組學(xué)技術(shù)在潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用進(jìn)展*

王 磊，沈江立 綜述，李 娜△ 審校

1.呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院肛腸科，內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021099；2.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院肛腸科，陜西咸陽(yáng) 712000

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性、非特異性、炎癥性腸道疾病[1]，通常病變從直腸開始，呈連續(xù)性、彌散性分布，可延伸累及至結(jié)腸近端的不同部位[2]。UC以復(fù)發(fā)交替的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等為典型臨床表現(xiàn)，還可伴有乏力、食欲減退、發(fā)熱等全身癥狀及關(guān)節(jié)病變(中軸型和外周型關(guān)節(jié)病變)、代謝性骨病、凝血功能異常等的腸外表現(xiàn)[1,3]。長(zhǎng)期的炎癥可導(dǎo)致UC癌變及結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的出現(xiàn)[4]。近年來(lái)，UC的發(fā)病率和患病率呈上升趨勢(shì)，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列入國(guó)際難治性疾病和終身性疾病名錄。歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家UC的發(fā)病率為(8～14)/100 000，患病率則高達(dá)(120～200)/100 000；據(jù)報(bào)道，我國(guó)UC患病率約為11.6/100 000，北方地區(qū)發(fā)病率(1.64/100 000)與南方地區(qū)相比(2.05/100 000)略低[5]。UC發(fā)生與遺傳易感性、環(huán)境因素及心理因素等多因素密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制與腸道免疫失衡、神經(jīng)內(nèi)分泌功能、腸黏膜屏障損傷等有關(guān)[6]。

隨著以高通量分析檢測(cè)為特征的組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，涌現(xiàn)出代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀基因組學(xué)、微生物組學(xué)、影像組學(xué)、宏基因組測(cè)序技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)。這些新技術(shù)可在不同層面上反映生物體特征，揭示分子的復(fù)雜性，用于全面了解人類健康與疾病、生理與病理的內(nèi)在關(guān)系，以及藥物作用相關(guān)分子機(jī)制[7]。本文將對(duì)組學(xué)技術(shù)在UC領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀做一綜述。

1 代謝組學(xué)在UC疾病領(lǐng)域研究中的應(yīng)用

1.1代謝組學(xué)在UC的研究現(xiàn)狀 自從NICHOLSON等[8]在1999年首次提出代謝組學(xué)概念以來(lái)，代謝組學(xué)主要通過(guò)核磁共振和質(zhì)譜技術(shù)定性和定量分析目標(biāo)生物體受內(nèi)/外部生理刺激或遺傳基因修飾的內(nèi)源性物質(zhì)-代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的多元?jiǎng)討B(tài)變化參數(shù)，以期尋找與疾病或藥物相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物[9-10]。臨床研究標(biāo)本多為UC患者的血液、尿液或者糞便標(biāo)本，具有標(biāo)本輕松易得、取樣操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。耿曙光等[11]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè)正常大鼠和UC大鼠結(jié)腸病變部位黏膜組織的代謝組學(xué)特征，結(jié)果得到9種差異性代謝產(chǎn)物，其中尿苷、腺嘌呤、胞嘧啶、甘氨酸、乳酸5種代謝物在UC模型組中明顯，?；撬?、蘇氨酸、甘露糖、β-丙氨酸4種代謝物明顯低于對(duì)照組，可作為UC早期臨床診斷的生物標(biāo)志物。DIAB等[12]采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)和超高效液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，檢測(cè)UC患者和健康志愿者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從50條代謝通路中共鑒定出177個(gè)差異代謝產(chǎn)物，其中研究組差異明顯的代謝物是溶血磷脂酰膽堿、酰基肉堿和氨基酸，可導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡。SUN等[13]對(duì)UC患者活動(dòng)期(23例)、非活動(dòng)期(25例)及對(duì)照組(30例)的糞便和血漿標(biāo)本分別進(jìn)行16S rRNA測(cè)序測(cè)序和液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期UC組血漿氧化三甲胺水平明顯高于非活動(dòng)期，鞘脂代謝是富集顯著的通路之一，因此磷酸鞘氨醇可能成為治療UC的新靶點(diǎn)。

1.2代謝組學(xué)在UC治療中的研究發(fā)現(xiàn) 代謝組學(xué)在尋找新的早期疾病診斷、發(fā)病機(jī)制、藥效機(jī)制及預(yù)后生物標(biāo)志物等方面作用顯著。徐霞等[14]通過(guò)超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)健康大鼠組、脾虛濕困型UC模型大鼠(中藥未干預(yù))及脾虛濕困型UC模型大鼠給予參苓白術(shù)藥物干預(yù)的血漿標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散對(duì)脾虛濕困UC組大鼠的治療作用可能為抑制核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路表達(dá)，激活法尼醇X受體(FXR)受體、氧化應(yīng)激和細(xì)胞色素P450表達(dá)，從而下調(diào)促炎因子的表達(dá)，改善緩解腸道病變炎癥狀態(tài)。馬光朝等[15]采用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)正常小鼠組、DSS模型組、雷公藤甲素治療組血清標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UC模型組小鼠和正常組小鼠血清代謝譜發(fā)生明顯改變，鑒定出膽酸、?；悄懰?、鵝去氧膽酸、瓜氨酸、順式烏頭酸、γ-胍丁酸、乙酰膽堿、3,6-脫水半乳糖等15個(gè)差異代謝物，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)初級(jí)膽汁酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝通路有關(guān)。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在UC研究中的進(jìn)展?fàn)顩r

2.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)UC的研究 轉(zhuǎn)錄組廣義上指在某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)物的集合，包括mRNA、ncRNA、rRNA等；狹義上指所有mRNA的集合[16]。主要用于基因測(cè)序、表達(dá)譜分析、治療藥物篩選、疾病診斷和預(yù)測(cè)有效基因篩選等方面。通過(guò)分析表達(dá)基因，進(jìn)一步揭示機(jī)體生理、病理狀態(tài)及疾病的發(fā)生、發(fā)展之間的內(nèi)在聯(lián)系[17]。TAMAN等[18]利用測(cè)序技術(shù)對(duì)UC患者和健康對(duì)照者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果得到1 480個(gè)差異基因，其中MUC5B、REG3A、DEFA5和IL33可能是男性UC患者并發(fā)結(jié)直腸癌(CRC)的危險(xiǎn)因素，AQP9在UC調(diào)控組織特異性生理作用，也揭示了UC發(fā)病機(jī)制中新的潛在因素。王家豐等[19]利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)UC患者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶HMGB1基因chr13-31127905位點(diǎn)突變型等位基因的個(gè)體患UC的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于未攜帶者(P=0.017,OR=0.357,95%CI:0.157～0.812)，有望成為臨床中早期UC診斷篩查生物標(biāo)志物。

2.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)在UC治療中的應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄組學(xué)可快速、全面獲得生物個(gè)體特定條件下全部表達(dá)譜基因轉(zhuǎn)錄信息，符合中醫(yī)研究所注重的整體觀，全面、客觀、科學(xué)、系統(tǒng)地闡述中藥單體及復(fù)方多靶點(diǎn)、多通路復(fù)雜作用的機(jī)制。馬克龍等[20]通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究白念珠菌定植的UC小鼠模型給予三黃湯干預(yù)后療效機(jī)制，結(jié)果顯示三黃湯組與模型組相比，篩選到383個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集于NOD樣受體信號(hào)通路，表明作用機(jī)制可能與調(diào)控NOD樣受體信號(hào)通路密切相關(guān)。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在UC研究中的應(yīng)用

3.1蛋白質(zhì)組學(xué)在UC領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀 蛋白組學(xué)由澳大利亞的WILIKINS等[21]于1994年在意大利國(guó)際會(huì)議上首次提出，是指通過(guò)多種方式全方位多層次研究蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的表達(dá)水平，翻譯后修飾狀態(tài)，蛋白質(zhì)相互作用方式和內(nèi)在聯(lián)系；生理/病理狀態(tài)下表達(dá)差異，以及疾病特定狀態(tài)下生物標(biāo)志物動(dòng)態(tài)變化表達(dá)數(shù)量，從整體水平上探究特定生物體所有蛋白質(zhì)組成、氨基酸序列和調(diào)控規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)研究經(jīng)典核心技術(shù)還是以雙向凝膠電泳、質(zhì)譜MS技術(shù)和蛋白質(zhì)生物信息學(xué)技術(shù)為主。HORIE等[22]通過(guò)雙向凝膠電泳、質(zhì)譜技術(shù)對(duì)活動(dòng)期和非活動(dòng)期UC患者活檢標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩選，發(fā)現(xiàn)與非活動(dòng)期UC患者相比，活動(dòng)期UC患者過(guò)氧化物還原酶1(PRDX1)表達(dá)增加，同時(shí)UC患者黏膜隱窩上皮細(xì)胞中PRDX1和硫氧還蛋白(Trx)的表達(dá)與炎癥分級(jí)呈正相關(guān)。BENNIKE等[23]將UC患者和對(duì)照組經(jīng)內(nèi)鏡取結(jié)腸黏膜非炎癥活檢組織，采用高通量無(wú)凝膠定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活檢組織中鈣衛(wèi)蛋白和乳糖轉(zhuǎn)鐵蛋白與活檢組織炎癥程度相關(guān)。

3.2蛋白質(zhì)組學(xué)在UC治療中的應(yīng)用 通過(guò)分析藥物治療前后蛋白表達(dá)水平的差異，有助于從整體角度全面分析中藥多靶點(diǎn)、多通路、多成分的藥效機(jī)制，符合中醫(yī)整體觀念的基本思想[24]。王婷婷等[25]在空白組、UC模型組、四逆湯治療UC大鼠組中分別采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸組織篩選差異表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示四逆湯組篩選出78個(gè)與UC相關(guān)的差異蛋白，其核心蛋白共篩選出C反應(yīng)蛋白、Ⅻ型膠原蛋白α1(COL12A1)等16個(gè)關(guān)鍵蛋白，通過(guò)驗(yàn)證確定C反應(yīng)蛋白及COL12A1為四逆湯干預(yù)UC的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

4 基因組學(xué)在UC研究中的應(yīng)用

基因組學(xué)以生物體內(nèi)所有基因?yàn)檠芯繉?duì)象，闡述全基因組的結(jié)構(gòu)、組成、存在方式、表達(dá)調(diào)控模式，基因定位與功能分析，基因間相互作用，以及全基因組在生物體生理、病理過(guò)程中的內(nèi)在作用規(guī)律與外部影響機(jī)制。常用研究方法有脈沖場(chǎng)凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、基因芯片技術(shù)、全基因組測(cè)序等。趙芯梅[26]對(duì)UC患者(同一部位反復(fù)活動(dòng)期、靜止期共29例)通過(guò)基因組學(xué)技術(shù)，比較同一患者、同一部位、不同時(shí)期(活動(dòng)期、靜止期和復(fù)發(fā)活動(dòng)期)mRNA表達(dá)差異，結(jié)果得到UC活動(dòng)期、靜止期差異表達(dá)基因1 732個(gè)，其中上調(diào)基因主要與炎癥反應(yīng)、CRC癌基因和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)；下調(diào)基因主要與CRC抑癌基因和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)有關(guān)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，UC活動(dòng)期及靜止期中細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因顯著上調(diào)，細(xì)胞連接相關(guān)基因明顯下調(diào)。

5 表觀遺傳學(xué)在UC研究中的應(yīng)用

表觀遺傳學(xué)是指基因的核苷酸序列未改變，基因功能表達(dá)了可遺傳信息的變化，從而使表型發(fā)生改變。表觀遺傳學(xué)正是通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾、ncRNA調(diào)控等多種調(diào)控基因表達(dá)介導(dǎo)UC易感基因與環(huán)境因素的相互作用，與UC的發(fā)病機(jī)制及疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[27]。李春曉[28]通過(guò)對(duì)UC患者與健康人群結(jié)直腸上皮組織標(biāo)本進(jìn)行IHC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比UC患者結(jié)腸上皮中的組蛋白H3乙?；矫黠@下降，而且與疾病嚴(yán)重程度(蒙特利爾分級(jí))呈明顯負(fù)相關(guān)；通過(guò)構(gòu)建體外細(xì)胞(HCT116、Caco-2細(xì)胞)、TNBS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型均發(fā)現(xiàn)組蛋白H3乙酰化水平在體外細(xì)胞系及體內(nèi)動(dòng)物模型中，較健康小鼠均顯著減少，表明結(jié)直腸炎癥組蛋白H3乙?；绞艿揭种朴嘘P(guān)。

6 腸道菌群檢測(cè)的組學(xué)技術(shù)在UC研究中的應(yīng)用

腸道菌群是宿主胃腸道內(nèi)寄居并與之共生的數(shù)以萬(wàn)計(jì)微生物群體(細(xì)菌、真菌、病毒)的總稱，定植在人體(宿主)腸道內(nèi)的菌群數(shù)量達(dá)1013～1014個(gè)，種類多達(dá)500多種，組成復(fù)雜多樣的微生態(tài)系統(tǒng)，因此也被稱為人類第二基因組。腸道菌群大致分為三類：益生菌(如雙歧桿菌、乳酸菌等)、條件致病菌(如大腸埃希菌、腸球菌、腸桿菌等)和有害菌(如沙門氏菌等)。腸道內(nèi)各種菌群相互依存、相互制約，通過(guò)多種生理功能(屏障功能、免疫功能、代謝與營(yíng)養(yǎng)功能)維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定，保證腸道生理功能正常運(yùn)行。如果腸道菌群處于紊亂狀態(tài)時(shí)(菌群數(shù)量和比例失調(diào)、致病菌增多)，生理功能動(dòng)態(tài)失衡，破壞腸道黏膜屏障，免疫功能紊亂，菌群代謝產(chǎn)物異常，誘發(fā)了UC患者的腸道局部炎癥反應(yīng)[29]。楊龍等[30]通過(guò)采集口服美沙拉嗪對(duì)照組、口服參苓白術(shù)散治療組和健康組志愿者的糞便進(jìn)行DNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組及健康組，參苓白術(shù)散治療組中參苓、白術(shù)較能夠促進(jìn)益生菌(雙歧桿菌、乳桿菌)生長(zhǎng)，抑制致病菌增殖(腸桿菌、腸球菌、梭菌、擬桿菌)，上調(diào)腸道微生物雙歧桿菌與腸桿菌的數(shù)量比例，從而起到抗炎、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腸黏膜潰瘍愈合的作用。梁艷妮等[31]將UC小鼠分為對(duì)照組、模型組、柳氮磺胺吡啶干預(yù)組、靛玉紅干預(yù)組(低、中、高劑量)，通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序檢測(cè)UC小鼠腸道內(nèi)容物，高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)靛玉紅治療UC，可能與恢復(fù)UC小鼠腸道菌群中擬桿菌門與厚壁菌門的比例密切相關(guān)。

7 多組學(xué)聯(lián)合在UC研究中的應(yīng)用

UC發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，單一組學(xué)檢測(cè)技術(shù)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)等)無(wú)法全面系統(tǒng)地揭示UC疾病發(fā)展過(guò)程，而從不同層次描述細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)各個(gè)環(huán)節(jié)的多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用，有助于從多方面、多角度闡述UC發(fā)病機(jī)制，將為研究UC發(fā)生、發(fā)展更為高效的方法[32]。MILLS等[33]通過(guò)對(duì)UC患者糞便標(biāo)本進(jìn)行16S rRNA、宏基因組、代謝組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序，確定擬桿菌蛋白酶是提示疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一。馬琪[34]將白頭翁湯干預(yù)濕熱型UC大鼠，利用代謝組學(xué)技術(shù)(UPLC-Q/TOF-MS/MS)檢測(cè)UC大鼠不同造模階段與空白對(duì)照組的尿液標(biāo)本差異代謝物，篩選白頭翁湯治療濕熱型UC的差異代謝物及靶標(biāo)代謝通路，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選并構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)濕熱型UC的發(fā)病機(jī)制可能與5-羥基-N-甲?；虬彼?、γ-L-谷氨酰胺-L-半胱氨酸、左旋甲酰犬尿氨酸、亞油酸、核黃素-5-磷酸和左旋色氨酸等7種潛在差異代謝物水平變化有關(guān)；白頭翁湯治療濕熱型UC的機(jī)制可能與7-酮基去氧膽酸、五羥色胺和創(chuàng)傷酸水平變化有關(guān)。

綜上所述，UC病因與發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜、多不明確，仍是眾多學(xué)者研究熱點(diǎn)，代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)和腸道菌群檢測(cè)等組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，多組學(xué)整合分析技術(shù)，有望在UC發(fā)病機(jī)制的研究、疾病的診斷及治療、新藥物的研發(fā)、診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等方面提供新的切入點(diǎn)及方向，為UC患者特異性、個(gè)性化診療提供新思路。