納米二氧化鈦對圓形盤腸溞的急性毒性研究

孔昊，陳杰，王佳琪，張琦，劉嘉慧，張亮

（南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇泰州 225300）

納米材料是指通過在納米尺度內(nèi)操縱單個分子、原子或分子團，使物質(zhì)成分重新排列組合后制造出的新型物質(zhì)材料。其中，納米二氧化鈦是目前國內(nèi)產(chǎn)量最高、需求量最大、應(yīng)用最多的納米材料[1]。納米二氧化鈦應(yīng)用范圍十分廣泛，如在日用品、醫(yī)藥用品、生物生長等領(lǐng)域[2]。但同時納米二氧化鈦的廣泛應(yīng)用也導(dǎo)致了其在水環(huán)境中大量釋放，對環(huán)境和公眾健康都有潛在的安全隱患[3]。納米材料在生產(chǎn)和使用過程中可直接或間接通過環(huán)境、食物鏈進入人體，因而我們必須關(guān)注其可能存在的安全性問題[4-6]。

ZHU等[7]的研究表明，單獨暴露于2 mg/L納米二氧化鈦或2μg/L三丁基錫不會影響鮑魚（Haliotisrubra）的孵化或畸形率，而聯(lián)合作用卻顯著影響鮑魚的孵化率和變形率，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。ZHENG等[8]的研究表明，納米二氧化鈦對斑馬魚幾乎無毒性效應(yīng)，但能夠抑制凱倫藻（Karenia brevis）和骨條藻（Skeletonemacosta?tum）的生長。文若曦等[9]的研究表明，100 nm納米二氧化鈦對水藻（Desmodesmussubspicatus）的生長無明顯毒性，而25 nm納米二氧化鈦對水藻生長的EC50為44 mg/L。FAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦對藍藻（Cyanobac?teria）的葉綠素含量、光合速率、呼吸速率、SOD活性以及超氧陰離子含量均產(chǎn)生一定的影響。

目前，已有的研究多集中于納米材料對藻類、魚類、植物等的毒性效應(yīng)，而關(guān)于納米材料對小型甲殼動物的研究非常少，尤其是納米二氧化鈦對圓形盤腸溞的相關(guān)研究未見報道[11-13]。由于圓形盤腸溞對生存水環(huán)境質(zhì)量要求較高，可通過測定其存活率與活躍程度間接反映環(huán)境污染物對水環(huán)境的污染情況。本研究以圓形盤腸溞為試驗對象，研究納米二氧化鈦對其急性毒性和理化性質(zhì)的影響。旨在為納米二氧化鈦的合理使用及其風(fēng)險控制提供重要參考和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

納米級二氧化鈦，分子量79.87，粒徑Ф20 nm，Tita?nium oxide；圓形盤腸溞，上海沁森生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 納米二氧化鈦脅迫下對圓形盤腸溞生存的影響

選取大小均勻一致的圓形盤腸溞，試驗前24 h換自來水并不再喂食。配制相同體積、不同濃度的二氧化鈦溶液后放超聲波溶解儀里，使其均勻分布。取18個大小規(guī)格一樣的玻璃瓶，提前洗凈并瀝干，每瓶放置20只大小均勻的圓形盤腸溞，分別倒入濃度為0 mg/L（對照組1）、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的納米二氧化鈦溶液，每種濃度設(shè)置3組重復(fù)試驗，放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25℃，光照周期24 h。把圓形盤腸溞在瓶中停止運動作為死亡標(biāo)準(zhǔn)，每12 h記錄一次圓形盤腸溞的存活數(shù)和死亡數(shù)。

1.2.2 納米二氧化鈦濃度對圓形盤腸溞理化性質(zhì)的影響

根據(jù)1.2.1確定2 mg/L作為急性毒性的試驗濃度，選擇運動活躍且大小均勻的圓形盤腸溞，用清水養(yǎng)殖且24 h內(nèi)不再喂食。用吸管分別吸取50只，加入到濃度為4 mg/L、3 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0 mg/L（對照組2）的納米二氧化鈦溶液中，每瓶培養(yǎng)液體積為100 mL，每個濃度設(shè)置3組重復(fù)。在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在12 h、24 h、48 h測量圓形盤腸溞的相關(guān)理化指標(biāo)。

1.3 測定項目與方法

在培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，取適量圓形盤腸溞，加入磷酸緩沖液碾碎，定容10 mL，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[14]；分別采用氯化硝基四氮唑藍光化學(xué)還原反應(yīng)法和愈創(chuàng)木酚法測定超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，采用SPSS19.0進行不同處理間顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化鈦脅迫下對圓形盤腸溞生存的影響

由圖1可知，不同濃度納米二氧化鈦溶液對圓形盤腸溞有不同程度的抑制影響。隨著納米二氧化鈦濃度的增加，圓形盤腸溞的死亡率呈現(xiàn)升高的趨勢。用一元線性回歸方程法求得24 h的EC50值為在納米二氧化鈦溶液濃度為2 mg/L時。

圖1 24 h時不同濃度二氧化鈦對圓形盤腸溞生存特性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of titanium dioxide on the survival characteristics of Chydorussphaericus at 24 h

2.2 納米二氧化鈦對圓形盤腸溞SOD活性的影響

由圖2可見，不同濃度的納米二氧化鈦處理對SOD活性的影響不同。在12 h、48 h時，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，SOD活性呈現(xiàn)出下降的趨勢；而在24 h時，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，SOD活性出現(xiàn)“先升后降”的變化，且在1 mg/L時SOD活性達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了133.82%。當(dāng)納米二氧化鈦濃度大于3 mg/L時，圓形盤腸溞的SOD活性顯著下降（與0 mg/L的納米二氧化鈦處理相比）。

圖2 納米TiO2對圓形盤腸溞SOD活性的影響Fig.2 Effect of nano titanium dioxide on SOD activity of Chydorussphaericus

2.3 納米二氧化鈦對圓形盤腸溞POD活性的影響

由圖3可見，不同濃度的納米二氧化鈦對圓形盤腸溞POD活性的影響不同。在12 h、48 h時，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，POD活性呈現(xiàn)出下降的趨勢；在24 h時，POD活性隨著納米二氧化鈦濃度的升高呈現(xiàn)出“先升后降”的趨勢，且在1 mg/L時POD活性達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了23.38%。當(dāng)納米二氧化鈦濃度大于2 mg/L時，圓形盤腸溞的POD活性顯著下降（與0 mg/L的納米二氧化鈦處理相比）。

圖3 納米TiO2對圓形盤腸溞POD活性的影響Fig.3 Effect of nano titanium dioxide on POD activity of Chydorussphaericus

2.4 納米二氧化鈦對圓形盤腸溞MDA含量的影響

由圖4可見，不同濃度的納米二氧化鈦對圓形盤腸溞MDA含量的影響不同。隨著納米二氧化鈦濃度的升高，在12 h時，圓形盤腸溞的MDA含量隨著納米級二氧化鈦濃度的升高呈現(xiàn)“先升后降”的趨勢，在2 mg/L時達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了48.71%；在24 h時，圓形盤腸溞的MDA含量隨著納米級二氧化鈦濃度的升高呈現(xiàn)出上升的趨勢，在4 mg/L時達到最高，比0 mg/L的納米二氧化鈦處理提高了163.15%；在48 h時，圓形盤腸溞的MDA含量在各濃度納米級二氧化鈦條件下無顯著差異。

圖4 納米TiO2對圓形盤腸溞MDA含量的影響Fig.4 Effect of nano titanium dioxide on MDA content of Chydorussphaericus

3 討論

本研究顯示，納米二氧化鈦對圓形盤腸溞的急性毒性為2 mg/L（24 h EC50）。前人研究也多證實納米二氧化鈦對藻類生長具有一定的毒性。朱小山等[15]的研究表明，納米二氧化鈦對斜生柵列藻96 h EC50為15.26 mg/L。也有研究表明，納米二氧化鈦對萊茵衣藻和小球藻生長均有抑制作用，但抑制機理不同。納米二氧化鈦對大型溞的急性毒性試驗顯示48 h EC50為1.26 mg/L，毒性級別為中毒[3]。ZHU等[7]的研究表明，納米二氧化鈦對大型溞有急性和慢性毒性作用，發(fā)現(xiàn)48 h時表現(xiàn)出較低的毒性。圓形盤腸溞作為水環(huán)境中的微生物，對水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著非常重要的作用，納米二氧化鈦對其的毒害作用將影響整個水生生態(tài)系統(tǒng)平衡。

SOD是需氧生物體內(nèi)一種含不同金屬元素的酶蛋白，是唯一可以消耗超氧化物自由基的酶，是已知酶中催化速率較快的酶之一。POD廣泛存在于植物體中，與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其產(chǎn)生的量與氧自由基的量及脂質(zhì)過氧化的程度呈正相關(guān)。李艷娟等[24]的研究表明，各濃度納米二氧化鈦處理都能夠顯著提高杉木幼苗SOD和POD活性，降低MDA的含量。楊濤等[25]的研究表明，納米鐵處理顯著提高了貝母葉片POD活性，降低了MDA含量，但對SOD無顯著影響。侯東穎等[26]的研究表明，藻細胞的SOD活性隨暴露于納米二氧化鈦濃度升高而逐漸降低，且在高濃度（100 mg/L）納米TiO2作用96 h后，其活性降到最低。

本試驗表明，隨著納米二氧化鈦濃度的升高，SOD和POD活性都呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，MDA含量呈現(xiàn)出上升趨勢。同時，在12 h 2 mg/L的納米二氧化鈦濃度時，圓形盤腸溞SOD活性、POD活性達到最大，同時MDA含量最高。濃度上升到4 mg/L的納米二氧化鈦濃度時，圓形盤腸溞的SOD活性、POD活性和MDA含量呈現(xiàn)些許下降。可能隨著納米二氧化鈦濃度的增大，活性氧清除系統(tǒng)功能逐漸降低，活性氧積累越來越多，發(fā)生膜質(zhì)過氧化并發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。總體來說，低濃度的納米二氧化鈦促使溞體POD和SOD活性升高，以保護溞體免受外來刺激和損傷。然而，納米二氧化鈦濃度過高時，就會超出了溞體清除活性氧游離基的能力，導(dǎo)致SOD和POD活性降低。MDA是生物體內(nèi)重要的膜脂過氧化指標(biāo)，濃度越高的納米二氧化鈦對MDA的損傷程度越大。