人乳與牛乳N-鏈寡糖組對小鼠腸道菌群的影響

郭晶宇，陳亞然，毛慧敏，王 婷，Josef VOGLMEIR，劉 麗*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

乳是嬰幼兒生長發(fā)育的理想食品，其含有各種可供嬰幼兒生長發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性因子[1]。除了提供基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)外，乳的攝入還有助于嬰兒腸道菌群的定植，減少腸道病原體感染和促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的發(fā)育等，這主要與乳中的寡糖成分相關(guān)[2-4]。寡糖是乳中繼乳糖和脂質(zhì)之后的第三大固體營養(yǎng)成分[5]。與乳糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等不同，寡糖不易被機(jī)體消化系統(tǒng)消化降解，可直接進(jìn)入大腸[6]。許多研究表明，寡糖可作為碳源被腸道微生物利用，進(jìn)而影響腸道菌群的組成和代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）的產(chǎn)生，具有潛在的益生作用[7-8]。然而大多數(shù)的研究都集中在乳游離寡糖上，與乳中結(jié)合寡糖相關(guān)的研究較少。

結(jié)合寡糖一般通過糖苷鍵與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價(jià)連接形成糖綴合物，主要分為N-鏈寡糖和O-鏈寡糖，其中研究較廣泛的是N-鏈寡糖。N-鏈寡糖具有統(tǒng)一的核心五糖結(jié)構(gòu)，由2 個(gè)乙酰氨基葡萄糖和3 個(gè)甘露糖組成。N-鏈寡糖可作為某些特定微生物生長的底物，如雙歧桿菌[9-10]、擬桿菌屬[11]及糞腸球菌屬[12]等。這些微生物能夠分泌特異性糖苷酶將N-鏈寡糖從糖蛋白中釋放，并作為碳源或者唯一碳源被微生物自身利用。此外，不同類型的N-鏈寡糖所具有的功能也不相同。巖藻糖基化的N-鏈寡糖可通過與金黃色葡萄球菌、李斯特菌、沙門氏菌等腸道致病菌競爭，從而影響致病菌對腸道上皮細(xì)胞的黏附[13-15]。另外，唾液酸化的N-鏈寡糖也可抵抗致病性大腸桿菌與腸道上皮細(xì)胞的黏附，從而避免炎癥的發(fā)生[16]。

牛乳配方奶粉通常被用作人乳的替代品。本課題組前期的研究已發(fā)現(xiàn)人乳N-鏈寡糖組（human milkN-glycome，HMN）與牛乳N-鏈寡糖組（bovine milkN-glycome，BMN）的含量與組成不同，人乳中鑒定到43 種N-鏈寡糖，而牛乳中鑒定到80 種，其中共有結(jié)構(gòu)為28 種[17]。HMN中唾液酸化與巖藻糖基化的N-鏈寡糖各占46%和29%，BMN中則各占36%與39%[18]。因此，HMN與BMN在結(jié)構(gòu)與組成上的差異，可能對機(jī)體腸道微生物的定植與發(fā)展產(chǎn)生不同的影響。

本實(shí)驗(yàn)以HMN與BMN為底物，通過體外實(shí)驗(yàn)研究腸道微生物對HMN與BMN的降解利用；同時(shí)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究HMN與BMN的攝入對鼠腸道菌群的構(gòu)成及其代謝產(chǎn)物SCFAs的影響，并將兩者進(jìn)行比較，旨在進(jìn)一步分析人乳與牛乳之間由于N-鏈寡糖帶來的功能上的差異，為未來嬰兒配方食品和功能性乳制品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6J型4 周齡雄性小鼠（SPF級，平均體質(zhì)量（19±1）g）購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005，使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0007。

人乳取自江蘇省南京市28～32 周歲健康女性產(chǎn)后乳；牛乳 南京西崗果牧廠；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、三氟乙酸（trifluoroacetate，TFA）、2-氨基苯甲酸胺（2-aminobenzamide，2AB） 天津希恩生化科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國默克公司；乙酸、丙酸、丁酸、2-乙基丁酸、2,5-二羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）和氨水 上海阿拉丁試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）等其他試劑國藥集團(tuán)化學(xué)試劑品有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera超高壓液相色譜儀（配有SIL-30AC自動進(jìn)樣器、LC-30AD泵、RF-20Axs熒光檢測器和LC-solution工作站） 日本島津公司；BEH Glycan column色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；6890N氣相色譜儀 美國Agilent公司；真空離心濃縮干燥機(jī)LNG-T83B 太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LGJ-12型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海今邁儀器儀表公司；Multiscan FC 35型酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人乳與牛乳N-鏈寡糖組的制備

參考本課題組前期研究中的方法[17]制備HMN與BMN，具體如下。

1.3.1.1N-鏈寡糖的酶解釋放

首先將1 L人乳與牛乳樣品分別離心30 min（4 500 r/min、4 ℃），除去上層脂肪。再將樣品分別與等體積的40%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）TCA混合，離心30 min（4 500 r/min、4 ℃）得到蛋白沉淀并水洗至中性。然后加入150 mL 6 mol/L尿素充分溶解蛋白，依次加入115 mL 0.50 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）和62.5 mL的蛋白變性劑（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SDS、體積分?jǐn)?shù)7%β-巰基乙醇），置于100 ℃水浴鍋中熱變性30 min。待冷卻后，加入150 mL PNGase F酶液、95 mL 10%的Triton-100溶液及560 mL的超純水，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，將整個(gè)反應(yīng)體系與活化好的碳粉充分?jǐn)嚢杌靹颍缓笥?0%乙腈和40%乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并凍干濃縮。最后使用聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P2柱進(jìn)行脫鹽和純化處理，洗脫液為體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸溶液，收集洗脫下來的N-鏈寡糖。

1.3.1.2N-鏈寡糖的測定

參考文獻(xiàn)[17]取少量純化后的N-鏈寡糖旋轉(zhuǎn)蒸干，加入2AB，于65 ℃下標(biāo)記反應(yīng)4 h，然后利用超高壓液相色譜進(jìn)行檢測分析。

1.3.2 動物飼養(yǎng)與樣品采集

動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會批準(zhǔn)。21 只實(shí)驗(yàn)小鼠喂養(yǎng)在12 h光照、12 h黑暗、溫度（21.0±1.0）℃、相對濕度（60±10）%的SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心。經(jīng)7 d的適應(yīng)性飼喂后，清晨收集小鼠的新鮮糞便用于腸道微生物的體外培養(yǎng)。然后將21 只小鼠隨機(jī)平均分為3 組，分別為對照組、HMN組和BMN組，每籠放置3～4 只。對照組每只小鼠灌胃200 μL/d無菌水，HMN組每只小鼠灌胃200 μL/d HMN溶液（總物質(zhì)的量為70 nmol），BMN組每只小鼠灌胃200 μL/d BMN溶液（總物質(zhì)的量為70 nmol），自由采食和飲水。灌胃21 d后，每組隨機(jī)選取5 只小鼠，收集清晨新鮮的小鼠糞便，用于總DNA的提取和腸道菌群的檢測，同時(shí)收集盲腸內(nèi)容物，并于-80 ℃保存[19]。

1.3.3 腸道微生物的體外培養(yǎng)

1.3.3.1 厭氧培養(yǎng)基的制備

參照李春保等[20]實(shí)驗(yàn)方法并稍加修改。參考文獻(xiàn)[20]配制微量礦物元素溶液、脂肪酸溶液、氯高鐵血紅素溶液、維生素溶液；取0.3 g KCl、0.3 g NaCl、0.1 g CaCl2·2H2O、0.25 g MgSO4·7H2O、0.25 g胰蛋白胨、0.25 g NH4Cl、0.34 g KH2PO4、0.125 g酵母提取物、2 g Na2CO3、0.5 mL刃天青（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）、5 mL微量元素溶液、5 mL脂肪酸溶液和5 mL氯高血紅素溶液混合，用去離子水溶解后定容至500 mL，配制培養(yǎng)基。培養(yǎng)基微波加熱約15 min，待呈現(xiàn)粉紅色后向培養(yǎng)基中通入CO2至培養(yǎng)基澄清，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽（終質(zhì)量濃度1 g/L）然后繼續(xù)通入CO2至培養(yǎng)基澄清，最后每管分裝9 mL培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后按體積分?jǐn)?shù)1%將維生素溶液（經(jīng)0.22 μm濾膜除菌）加入培養(yǎng)基中備用。

1.3.3.2 體外培養(yǎng)腸道微生物

向灌胃前收集的新鮮糞便中加入0.01 mol/L、pH 7.4的脫氧磷酸鹽緩沖液（1∶10，m/V），混勻后低速離心除去不溶的糞便顆粒，制備菌液。分別取1 mL菌液添加到含有HMN、BMN（總物質(zhì)的量為700 nmol）的9 mL厭氧培養(yǎng)基中，對照組中加入等體積的脫氧磷酸鹽緩沖液，每組5 個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，并在0、6、12、24 h分別取樣分析HMN與BMN的變化。

1.3.4 鼠糞便菌群中糖苷酶活力的測定

糖苷酶活力的測定參考文獻(xiàn)[21]并稍作修改。取1 mL 1.3.3.2節(jié)中制備的菌液，8 000 r/min離心5 min，上清液用于胞外糖苷酶活性的測定，沉淀物洗去殘留培養(yǎng)基后，用1 mL Lysis buffer重懸，加入10 μL 100 mmol/L苯甲基磺酰氟，超聲破碎5 min，離心（12 000 r/min、5 min）取上清液用于胞內(nèi)糖苷酶活力的測定。以1 μL 10 mmol/L的對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，pNP-β-Gal）、對硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷（p-nitrophenylacetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside，pNP-β-GlcNAc）、對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷（p-nitrophenylα-L-fucopyranoside，pNP-α-Fuc）與對硝基苯基-α-D-吡喃-甘露糖苷（p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside，pNP-α-Man）分別作為底物，加入9 μL的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4）后，再分別加入20 μL具有糖苷酶的上清液，混勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃滅活5 min并離心（12 000 r/min、10 min）取上清液。用酶標(biāo)儀檢測樣品在405 nm波長處的吸光度以表征糖苷酶活力，對照組（Control）為與底物等體積的磷酸鹽緩沖液。

1.3.5 SCFAs含量的測定

取1.3.2節(jié)收集的小鼠盲腸內(nèi)容物100 mg左右，按1∶5（m/V）的比例溶于水中，然后與等體積的2-乙基丁酸（25 mmol/L，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）混合，8 000 r/min離心5 min，取上清液與草酸溶液（0.15 mol/L）等體積混合均勻并再次離心（8 000 r/min、5 min），取上清液過0.45 μm濾膜后采用氣相色譜檢測乙酸、丙酸、丁酸的含量。SCFAs的氣相色譜檢測條件[22]： 6890N氣相色譜工作站；HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；火焰離子化檢測器；載氣為高純度的氮?dú)猓?9.0 mL/min）；柱溫以10 ℃/min的升溫速率從100 ℃升至180 ℃，并在180 ℃下保持4 min。

1.3.6 16 S rDNA高通量測序

按照E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒說明書提取小鼠糞便微生物的總DNA。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究采用16S rRNA V4～V5區(qū)引物515F（上游引物）5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG)-3’和907R（下游引物）5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Qubit?3.0對純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行精準(zhǔn)定量，然后將帶有不同標(biāo)簽序列的24 個(gè)擴(kuò)增子樣本等量混合?；旌虾蟮腄NA產(chǎn)物參照Illumina基因組測序文庫構(gòu)建流程構(gòu)建Illumina雙端測序的PE文庫。該擴(kuò)增子文庫參照標(biāo)準(zhǔn)流程采用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行PE250模式測序，建庫測序工作由上海凌恩生物科技有限公司承擔(dān)。使用UCHIME軟件鑒定并移除嵌合序列，采用UPARSE 7.1軟件（http://drive5.com/uparse/）將相似性達(dá)97%的序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。采用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）貝葉斯算法對OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，比對Silva數(shù)據(jù)庫，置信度閾值為0.7，最終獲得每個(gè)OTU在各個(gè)分類學(xué)水平上的物種信息，并由此統(tǒng)計(jì)各個(gè)分類水平上各樣本的微生物群落構(gòu)成[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey檢驗(yàn)判定差異顯著性，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠糞便菌群的糖苷酶活性

以pNP-β-Gal、pNP-β-GlcNAc、pNP-α-Fuc、pNP-α-Man作為底物，通過測定吸光度分析糞便菌群中相應(yīng)幾種糖苷酶的活性。綜合圖1A和圖1B中結(jié)果可看出，小鼠糞便菌群具β-有半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶以及α-巖藻糖苷酶活性，且β-半乳糖苷酶活性＞β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性＞α-巖藻糖苷酶活性。該結(jié)果表明，小鼠腸道菌群具有降解N-鏈寡糖的能力，可以將暴露的末端單糖釋放下來作為碳源進(jìn)行利用，且對末端是半乳糖和乙酰氨基葡萄糖的N-鏈寡糖利用效率更高。

圖1 小鼠腸道菌群胞內(nèi)（A）與胞外（B）糖苷酶活力Fig.1 Intracellular (A) and extracellular (B) glycosidase activities of mouse intestinal flora

2.2 HMN與BMN在體外發(fā)酵過程中的變化

以HMN與BMN分別作為底物對小鼠糞便菌群進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別在0、6、12、24 h取樣，使用超高壓液相色譜對HMN和BMN進(jìn)行分析。從圖2可以看出，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，HMN與BMN的液相峰圖譜均發(fā)生明顯變化，峰的數(shù)目和高度逐漸降低。HMN組在12 h時(shí)還殘留有少數(shù)較低的峰（圖2A），而BMN組在12 h時(shí)寡糖峰完全消失（圖2B）。上述結(jié)果表明，在體外厭氧培養(yǎng)條件下，HMN與BMN均可被小鼠糞便菌群逐漸降解利用。

圖2 HMN（A）與BMN（B）在體外發(fā)酵過程中的變化Fig.2 Changes in HMN (A) and BMN (B) during fermentation in vitro

2.3 HMN與BMN對小鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs含量的影響

SCFAs是腸道末端發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物之一，主要由乙酸、丙酸和丁酸等組成，對機(jī)體的健康具有重要的積極影響。如圖3所示，與對照組相比，HMN處理組的乙酸含量顯著增加（P＜0.05），BMN處理組的乙酸含量雖較對照組增加，但并不顯著（P＞0.05）；而HMN與BMN處理組的丙酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。與丙酸和乙酸變化不同的是，經(jīng)過HMN與BMN處理后，HMN組丁酸的含量與對照組的差異并不顯著（P＞0.05），而BMN處理后的丁酸含量顯著低于對照組（P＜0.05）。對于總SCFAs含量，經(jīng)過HMN處理后的實(shí)驗(yàn)組其含量顯著高于對照組（P＜0.05），而BMN處理組與對照組的總SCFAs的差異并不顯著（P＞0.05）。

圖3 HMN與BMN對小鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs含量的影響Fig.3 Effects of HMN and BMN on the contents of SCFAs in cecal contents of mice

2.4 HMN與BMN對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 物種多樣性分析結(jié)果

通過16S rDNA高通量測序研究了不同處理?xiàng)l件下鼠腸道菌群的變化。所有樣本序列在97%的相似水平下進(jìn)行OTU分析，計(jì)算多樣性指數(shù)。稀釋性曲線顯示，隨著測序量的增加，樣本物種的豐度也在增加，測序深度也在增加（圖4A）。由圖4B可知，3組處理組的Shannon曲線均逐漸趨于平緩且達(dá)到平衡，表明樣品的測序深度已足夠反映樣本中絕大多數(shù)微生物的組成。

圖4 稀釋性曲線（A）和Shannon-Winner曲線（B）Fig.4 Rarefaction curves (A) and Shannon-Winner curves (B)

Alpha多樣性常用來反映樣本內(nèi)多樣性，評估指標(biāo)包括Chao、Shannon和Simpson指數(shù)等。Chao指數(shù)與微生物菌群的豐度有關(guān)，Chao指數(shù)越大則豐度越高。Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)常用于反映菌群多樣性，Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)與樣品中的群落多樣性成反比。根據(jù)表1可知，與對照組相比，HMN與BMN處理后的小鼠腸道微生物的Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)等均顯著低于對照組，這說明處理組的樣品的Alpha多樣性顯著降低（P＜0.05）。從Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)可知，BMN處理組的樣品中的菌群多樣性顯著高于HMN處理組（P＜0.05），這可能與腸道中的某些微生物對BMN或HMN的利用有關(guān)。

表1 小鼠腸道菌群Alpha多樣性Table 1 Alpha diversity of intestinal flora in mice

Beta多樣性主要反映微生物群落的構(gòu)成，用來評估不同樣品對微生物群落組成的影響。由圖5可知，HMN與BMN處理組的腸道菌群組成比二者分別與對照組（Control）相比更相似。圖6為糞便微生物主成分分析的結(jié)果，主成分分析是在不同處理組樣本相似度為97%的前提下，對OTU組成進(jìn)行分析來反映樣本間的差異和距離，樣本組成相似度越高的在主成分分析圖中的距離越近。由圖6可知，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為50.8%和22.8%。對照組（Control）、HMN組和BMN組的各個(gè)樣本較集中，說明其組內(nèi)差異較小。從整體來看，3 組樣本的位置較遠(yuǎn)，表明對照組、HMN組和BMN組的組間差距明顯，可以將3 組區(qū)分開來。綜上，HMN和BMN的攝入可以影響小鼠糞便微生物的組成。

圖5 不同處理組小鼠糞便微生物的聚類樹分析Fig.5 Dendrogram from cluster analysis of fecal microorganisms in mice from different treatment groups

圖6 不同處理組小鼠糞便微生物主成分分析Fig.6 Principal component analysis of mouse fecal microorganisms from different treatment groups

2.4.2 物種組成分析結(jié)果

如圖7所示，從門水平上可看出，對照組、HMN組和BMN組的優(yōu)勢菌均以擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為主，對照組的擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門分別占79.14%、13.95%和6.04%，HMN組分別占60.86%、32.87%和5.87%，而BMN組分別占82.48%、15.23%和1.2%。與對照組和BMN組相比，HMN的攝入降低了小鼠腸道中擬桿菌門的相對豐度，增加了厚壁菌門的相對豐度，而與對照組和HMN組相比，BMN的攝入則降低了小鼠腸道中變形菌門的相對豐度。這說明了HMN與BMN的攝入可以在門水平上影響腸道菌群的構(gòu)成，且兩處理組之間在門水平上也存在差異。

圖7 不同處理組小鼠糞便微生物區(qū)系在門水平上的比較Fig.7 Comparison of fecal microflora in mice from different groups at the phylum level

如圖8所示，從屬水平來看，HMN與BMN干預(yù)前后的腸道菌群發(fā)生了明顯的變化。對照組中的主要菌群為Muribaculaceae_norank（65.91%）、擬桿菌屬（Bacteroides）（6.76%）、副鞭毛菌屬（Parasutterella）（4.84%）、Erysipelotrichaceae_Unclassified（2.26%）、鏈桿菌屬（Catenibacterium）（1%）；HMN處理組的主要菌群為擬桿菌屬（Bacteroides）（59.66%）、Erysipelotrichaceae_Unclassified（12.8%）、毛霉菌屬（Erysipelatoclostridium）（6.27%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（2.3%）、糞腸球菌屬（Enterococcus）（2.85%）、大腸埃希氏菌屬（Escherichia）（5.35%）；BMN處理組的主要菌群為Muribaculaceae_norank（33.04%）、擬桿菌屬（Bacteroides）（49.3%）、毛霉菌屬（4.7%）、糞腸球菌屬（3.23%）、阿克曼菌屬（Akkermansia）（1.05%）。與對照組相比，HMN與BMN處理組的Muribaculaceae_norank與副鞭毛菌屬的相對豐度均降低，擬桿菌屬及糞腸球菌屬的相對豐度均升高，而HMN與BMN之間的擬桿菌屬與糞腸球菌屬相對豐度差異不明顯。此外，HMN組的乳桿菌屬、Erysipelotrichaceae_Unclassified與大腸埃希氏菌屬的相對豐度高于對照組和BMN組，而BMN組的阿克曼菌屬的相對豐度高于對照組與HMN處理組。

圖8 不同處理組小鼠糞便微生物區(qū)系在屬水平上的比較Fig.8 Comparison of fecal microflora in mice from different groups at the genus level

2.4.3 差異性分析結(jié)果

線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）常用來反映不同處理組的腸道菌群在不同分類水平上的差異。結(jié)果如圖9所示，藍(lán)色、紅色與綠色分別表示HMN、BMN組和對照組小鼠糞便菌群中影響組間差異性的優(yōu)勢菌種。在門水平上，HMN處理組的優(yōu)勢物種為Firmicutes和Epsilonbacteraeota，BMN處理組的優(yōu)勢物種為Bacteroidetes和Verrucomicrobia，而對照組的優(yōu)勢物種為Actinobacteria。從其他水平分析，對照組綱水平的優(yōu)勢物種為Betaproteobacteriales，目水平為Clostridiales，科水平為Muribaculaceae、Tannerellaceae、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae與Burkholderiaceae等；而BMN組綱水平的優(yōu)勢物種為Bacteroidia、Verrucomicrobiae與Alphaproteobacteria，目水平為Bacteroidales、Rhizobiales與Verrucomicrobiales，科水平為Akkermansiaceae；HMN組綱水平的優(yōu)勢物種為Bacilli和Erysipelotrichia，目水平為Lactobacillales、Enterobacteriales、Campylobacterales與Erysipelotrichales，科水平為Bacteroidaceae、Helicobacteraceae、Campylobacteria、Enterobacteriacea、Enterococcacea和Erysipelotrichaceae等。

圖9 各組間菌群差異分析結(jié)果Fig.9 Analysis of differences in intestinal flora between groups

3 討 論

人體內(nèi)的腸道微生物菌群自胎兒期便開始建立[23]。與成人相比，新生兒的腸道菌群并不穩(wěn)定，容易受到喂養(yǎng)方式等因素的影響[24]。研究表明，牛乳配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群與人乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群之間存在一定的差異[25]，乳中難消化性的寡糖被認(rèn)為是造成這一差異的主要因素之一[26-27]。Midtvedt等[28]研究證明了糞便微生物會產(chǎn)生多種不同類型的糖苷酶，這些糖苷酶可降解各種類型的聚糖。N-鏈寡糖一般由半乳糖、巖藻糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖以及唾液酸組成。本研究對鼠糞便菌群中與N-鏈寡糖相關(guān)的幾種糖苷酶活力進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)其具有β-半乳糖、β-N-乙酰氨基葡萄糖以及α-巖藻糖苷酶等糖苷酶活性，然后以HMN和BMN為底物在體外進(jìn)行了糞便菌群的厭氧發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)糞便菌群可以利用HMN與BMN。因此推測出HMN與BMN能夠被腸道微生物利用，原因可能與腸道菌群中的糖苷酶有關(guān)。

通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究HMN與BMN攝入對鼠糞便微生物組成以及代謝產(chǎn)物SCFAs的影響。從門水平來看，對照組、HMN以及BMN處理組的優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門等，這與Ke Jin等[29]研究得到的鼠腸道中優(yōu)勢菌門的結(jié)果一致。與對照組和BMN處理組相比，HMN的攝入提高了厚壁菌門的相對豐度，且降低了擬桿菌門的相對豐度。厚壁菌門與擬桿菌門是腸道菌群中利用一系列難消化降解的聚糖的優(yōu)勢菌門，擬桿菌門通?？蓞⑴c各種類型的聚糖代謝，厚壁菌門則參與特定聚糖的代謝[30]。二者相對豐度的變化不同可能與其對N-鏈寡糖利用方式不同有關(guān)。然而，相較于對照組和HMN組，BMN的攝入降低了變形菌門的相對豐度。變形菌門[31]包括沙門氏菌和霍亂弧菌等一系列病原菌，這些病原菌可能會引起腸道微生物菌群紊亂并影響宿主的健康，所以較低的變形菌門相對豐度對于機(jī)體腸道健康是有利的。

在屬水平上，與對照組相比，攝入HMN或者BMN后，鼠腸道菌群中的擬桿菌屬與糞腸球菌屬均增加，且擬桿菌屬取代Muribaculaceae_norank成為鼠腸道中的最優(yōu)勢菌屬。Mu Chunlong等[16]通過研究豬乳中N-鏈寡糖對其后代腸道微生物的影響，也發(fā)現(xiàn)了N-鏈寡糖攝入顯著提高了仔豬腸道菌群中的擬桿菌屬的豐度，但其研究中沒有排除乳中游離寡糖的影響，本研究則通過除去游離寡糖的N-鏈寡糖證明了其結(jié)論。除了促進(jìn)擬桿菌屬的生長外，HMN與BMN的攝入還可促進(jìn)鼠腸道中不同有益菌屬的生長。HMN處理組中的優(yōu)勢有益菌屬為乳桿菌屬，而BMN處理組則為阿克曼菌屬。乳桿菌屬作為一種常見的有益菌，可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的生長，而阿克曼菌屬具有緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制腸道炎癥等功能[32]。此外，HMN組中乙酸與丙酸的含量相較于對照組與BMN組顯著增加，這可能與該菌群中擬桿菌屬相對豐度的增加有關(guān)。擬桿菌屬是腸道中主要的產(chǎn)生SCFAs的屬，主要產(chǎn)生乙酸和丙酸代謝產(chǎn)物[33]。HMN與BMN處理組丁酸含量降低可能是腸道中產(chǎn)丁酸菌與產(chǎn)乙酸和丙酸菌如擬桿菌等競爭的結(jié)果[34]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠糞便菌群中具有β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶以及α-巖藻糖苷酶等與N-鏈寡糖降解有關(guān)的糖苷酶活性，能夠在體外條件下降解并利用HMN與BMN。此外，HMN與BMN的長期攝入不僅可以改變鼠腸道菌群的豐度和組成，而且不同源的N-鏈寡糖對于鼠腸道微生物的影響不同。本研究有利于進(jìn)一步了解人乳與牛乳N-鏈寡糖的在腸道菌群發(fā)展過程中所具有的生物學(xué)功能，可為未來牛乳嬰兒配方食品和功能性乳制品的開發(fā)提供一定的理論參考。