液。按照相似相溶原理，當(dāng)提取溶劑與苷元極性相似時，有利于總黃酮溶出，提取率最大［24］。從圖3 可看出，枇杷葉總黃酮提取過程中，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)從40 %增大到60 %，總黃酮提取率呈上升趨勢，于60 %時達(dá)到峰值。但乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，提取率反而呈下降趨勢。這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過大，又會導(dǎo)致一些醇溶性雜質(zhì)溶解出來，干擾枇杷葉總黃酮的提取，造成提取率下降［25］。本研究選取60 %乙醇體積分?jǐn)?shù)，此時提取率最大。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

從圖4 可看出，枇杷葉中的總黃酮提取過程中，當(dāng)溫度從30 ℃升到60 ℃過程中，提取溫度升高，分子擴(kuò)散速度加快，傳質(zhì)速度提高，黃酮類化合物從枇杷葉轉(zhuǎn)移至乙醇溶液中的速度因此加快，總黃酮提取率呈上升趨勢，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時達(dá)到峰值。但當(dāng)超聲溫度大于70 ℃時，總黃酮提取率明顯減小，這是由于溫度過高會導(dǎo)致黃酮類化合物中不耐熱的苷元遭到破壞，反而降低總黃酮提取率［26］。本研究中超聲溫度60 ℃時，提取率最大。

圖4 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2，由此可以看出，當(dāng)料液比為1∶25 g/mL，超聲時間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %，超聲溫度為60 ℃時（實(shí)驗(yàn)編號26），提取率達(dá)到最大，為3.89 %。使用軟件對表2 數(shù)據(jù)用回歸模型進(jìn)行分析，得到提取率對4 個因素的二次回歸模型方程為：

2.2.2 回歸模型擬合及方差分析

由表3 可知，該方程的F 值為42.49，P<0.000 1，此模型顯著。方差進(jìn)一步檢驗(yàn)看出，A（料液比）、B（超聲時間）、C（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、D（超聲溫度）、A2、B2、C2、D2、BD 影響顯著（P<0.05），AB、AC、AD、BC、CD影響不顯著。方程中失擬項(xiàng)的數(shù)值為P>0.05（P=0.968 5），不顯著，表明該模型不失擬，即其他未檢驗(yàn)因素對該試驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果影響較小，可忽略不計(jì)。方程中的相關(guān)系數(shù)（R2=0.977 0）接近1，表明觀察值和預(yù)測值之間具有較高的相關(guān)性，說明擬合程度好。Adj-R2=0.954 0，表明有95.40 %的響應(yīng)值變化由4 個因素引起，說明擬合度較高。因此，該回歸方程可以表示本試驗(yàn)各因素與枇杷葉總黃酮提取率之間的關(guān)系，能夠用該模型對提取結(jié)果進(jìn)行推測，并優(yōu)化提取工藝。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果中，F(xiàn) 值越大，P 值越小，即該因素對響應(yīng)值影響越大，否則反之。根據(jù)F 值可知，對結(jié)果的影響強(qiáng)弱為B（超聲時間）>D（超聲溫度）>A（料液比）>C（乙醇體積分?jǐn)?shù)），即在4 個因素中對所需要提取的目標(biāo)成分影響最大是超聲時間與超聲溫度，其次是料液比，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對響應(yīng)值的影響最小。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面圖和等高線圖能夠較為直觀反映各因素之間的交互作用。響應(yīng)面圖中曲面越陡峭說明研究因素之間的交互作用對結(jié)果影響越大，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著，呈圓形則說明交互作用不顯著［27-28］。由圖5 可以看出，6 個響應(yīng)面圖均為開口向下的凸形曲面，同時，等高線最小橢圓的中心在所選的-1～1 范圍內(nèi)，說明響應(yīng)值（枇杷葉總黃酮得率）在4 個因素設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。

由圖5a～c 可以看出，料液比和超聲時間（AB）、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)（AC）、料液比和超聲溫度（AD）的等高線圖呈較圓形，表示AB、AC、AD的交互作用對響應(yīng)值的影響程度較為不顯著（P＞0.05）。由圖5d～f 可以看出，超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)（BC）、超聲時間和超聲溫度（BD）以及超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)（CD）為橢圓形，表明兩因素的交互作用對響應(yīng)值的影響程度較為顯著（P＜0.05）。其中，超聲時間與超聲溫度（BD）的交互作用響應(yīng)面圖最為陡峭，等高線圖呈橢圓形的弧度最大，所以它們的數(shù)值增加或減少對枇杷葉黃酮類化合物的提取影響最大。這與方差分析的結(jié)果相吻合。

圖5 各因素對枇杷葉總黃酮提取率交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

由此，響應(yīng)面法分析得到的枇杷葉中總黃酮提取的最佳工藝條件為：料液比1∶25.86 g/mL、超聲溫度63.6 ℃、超聲時間54.2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)62.4 %，此時枇杷葉中總黃酮的理論提取率達(dá)到了3.74 %。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作的便利性，對響應(yīng)面分析得到的枇杷葉中總黃酮提取的最佳工藝條件稍作調(diào)整，選取料液比1∶26 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)62 %、超聲溫度64 ℃、超聲時間54 min 進(jìn)行枇杷葉總黃酮提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出在實(shí)際條件下始興枇杷葉總黃酮提取率平均值為3.68 %，與理論值（3.74 %）基本一致，相對誤差僅為1.6 %，該值與回歸方程的預(yù)測值較為吻合，表明響應(yīng)面法對枇杷葉總黃酮進(jìn)行提取的研究是合理可行的，具有實(shí)際生產(chǎn)價值。

3 結(jié)語

本研究探討了超聲波輔助乙醇提取始興枇杷葉總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果表明，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度對枇杷葉總黃酮提取率均有顯著影響（P<0.05），影響程度大小為：超聲時間＞超聲溫度＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。超聲輔助乙醇提取始興枇杷葉總黃酮的最佳提取工藝為：超聲溫度64 ℃、超聲時間54 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)62 %、料液比1∶26 g/mL，總黃酮提取率為3.68 %，與預(yù)測值的相對誤差為1.6 %。此工藝條件的確定，不但為綜合開發(fā)利用始興枇杷葉資源提供了科學(xué)依據(jù)，也為后續(xù)枇杷葉黃酮類化合物的富集與純化及作用效果研究奠定了基礎(chǔ)。